Summary
一个方法来加载脑室下区（SVZ）细胞中的钙离子指示剂染料记录活性钙。产后SVZ包括神经祖细胞和神经母细胞的细胞排列紧密。而不是使用清洗负载注入染料内的组织可以更好的染料扩散的压力。
Abstract
脑室下区（SVZ）是在出生后的大脑的神经区域之一。 SVZ密密麻麻的细胞，包括神经祖细胞与星形胶质细胞的功能（SVZ星形胶质细胞），神经母细胞和中间祖细胞。出生在SVZ的神经母细胞切向迁移到嗅球，它们分化成的interneurons很大的距离。细胞间粘附分子和扩散信号的信号通过发挥着重要的作用，在控制神经发生。许多这些信号触发内和细胞间的信息发送的胞内钙离子活性。钙活性因此反射的活性的胞外信号，是一个最佳的方式来理解SVZ的细胞的功能之间的细胞间信号。
其他许多地区和类型的细胞，包括成熟的星形胶质细胞和神经元钙活动进行了研究。然而，传统的方法来加载，D细胞与钙指示剂染料（ 即浴加载）的效率不高在加载所有SVZ的细胞类型。事实上，细胞密度在SVZ排除内部的组织的染料扩散。此外，制备矢状切片，将更好地保留SVZ的细胞，特别是流延髓尾轴上的成神经细胞迁移的三维配置的。
在这里，我们描述的方法来准备矢状部分包含SVZ，装载的SVZ细胞与钙离子指示剂染料，收购活性钙与时间推移电影。我们使用荧光凌晨4点染料加载SVZ星形胶质细胞内组织施加压力。使用扫描共聚焦显微镜，让一个精确的分辨率为区分单个细胞钙活动的记录。我们的方法是适用于包括成人海马颗粒下层和胚胎神经源性区域的其他神经性区。此外，其他类型的染料可以使用所描述的方法被应用。
Protocol
1。制备的解决方案，夹层，Vibratome的
- 解，必须在正确的渗透压和pH值（ 表1）制备。人工脑脊液（ACSF）相比，剥离溶液与较低浓度的钠和钙，和更高浓度的镁制备。这是为了最大限度地减少在切割时的兴奋性毒性的影响。
- 是饱和的夹层和学联解决方案都必须用95％O 2/5％CO 2鼓泡至少10分钟，以达到所需的pH值7.3。
- 准备一盘冰浴中。在冰浴中放置一个夹层板，并填写解剖的解决方案。泡沫夹层板。
- 准备的vibratome通过创建在冰浴中。将切片菜，在冰浴，填补了菜与，解剖的解决方案，和泡沫。
- 填充片室学联和气泡，以确保该解决方案充分曝气，无论片被放置的位置。
2。去除脑组织
急性的大脑切片往往是健康与年轻小鼠。在啮齿类动物中产后SVZ的细胞结构是成熟的周围日龄（P）20 1。因此，我们试图限制我们的实验小鼠岁的P20-P30，但我们已经进行了成功的实验小鼠旧如旧3个月。在整个处理的组织，必须注意尽量减少机械运动和压力的大脑，保持冷却的条件下，暴露在SVZ尽快解决以下牺牲。
- 注射戊巴比妥钠后，鼠标迅速断头。被删除的皮毛，并切口是通过颅底。的头部，然后放置在填充夹层溶液的托盘。
- 在稳定钳头，连续切削的周围的头骨，有时可达中线力显微镜issors。要小心，尽量减少接触的组织。在嗅球是从SVZ的新生神经元的最终目的地，必须注意维护该地区，尤其是在这个地区周围的骨切除。 Microscissor削减周围的颅骨背侧，允许容易拆除的头骨。
- 现在，除去覆盖在大脑颅骨分离从下方大脑的骨头。如果在上一步中作出正确的削减，可以轻易删除此覆骨钳或镊子。
- 虽然仍保持头用钳子，一个可以使用的外科刀片干净地除去几件之前的脑组织切片，如以下。一个冠状切口可以在水平的lambda。矢状削减可以作出的大脑的SVZ外侧的两侧上。一个保守的估计，从中线〜2.5毫米。如果需要的话，还可以被切成两半大脑这里。这些削减都会使几itate安装该组织，并允许更快地达到的SVZ脑切片时。重要的是要记住，施加少量的机械力对大脑的（ 如不推或拉）。
3。急性脑片的制备
- 为了准备随后的步骤，确保用于安装的超级胶水组织是免费的木屐和准备申请的vibratome板。重要的是要尽可能快而不损坏大脑。
- 从下面，从底层骨组织分离，同时分离神经的脑组织，然后可以挖出。
- 该组织被安装和胶合板并和对上vibratome下的。由于喙尾解剖的SVZ，我们一直专注于矢状切片，因为它保留的神经母细胞的迁移途径，胶质鞘，血管，主要是在这个方向对齐。可以个月UNT的组织在中线或创建的使矢状削减的SVZ外侧的平坦表面上。一个可选的步骤，是将3％的琼脂糖块后面的组织，作为叶片的抵接片脱落。我们优先使用氰基丙烯酸酯为基础的超级胶水。
- 刀片，用乙醇冲洗，以除去油，并用蒸馏水冲洗。将刀片上的刀片保持器。的刀座的vibratome的安装。
- 调整vibratome设置切割组织，每片的厚度为250-350微米。重要的是要使用高频振动和低速切割。
- 逐步穿过组织节。在嗅球的外观是一个很好的指标，一个是附近的SVZ最外侧的切片将不含有地区在矢状切片。寻找其他地标包括之下的SVZ位于胼胝体，脑室和浓缩。 SVZ将首先出现在多个横向sagitTAL片。 RMS将显示在内侧矢状切片。
- 删除片含有SVZ用塑料巴斯德吸管尖端切断。转移的切片保持腔。我们经常会得到更多的片比，我们可以在一天的工作。然而，切片会有所不同的量的细胞中含有的SVZ。它有时是必要寻找通过几个切片找到一个想要的用于成像。
4。的显微镜和染料的制备
片需要一个小时的孵育时间学联恢复的解剖和切片。在这片恢复期间，可以进行几个步骤。
- 移液管的制备钙染料和/或药物的应用
- 玻璃移液管需要有2-3微米直径的前端的长度（约2毫米）和角度（〜16°，当吸液管保持器），以防止与灌注室接触的前端，并允许用于放置的房间的目标。
- 通常，人们可以制备6-8压力移液器的每一天的实验。
- 钙染料的制备
- 当制备的工作溶液（4-5μM由浴，250μM的压力的应用程序），它最好是暴露的最小量的DMSO的细胞。可以实现这一点，通过使高度集中的股票。例如，对于型Fluo-4，一管含有50μg每天使用。一个可以让本等分试样的10mM库存通过加入4.6微升的Pluronic F-127的20％的DMSO溶液。
- 准备显微镜设置（ 图2）。
- 使用蠕动泵解决方案流有助于降低图像漂移。运行蠕动泵，以允许前学联通过灌注线运行，并确保它是无气泡。
- 设置管灌注室入口，并确保没有泄漏。
- 真空尖端的位置为ens尤尔溶液被吸入从灌注室。确保它是在一个适当的水平，使该计划的目的是沉浸在适当的工作距离，但没有那么高，这样的解决方案可能会蔓延室。低水平的解决方案也将减少流量的扭曲。一个恒定的愿望，也可以验证通过监听稳定性。
5。染料吸附量
此方法已被详细描述，在另一原稿2。请见图其中。
- 巴斯样染料
- 做成1-2毫升的染料的工作溶液。对于氟上午04时，浓度为4-5μM是足够的标签SVZ神经母细胞。
- 先转移到一个35毫米培养皿中的一个网底，已经充满学联片。更换由使用3毫升塑料移液管轻轻取出学联的解决方案，同时增加的calcium染料的解决方案。
- 在37℃下孵育30-60分钟，在5％CO 2气体的受控环境。
- 将切片成为学联填充的控股室，还没有进入细胞的染料洗去。或者，可以把它直接在显微镜灌注室运行学联。清洗周期是30-45分钟。
- 切片转移到灌注室。
- 压力的染料中的应用
- 从室内转移切片，在显微镜下设置的灌注室。
- 填充玻璃吸管与工作解决方案，为250微米，地方上的显微操作。
- 放下移液器感兴趣的区域。可以放置吸移管的前端可以是几微米以上的片表面或埋几微米以下的片表面，但远离记录区。的移液管的角度没有AFFE克拉的装载效率。当拍摄的片表面之下，我们发现，将吸头的成像平面以下我们所期望的更好的成像面积将标签。
- 当压力施加染料，的Picospritzer设置，以便它是<3 psi的。我们没有预计染料扩散的体积的，因为这是受变异性吸液管尖端直径，施加压力和密度的组织处的染料注入。我们采用简单的，直到我们达到我们想要的负载评估的眼睛。切片损坏最小化，在应用过程中，尤其是当切片表面的前端的下方放置。申请1-2分钟。根据标签的眼睛评估，有时重复的应用程序是必要的。对于这个浓度和应用的持续时间，我们发现，表面的染料中的应用优先标记的神经母细胞，而在地表以下应用程序优先标记星形胶质细胞。然而，> 3分钟在500μM中的应用也将标记成神经细胞无论是否尖端的上方或下方的片表面（JC Platel，未发表的观察）。允许恢复为30-45分钟洗净，切片。
6。共焦成像的活性钙
- 查找感兴趣的区域先用一个低功耗的诸如4倍或10倍的目标。放置在中心的字段，然后再切换到更高的功率目标。在这一点上，人们可以评估一般切片微分干涉相差（DIC）下注意到SVZ细胞的外观的健康。健康的细胞呈圆形和丰满。此外，健康的细胞显示微弱的荧光-4，应该全部或明亮的荧光（死细胞）在无负载的负载。
- 降低水浸入到感兴趣的区域上的目标，这是现在加载染料。 40倍或60倍的目标已经足够满足我们的需要，，虽然40X提供了一个更宽广的视野，并允许更大的吸管访问。当成像低于表面上，我们经常去片表面的3维结构和细胞的健康更好地保留至少15微米以下。
- 验证灌注和真空胜任工作。
- 设置在显微镜，这样的时间推移的分辨率和空间分辨率被设置为所需的速率。共聚焦显微镜，这些因素必须被平衡，作为时间分辨率的增加通常导致空间分辨率的损失，由于系统的扫描性质。活性钙，我们拍摄512x512像素的分辨率大约每秒一帧。如果单独收购的多渠道是必要的，这也将影响采集速率。设置电影的持续时间（2-10分钟）。
- 启动运行。如果要进行药理研究，洗的拮抗剂或非脱敏激动剂的的至少5-10分钟，然后再作5-10分钟的电影。可能脱敏受体的激动剂可以敏锐地施加，例如通过使用某essure显微操作所控制的移液管。
7。钙分析
分析如下标准程序，我们描述了在透水出版物2-4。 F 0（ 即基线）和F是测得的平均荧光强度分别在整个感兴趣区中的所有的区域，并在每个ROI，。荧光的变化在被认为是如果它是> 15％，F / F 0增加的Ca 2 +增加。计算细胞内Ca 2 +的变化使用Calsignal 5。
8。代表性的成果
我们已经能够获得选择性加载SVZ细胞根据上述和其他地方2-4,6染料加载协议。浴加载中Fluo-4 AM（4-5或250μM），标签主要是神经母细胞在切片表面施加压力。虽然压力应用程序可以加载neurob持续更迅速地比浴加载在一个单一的片，清洗负载可以同时加载多个切片。 （1）确认身份的标记细胞神经母细胞是否显示4,7迁徙行为，（2）它们的形态，SULFORHODAMINE 101（3）染色阴性，星形胶质细胞的特定的染料3或（4）阳性DCX-红色荧光蛋白表达（JC Platel，未发表的观察）。成神经细胞迅速转移（平均为60微米/小时）在生理温度下4,7-9中 ，但它们的移动，可以容易地观察到，即使在室温下。运动神经母细胞并不构成一个问题，关于将地区的利益（投资回报率），因为我们的电影通常持续时间短，跟踪活性钙。然而，在漫长的等待期，如在药液的交流中，研究者必须小心，以配合在控制和治疗期间的投资回报率。这是不寻常的神经母细胞迁移进入或离开的我 maging场或焦平面。
压力中Fluo-4 AM（250μM）深成片和有限的时间（2分钟）优先标记SVZ星形胶质细胞。星形胶质细胞标记已被证实与SULFORHODAMINE 101的正面标签及其形态，尤其是存在对血管的预测和endfeet的的我们最近描述3。使用这些方法，我们观察到自发活动的SVZ神经细胞和星形胶质细胞的人口（ 图1）。星形胶质细胞的活动往往需要从事血管3波的形式。此外，使用钙成像的分析，药理激动剂的应用已发现或确认表达的GABA 受体对成神经细胞和神经胶质细胞6，AMPA受体和NMDA受体在神经母细胞4。
图
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图1。在星形胶质细胞活性钙传播。（A）代表平均时间的推移图像记录活性钙。星形胶质细胞在SVZ加载中Fluo-4的应用与压力是深成片的。电影被收购在0.75的时候步骤。感兴趣区（ROI）被放置在细胞活动。 （B）从感兴趣区的轨迹放置在细胞从（A）中所示的电影。过滤的移动平均线和标准化的痕迹。的垂直刻度表示2×ΔF/ F 0其中F是信号强度，和F 0是平均基线信号和ΔF= FF 0。
图2。照片灌注系统的管的一端被浸没在95％O 2/5％CO 2气体对erfused的解决方案。由蠕动泵（未示出），然后将溶液通过管和浴室灌注。的另一端被插入到安装在一个平台上的浴室的溶液入口。的诉求尖端，然后连接到该室的溶液出口和设置在一定的水平，以确定溶液高度。从电源插座中，抽吸尖端连接到真空管线，该抽吸从腔室到废物容器中的溶液。的灌注系统显示，视觉清晰度的显微镜载物台。
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Discussion
SVZ细胞钙成像已被用于研究在神经母细胞10，在两个4,6,8成神经细胞和神经胶质细胞和星形胶质细胞的钙波3受体通道表达的自发活动模式。由于在SVZ细胞是未成熟或有胶质属性，它们不火动作电位11,12，也就是说毫秒表示成熟的网络中的活动的电压电势的变化是不适用的在这个区域。因此，捕捉速度较慢的钙事件（以秒计）不仅是生物学意义的，但也许是最相关的活动形式，在这些细胞中。
调查员必须考虑到在此过程中的许多步骤，特别是关于片健康。不正确地制定解决方案，水质差的（用来制作解决方案），慢和不准确的解剖和使用肮脏的剃须刀片切割组织都可以产生有害的效应fects活动。
的钙指标的使用方面，我们只讨论使用氟-4AM，我们已经尝试过其他的商业染料，包括俄勒冈绿BAPTA-AM，其中有一个较高的基准负荷水平比FLUO-4。我们选择FLUO-4，因为其更大的动态范围相比其他染料，但，其他研究者可能会发现不同的染料有利于自己的目的。每个染料可用于某些类型的细胞有不同的亲和力。浓度和加载方法，可能需要进行调整，为每个染料。我们优先使用压力加载标记SVZ星形胶质细胞和健康，更深入的细胞。的财务需要考虑的因素是施加压力，使用更昂贵的比沐浴应用，虽然可以冻结和重复使用的染料溶液中的压力吸管第二天。或者，基因编码的钙的指标（GECIS），，如GCaMP3，已日益流行的研究的其他系统和胸罩在地区13,14。这些GECIS有细胞特异性的启动子下被驱动的优点，但它们的动力学和动态范围一般不优于有机染料15。他们还需要在出生后SVZ病毒的结构，后者限制的神经母细胞的研究，在新生儿时期，由于质粒在细胞分裂过程中损失的标签或电。
存续期间的电影片漂移防止可靠的信号采集，是一个最具挑战性的技术障碍，活脑片成像实验。它是由几个因素，包括灌注率，真空放置，目标重量，以及，如果适用的话，温度梯度的影响。如果温度高于25°C是必要的实验，试图在最低温度下加热解决方案和灌注室，在那里他们可以解决他们的问题，因为温度可能会导致显著，Undesired焦点漂移。目的加热器和加热罩还可以帮助减少这种影响，虽然我们已经没有太多的成功尝试了前者。
除了这些技术障碍，研究人员分析了大量的细胞在出生后发展地区的机会。这提供了机会，以解决活动的人口水平，这可能会产生新的见解调节神经发生过程。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由美国国立卫生研究院（DC007681 AB），CT干细胞（AB）资助，：帕蒂基金会（AB），博士前露丝属Kirschstein国家研究服务奖（NRSA），（SZY），和NSF研究所的研究补助奖学金（BL）。 ，我们感谢Bordey实验室的手稿上了宝贵的意见。本发明的材料是基于部分由康涅狄格州康涅狄格州干细胞研究资助计划下的工作。它的内容是完全的责任作者，并不一定代表官方意见的康涅狄格州，康涅狄格州或CT创新国家公共卫生部，注册成立。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
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References
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