Summary
Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.
Abstract
Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyinde iki nörojenik bölgelerinin biri. SVZ astrositik özellikleri (SVZ astrositler denir), nöroblast, orta ve progenitör hücreler ile nöral progenitör hücreler gibi yoğun dolu hücreleri içerir. SVZ doğumlu nöroblast teğet onlar internöron içine ayırt koku ampul, büyük bir mesafe göç. Adezyon molekülleri ve difüze sinyalleri aracılığıyla intraselüler sinyalizasyon kontrol nöron önemli roller oynamaktadır. Bu sinyallerin çoğu hücreleri içinde ve arasında bilgi aktaran hücreiçi kalsiyum etkinliği tetikleyebilir. Kalsiyum faaliyet dışı sinyallerin faaliyet böylece yansıtıcı ve SVZ hücreler arasındaki fonksiyonel hücrelerarası sinyallerini anlamak için optimal bir yoldur.
Kalsiyum aktivite olgun astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere diğer birçok bölge ve hücre tipleri, çalışılmıştır. Ancak, loa için geleneksel yöntemkalsiyum gösterge boyası (yani banyo yükleme) ile d hücreleri tüm SVZ hücre tipleri yükleme at verimli değildi. Gerçekten de, SVZ de hücresel yoğunluk doku içinde yayılma boya engellemektedir. Buna ek olarak, daha iyi sagital dilimleri hazırlamak özellikle SVZ hücreleri, rostral-kaudal eksen üzerinde neuroblast göç akış üç-boyutlu düzenlemeleri koruyacaktır.
Burada, SVZ, kalsiyum göstergesi boya ile SVZ hücrelerin yükleme ve zaman atlamalı filmleri ile kalsiyum faaliyet edinimi içeren sagital kesitler hazırlamak için yöntemler tarif. Biz kullanılan Fluo-4 doku içindeki basınç uygulamasını kullanarak SVZ astrositler yüklenmesi için boya AM. Kalsiyum etkinlik ayırt tek tek hücreler için kesin bir çözüm sağlayan bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak kaydedildi. Bizim yaklaşım erişkin hipokampal subgranular dilimi ve embriyonik nörojenik bölgeleri dahil olmak üzere diğer nörojenik bölgeleri için geçerlidir. Buna ek olarak, boyalar, diğer tip olabilirTarif edilen yöntem kullanılarak yapılabilir.
Protocol
1. Çözümler, Diseksiyon ve Vibratome hazırlanması
- Çözümler Doğru osmolarite ve pH (Tablo 1) de hazır olmalıdır. Suni serebrospinal sıvı (ACSF) ile karşılaştırıldığında, diseksiyon çözeltisi, sodyum ve kalsiyum daha düşük konsantrasyonlarda, ve magnezyum daha yüksek konsantrasyonları ile hazırlanır. Bu dilimleme sırasında eksitotoksisite etkilerini en aza indirmektir.
- Hem disseksiyon ve ACSF çözüm% 95 O2 /% 5 7.3, istenen pH değerinin elde edilmesi için, en azından 10 dakika için gazı ile CO2. Ile doygun hale getirilir
- Bir tepsi içinde bir buz banyosu ile hazırlayın. Buz banyosunda bir diseksiyon plakası yerleştirin ve diseksiyon çözeltisi ile doldurun. Balon diseksiyonu plaka.
- , Bir buz banyosu oluşturarak vibratome hazırlayın. Buz banyosu içinde kesit çanak yerleştirin, disseksiyon çözelti ve balon ile çanak doldurun.
- Bu çözümü sağlamak için ACSF ve kabarcık ile oda tutarak dilim doldurun yeterince bağımsız havalandırılmaktadırdilimleri yerleştirilir nerede.
2. Beyin Dokusu giderimi
Akut beyin dilimleri genç fareler ile sağlıklı olma eğilimindedirler. Kemirgenlerde postnatal SVZ hücresel mimarisi postnatal günde (P) 20 1 civarında olgun. Bu nedenle, P20-P30 fare yaşları bizim deneyler sınırlamak için deneyin ama biz 3 ay kadar eski farelerde başarılı deneyler yapmışlardır. Doku taşıma boyunca, bir, mekanik hareketleri ve beyne basınç minimize soğutmalı koşullarda muhafaza ve çözümü mümkün olduğu kadar çabuk şu kurban SVZ maruz dikkatli olmalıdır.
- Pentobarbital enjeksiyonundan sonra, fare hızla dekapite edilir. Kürk çıkarılır ve kesiler kafatası tabanı ile yapılır. Kafa sonra diseksiyon çözeltisi ile doldurulmuş bir tepsi içine yerleştirilir.
- Forseps ile kafa stabilize ederken, sürekli kesik kafatası etrafında yapılır ve bazen Microsc ile orta hatta kadarissors. Doku ile temas en aza indirmek için dikkatli olun. Koku ampul SVZ gelen yenidoğan nöronların nihai hedef olduğundan, biri özellikle bu alanda çevresindeki kemik çıkarma işlemi sırasında, o bölgenin korunması dikkatli olmalıdır. Kafatasının çevresinde yapılan Microscissor kesim kafatası kolay çıkarılması için izin vermek için, dorsal tarafta olmalıdır.
- Örten beyin kafatası çıkarılması hemen altında beyin kemik ayrılır. Önceki adımda kesintileri doğru yapılırsa, bu üstteki kemik cımbız veya forseps ile kolayca temizlenebilir.
- Yine forseps ile kafa tutarken, bir temiz bir şekilde aşağıdakiler gibi, dilimleme önce beyin dokusu çeşitli parçaları ortadan kaldırmak için cerrahi bir bıçak kullanabilir. Koronal kesme lambda seviyesinde yapılabilir. Sagital kesim SVZ için yanal beynin her iki tarafına da yapılabilir. Bir tahminle orta hattan ~ 2,5 mm olacaktır. Eğer istenirse, beyin de burada hemisected edilebilir. Bu kesikler hem facil olacakdoku montaj itate ve beyin dilimleme SVZ daha hızlı bir şekilde ulaşılır izin verir. Bu beyin (örneğin itme veya çekme değil) mekanik güçlerin az miktarda uygulamak için hatırlamak önemlidir.
3. Akut Beyin Dilim Hazırlama
- , Sonraki adımlar için hazırlamak doku monte etmek için kullanılan süper yapıştırıcı takunya ücretsiz ve vibratome plaka uygulamak için hazır olduğundan emin olmak için. Beynin zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı gitmek önemlidir.
- Beyin dokusu daha sonra aynı anda sinirler ayıran temel dokuların kemikten ayırır altından gelen scooped edilebilir.
- Doku ve monte edilmiş bir plaka üzerinde yapıştırılmış ve vibratome üzerinde yerleştirilir. SVZ ve rostral-kaudal anatomisi nedeniyle, biz nöroblast arasında göç yolu, glial kılıf ve büyük ölçüde bu yönde hizalanır damar korur gibi sagittal kesitler verme odaklanmıştır. Bir mo birini yapabilirsinizorta hattan veya SVZ lateral sagital kesimler tarafından oluşturulan düz bir yüzeye doku UNT. İsteğe bağlı adım dilimleri dökülmek olarak bıçak bir dayanak olarak hizmet dokusu arkasına% 3 agaroz blok yerleştirmektir. Biz tercihen siyanoakrilat tabanlı süper yapıştırıcı kullandı.
- Yağlar kaldırmak ve damıtılmış su ile durulama ile etanol ile bıçak durulayın. Bıçak tutucu üzerindeki bıçağı yerleştirin. Vibratome için bıçak tutucu monte edin.
- Dilim başına 250-350 mikron kalınlığında doku kesmek için vibratome ayarları yapın. Yüksek frekanslı titreşim ve düşük devir sayısı ile kesmek için önemlidir.
- Giderek dokusu ile Bölüm. Koku ampul görünümü biri en lateral dilimleri ne bölge içerecek şekilde sagital dilimleri SVZ yakın olduğunu iyi bir göstergedir. Aramak için diğer yerlerinden ventrikül ve SVZ bulunduğu altındaki korpus kallosum, kalınlaşması içerir. SVZ daha lateral sagit ilk görünecektirtal dilimleri. RMS medial sagittal kesitler gösterecektir.
- Ucu kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti ile SVZ içeren dilim çıkarın. Dilim tutma odasına aktarılması. Biz genellikle bir iş günü içinde kullanabileceğiniz daha dilimleri edinin. Bununla birlikte, dilimler SVZ içeren bir hücre miktarı değişecektir. Bu görüntüleme için istediğiniz birini bulmak için birkaç dilim bakmak bazen gereklidir.
4. Mikroskop ve Boyaların hazırlanması
Dilimleri diseksiyonu ve dilimleme kurtarmak için ACSF içinde bir saatlik inkübasyon süresi gerektirir. Birkaç adım bu dilim iyileşme döneminde yapılabilir.
- Kalsiyum boya ve / veya ilaç uygulama için pipet hazırlanması
- Cam pipetler çap ve bir ucu uzunluğu (~ 2 mm) ve perfüzyon odası ile temasını önler açısı (~ 16 ° pipet tutucu için) 2-3 mikron bir ipucu olması gerekir ve yerleştirme için oda verirobjektif.
- Bir tipik deney her gün için 6-8 basıncı pipetler hazırlayabilirsiniz.
- Kalsiyum boya hazırlanması
- Çalışma çözeltisi (banyo ile 4-5 uM, 250 uM basınç uygulama tarafından) hazırlarken, bu hücrelere DMSO minimum miktarda maruz en iyisidir. Bu, yüksek derecede konsantre stok yaparak elde edilebilir. Örneğin, Fluo-4 için, 50 mg ihtiva eden bir tüp gün başına kullanılır. Bir DMSO içinde Pluronic F-127% 20 çözelti 4.6 ul ilave edilerek bu kısım bir 10 mM stok yapabilir.
- Mikroskop kurulumu (Şekil 2) hazırlanması.
- Çözelti akışı için bir peristaltik bir pompa kullanımı görüntü kayma en aza yardımcı olmuştur. ACSF perfüzyon hatları üzerinden çalıştırmak ve kabarcık ücretsiz olmasını sağlamak için izin önce peristaltik pompa çalıştırın.
- Perfüzyon odasının üzerindeki borusunun girişine ayarlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak.
- Ens vakum ucu yerleştirinçözüm perfüzyon odasının aspire ediliyor ure. Bunun amacı uygun çalışma mesafe dalmış, ama böyle bu çözüm odasının üzerine dökmek olabilir çok yüksek değil, böylece yeterli düzeyde olduğundan emin olun. Çözüm düşük seviyede aynı zamanda akış bozulmaları en aza indirecektir. Bir sabit aspirasyon da istikrar için dinleyerek doğrulanabilir.
5. Boya Yükleme
Bu yöntem, bir el yazması 2'de detaylı olarak tarif edilmiştir. Buradaki rakamlar bakın.
- Banyo yükleme boya
- Boya bir 1-2 ml çalışma solüsyonu olun. AM Fluo-4 için, 4-5 uM bir konsantrasyonda SVZ nöroblast etiketleme için yeterli olmaktadır.
- Dilimler birinci önceden ACSF ile dolu bir alt kafes ile 35 mm kültür çanağı için transfer edilir. Aynı anda c ekleme sırasında, yavaşça ACSF çıkarmak için bir 3 ml'lik plastik transfer pipeti kullanarak, çözelti yerineKALSİYUM boya çözeltisi çalışıyor.
- % 5 CO 2 gazı kontrollü bir ortamda 30-60 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri girmedi boya uzak yıkamak için ACSF dolu tutarak odasına geri dilim yerleştirin. Alternatif olarak, bir ACSF çalıştıran mikroskop perfüzyon odasının doğrudan yerleştirebilirsiniz. Bu yıkama dönemi 30-45 dk.
- Perfüzyon odasına dilim aktarın.
- Boya basınç uygulaması
- Tutarak odasından mikroskop kurulum perfüzyon odasına dilim aktarın.
- Mikromanipülatör 250 uM ve yerinde bir çalışma solüsyonu bir cam pipet doldurun.
- Ilgi bölgeye pipet indirin. Pipet ucu uzağa kaydedilen bölgeden ya da kesit yüzeyinin altında birkaç mikrometre kesit yüzeyi üzerinde ya da birkaç mikrometre gömülü olduğunu, ancak bu gibi yerleştirilebilir. Pipet açısı affe vermedict yükleme verimliliği. Dilim yüzeyden görüntüleme, biz görüntüleme düzleminin altında pipet yerleştirmek iyi bizim istenen görüntüleme alanı etiketleyecektir bulduğunda.
- O <3 psi olacak şekilde baskı boya uygularken, Picospritzer ayarlayın. Bu pipet ucu çapı değişkenliğe tabidir, çünkü boya difüzyon hacmi tahmin değil, basınç uygulanır ve boya enjekte edilir doku yoğunluğu. Göz ile değerlendirilen bizim istenilen yükleniyor elde edene Biz sadece geçerlidir. Ucu dilim yüzeyinin altına yerleştirilir, özellikle uygulama sırasında dilim hasar en aza indirin. 1-2 dakika boyunca uygulayın. Bazen tekrarlanan uygulamalar göz tarafından değerlendirilen etiketleme bağlı gereklidir. Bu konsantrasyon ve uygulama süresi için, yüzey uygulaması aşağıda tercihen astrositler etiketler iken boya bu yüzey uygulaması tercihen nöroblast etiketler bulabilirsiniz. Ancak, 500 mcM az> 3 dk uygulama da nöroblast etiketleyecektirbakılmaksızın ucu yukarıda veya aşağıda dilim yüzey (JC Platel, yayınlanmamış gözlem) olup olmadığı. 30-45 dk yıkama ve dilim kurtarma için izin ver.
6. Kalsiyum Faaliyet Konfokal Görüntüleme
- Böyle 4x veya 10x gibi düşük bir güç amacı ile ilk faiz bölgesini bulun. Yüksek bir güç objektif geçmeden önce alanın ortasına yerleştirin. Bu noktada, bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) altında SVZ hücrelerin görünümünü belirterek genel dilim sağlığını ölçebiliriz. Sağlıklı hücreleri yuvarlak ve dolgun görünür. Tüm veya parlak floresan (ölmekte olan bir hücre) hiçbir yükleme gerekiyordu Buna ek olarak, sağlıklı hücreler soluk Fluo-4 yükleme gösterecektir.
- Ilgilenilen bölgenin üzerine su-immersiyon objektif indirin, şimdi hangi boya yüklü olduğunu. 40x Daha geniş bir görüş alanı sağlar ve daha pipet erişim sağlar rağmen 40x veya 60x objektif Ya, bizim ihtiyaçlarımız için yeterli olmuştur. Ne zaman aşağıda görüntülemeyüzeyi, sık sık 3-boyutlu mimari ve hücre sağlığı daha iyi korunur dilim yüzeyin altında en az 15 mikron gidin.
- Perfüzyon ve vakum yeterli çalıştığından emin olun.
- O zaman atlamalı çözünürlük ve uzaysal çözünürlüğü istenen oranları ayarlanır böylece mikroskop ayarlayın. Konfokal mikroskopi için, bu faktörler genellikle sistemin tarama doğası nedeniyle uzaysal çözünürlük kaybına neden zamansal çözünürlükte bir artış olarak dengeli olmalıdır. Kalsiyum etkinliği için, bir 512x512 piksel çözünürlüğe sahip yaklaşık her saniyede bir kare görüntülenmiş var. Ayrı olarak elde birden fazla kanal gerekli ise, bu aynı zamanda satın alma oranlarını etkileyecektir. Filmin süresi (2-10 dakika) ayarlayın.
- Çalıştırın başlatın. Farmakolojik çalışmaların icra ise, en azından 5-10 dakika için antagonistler veya agonistler olmayan desensitizasyon üzerinde yıkama, ve daha sonra 5-10 dakika arasında bir film yapmak. Reseptör agonistleri olabilir duyarsızlaştırmak akut bir PR kullanılarak gibi uygulanabilir,Bir mikromanipülatör tarafından kontrol pipet essure.
7. Kalsiyum Analiz
Analiz biz geçirgen yayınlarda 2-4 açıklanan standart prosedürleri izler. F 0 (yani temel) ve F faiz (ROI) bölgelerinin tüm boyunca ve her bir ROI ölçülen ortalama floresan yoğunlukları, sırasıyla. Floresans bir değişiklik bu F / F 0 artış>% 15 ise bir Ca 2 + artış olarak kabul edildi. Hücre içi Ca 2 + değişimleri Calsignal 5 kullanılarak hesaplanmıştır.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Biz yukarıda ve başka 2-4,6 açıklanan boya yükleme protokollerinde bağlı SVZ hücrelerin seçici yükleme elde etmek mümkün olmuştur. Çoğunlukla Fluo-4 AM (sırasıyla 4-5 veya 250 uM), etiket nöroblast dilim yüzeyinde Hamamı yükleme veya basınç uygulaması. Basınç uygulaması neurob yükleyebilirsiniz ikendaha hızlı tek bir dilim banyo yükleme uzun sürerse, banyo yükleme birden çok dilim aynı anda yüklenmesine olanak sağlar. Biz onlar göç davranışlarını 4,7, (2) bunların morfolojisi, sulforhodamine 101 (3) negatif boyanma, bir astrosit özel boya 3 veya (4) pozitif boyanma ile göstermek ister (1) tarafından nöroblast olarak etiketlenmiş hücrelerin kimliklerini doğrular DCX-DsRed ifade (JC Platel, yayınlanmamış gözlem). Nöroblast fizyolojik sıcaklıkta 4,7-9 da (60 um / saat arasında ortalama) hızlı bir geçiş, fakat kolayca hareket oda sıcaklığında dahi görülmektedir. Nöroblast hareketi bizim filmler tipik süresinin kısa olması nedeniyle bölge-faiz (ROI) kalsiyum etkinliği izlemek için yerleştirme açısından bir sorun teşkil etmez. Ancak, ilaç çözüm değişimleri sırasında gibi uzun bekleme süreleri sırasında, araştırmacılar kontrol ve tedavi dönemlerinde ROI'ler eşleştirmek için dikkatli olmak gerekir. Nöroblast içine veya i dışına göç için nadir değildir maging alan veya odak düzlemi.
Dilim içine ve sınırlı bir süre (<2 dak) için derin Fluo-4 AM (250 uM) basınç uygulaması tercihen SVZ astrositler 2 etiketler. Astrosit etiketleme özellikle biz son 3 anlattığımız kan damarları ile ilgili projeksiyonlar ve endfeet varlığı ile, sulforhodamine 101 ve morfolojisi ile pozitif etiketleme tarafından doğrulandı. Bu yöntemleri kullanarak, biz SVZ neuroblast ve astrosit nüfus (Şekil 1) hem de spontan aktivite gözlemledik. Astrositlerde faaliyeti genellikle damar 3 meşgul dalgalar halini alır. Ayrıca, bir test olarak kalsiyum görüntüleme kullanılarak, farmakolojik agonistleri uygulama ortaya ya da GABA ifade nöroblast 4 nöroblast ve astrositler 6 A reseptörleri ve AMPA reseptörleri NMDA teyit etmiştir.
Figürler
1 "src =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
Şekil 1. Astrositler kalsiyum aktivite Çoğaltım. (A) Temsilcisi kalsiyum aktivitesinin bir time-lapse kayıt gelen görüntüyü ortalama. SVZ içinde astrositler Fluo-4 basınç uygulaması ile yüklenen dilim derinliklerine AM. Filmler 0.75 s zaman aşamada elde edildi. Ilgi alanları (ROI) aktivitesi gösteren hücreleri üzerine yerleştirilir. (B) ROI'ler gelen izleri (A) tasvir film hücreleri üzerine yerleştirilir. İzler bir hareketli ortalama ve normalize ile filtre edildi. Dikey ölçek 2 temsil x hızındaki / F sinyal yoğunluğunu ve F 0 ortalama bazal sinyal ve hızındaki = FF 0 F 0.
Şekil 2. Perfüzyon sistemi Resim. Bir tüpün bir ucunun% 95 O2 /% 5 CO2 gaz-p battığındaerfused çözüm. Çözelti, daha sonra, bir peristaltik pompa (gösterilmemektedir) ile bir tüp ve banyo oda için perfüze edilmiştir. Diğer ucunda bir platform üzerine monte edilmiş küvet odasının giriş çözelti içine yerleştirilir. Aspirasyon ucu sonra odasının çözümü prizine bağlı ve çözüm yüksekliğini belirlemek için bir düzeyde ayarlanır. Çıkış itibaren, emme ucu odasından gelen bir atık kap içine çözelti vakum aspirasyon hattına bağlanır. Perfüzyon sistemi Görsel netlik için mikroskop sahneden gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SVZ hücrelerinin kalsiyum görüntüleme nöroblast 10, hem nöroblast ve astrositler 4,6,8 ve astrositik kalsiyum dalgalar 3 reseptör kanal ifadede spontan aktivitede desen çalışması için kullanılır olmuştur. SVZ hücreleri ya olgunlaşmamış veya glial özelliklere sahip olduklarından olgun ağlarındaki aktivite göstergesi gerilim potansiyeli milisaniyelik değişimler bu bölgede geçerli değildir, yani aksiyon potansiyelleri 11,12 kovmayın. Bu nedenle, yavaş kalsiyum olaylar (saniye mertebesinde) yakalama biyolojik olarak anlamlı değil sadece, ama belki de bu hücrelerde aktivitenin en alakalı formu.
Müfettişler özellikle dilim sağlığı açısından, bu prosedür birçok adım dikkatli olmalıdır. Çözümler yanlış verme, kötü su kalitesi (çözeltiler için kullanılır), yavaş ve özensiz diseksiyonu ve doku kesmek için kirli jilet kullanımı tüm zararlı ef olabiliraktivitesi üzerine sürdürdüğünü belirtti.
Biz sadece Fluo-4:00 kullanımı tartışılmıştır ise kalsiyum göstergelerinin kullanımı konusunda, ile, Fluo-4 daha yüksek bir başlangıç yükleme seviyesi vardır Oregon Yeşil BAPTA-AM, dahil diğer ticari boyalar, denedim. Diğer boyalar ile karşılaştırıldığında dinamik alanının büyüklüğü nedeniyle Biz Fluo-4 odaklanmak için seçti, ama diğer araştırmacılar kendi amaçları için farklı boyalar avantajlı bulabilirsiniz. Her boya belirli hücre türleri için farklı benzerlik olabilir. Yükleme Konsantrasyon ve yöntem her boya için ayarlanması gerekebilir. Biz tercihen SVZ astrositler ve sağlıklı, derindeki hücreler etiketlemek için yükleme basıncı kullanılır. Dikkate alınması gereken bir faktördür mali basınç pipet içinde boya çözeltisi dondurulur ve ertesi gün yeniden kullanılabilir ancak basınç uygulama kullanılarak, banyo uygulaması daha pahalı olmasıdır. Alternatif olarak, örneğin GCaMP3 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS), diğer sistemler ve sutyen incelemek için giderek daha popüler olmuşturbölgelerde 13,14 olarak. Bu GeCIS hücre-spesifik arttırıcılar altında tahrik olma avantajı var, ama onların kinetik ve dinamik aralık genellikle organik boyalar 15 daha iyi değildir. Postnatal SVZ Onların kullanımı da yapı viral etiketleme veya elektroporasyon, hücre bölünmesi sırasında plazmid kaybı nedeniyle neonatal döneme nöroblast çalışma sınırlayan ikinci gerektirir.
Dilim sürüklenme film süresince güvenilir sinyal toplama önler ve beyin dilim canlı görüntüleme deneyleri ile en zorlu teknik zorluklardan biridir. Perfüzyon oranı, vakum yerleştirme, objektif ağırlığı, ve, varsa, sıcaklık değişimleri gibi çeşitli faktörler tarafından etkilenir. Eğer 25 daha fazla sıcaklık ° C sıcaklıklarda önemli yol açabilir beri onların soruları nerede deneyler için, bir u, düşük sıcaklıkta çözümleri ve perfüzyon odaları ısıtmak için çalışmalıdır gereklindesired odak kayması. Biz çok başarı olmadan eski çalışmış olmama rağmen Amaç ısıtıcıları ve ısıtmalı muhafazaları da, bu etkiyi en aza indirmeye yardımcı olabilir.
Bu teknik engellerin Engelleme, araştırmacılar deneyi sonrası gelişen bölgenin hücrelerinin çok sayıda fırsat var. Bu nöron düzenleyen süreçler de yeni ufuklar getirebilimektedir, bir nüfus düzeyde aktivite hitap etme fırsatı sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (DC007681, AB), CT Kök Hücre hibe (AB), Pardee vakıf (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülleri (NRSA) (SZY) ve NSF Lisansüstü Araştırma hibeleri ile desteklenen Bursu (BL). Biz el yazması üzerinde faydalı yorumları için Bordey laboratuar üyelerine teşekkür. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Devlet tarafından desteklenen çalışma dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut Devlet'in resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
