Summary
Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.
Abstract
X-ışını kristalografisi proteinlerin yapı daha detaylı bilgi elde etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tür çalışmalar yapı / fonksiyon ilişkisinde detaylı bilgilere elde etmek ileri biyokimyasal analizler ile tamamlanması gerekir. Oligonükleotid ve gen sentez teknolojisindeki gelişmeler, her 19 diğer amino asitler ile hedef artıkların ikame dahil olmak üzere, artan bir şekilde uygulanabilir büyük ölçekli mutajenez stratejileri, olun. Kazanç veya kayıp fonksiyon-fenotipleri sonra bu katalitik aktivitesi, protein stabilitesi ve / veya protein-protein etkileşimleri özgüllük özellikle kalıntı katkısı olarak, sistematik sonuçlar çıkarılabilir sağlar.
Mutasyonun doğası farklı fenotipleri atfetmek için - ziyade dalgalı deneysel koşullara - bunun kontrollü ve tekrarlanabilir bir şekilde protein arındırmak ve analiz etmek hayati önem taşımaktadır. Yüksek verim stratejileri ve manuel protokolleri otomasyonrobotik sıvı işleme platformları az insan müdahalesi ve minimal hata oranları 1-5 ile böyle karmaşık moleküler biyolojik işlemleri gerçekleştirmek için fırsatlar yarattık.
Burada, yüksek verimli bir şekilde His-etiketli rekombinant protein arıtma için genel bir yöntem sunulmaktadır. Yeni bir çalışmada, biz TFIIB ayrıntılı bir yapı-fonksiyon soruşturma, bazal transkripsiyon makine bileşeni için bu yöntem uygulanır. TFIIB in vitro transkripsiyon promotör-yönlendirilmiş için vazgeçilmez ve bir preinitiation 6-8 kompleks haline RNA polimeraz alımı için gerekli olmasıdır. TFIIB RNA polimeraz 9-11 yarık aktif sitesine nüfuz eden esnek bir bağlayıcı alanı içerir. Bu, bağlayıcı alan TFIIB, yani (i) transkript inisiyasyon 'prematüre' aşamasında katalitik aktivitesinin uyarılması üzerinde iki biyokimyasal olarak ölçülebilir etkinlikler confers, ve (ii) bir ek katkı4,5,12 kompleks preinitiation içine RNA polimeraz spesifik işe. Biz TFIIB linker içerisinde tek, çift ve üçlü ikamesi ve silme mutasyon oluşturmak için ve sonradan RNA polimeraz 4 katalitik aktivitesi üzerine stimülasyon etkisi için fonksiyonel testler bunları analiz etmek için yüksek verimli arıtma yöntemi kullandı. Toplamda, üretilen, saflaştırılmış ve 381 mutantlar analiz - elle gerçekleştirmek için zaman alıcı ve zahmetli olurdu bir görev. Ürettiğimiz ve bize herhangi bir deneysel varyasyonları takdir izin ve bize bizim sonuçların tekrarlanabilirliği net bir fikir verdi multiplicates içinde proteinlerin ölçüldü.
Bu yöntem, His-etiketli proteinlerin saflaştırılması için bir genel protokol görevi görür ve başarılı bir diğer Rekombinant proteinlerin saflaştırılması için kullanılmıştır. Bu, şu anda 24 proteinlerin saflaştırılması için optimize edilir, ancak en fazla 96 proteinleri saflaştırmak için adapte edilebilir.
Protocol
BÖLÜM A: bakteri kültürlerinin Yüksek throughput büyüme.
1. 24 oyuklu plakalar kullanılarak Autoinduction Orta 2 ml gecelik bakteri üremesine
- Mikrodalga ile 24 oyuklu plakalar sterilize edin.
- Taze yetişen bakteri kolonilerinin veya dondurulmuş gliserol stokları ile autoinduction orta (Gecelik Express Orta) 1.5 ml inoküle edin. Biz normalde üç ayrı klonlanmış kolonileri ile mutant başına üç kuyu aşılamak. Pozitif ve negatif kontroller için Rezerv altı kuyu. Pozitif kontrol için biz üç yabani-tip klonlar büyümek ve negatif kontroller için biz olmayan bir ifade plazmid ile transforme edilmiştir 2 klonlar büyüyorlar. Orta sadece kontrol için de boş bir bırakarak plaka yeterli sterilizasyon için kontrol edin.
- 37, 18 saat süreyle hücrelerinin büyümesini ° C ve 250 rpm'de sallama. Biz lac-indüklenebilir BL21 (DE3) Rosetta 2 hücreleri kullanır. Autoinduction orta glikoz ve laktoz bir karışımını içerir. Başlangıçta bakteriAyrıca, rekombinant proteinlerin ekspresyonuna sebep olur, laktoz, kullanmaya başlamadan sonra glikoz ile beslenirler ve.
- Kapağını kaldırın ve robotik platformu üzerinde plakası yerleştirin.
BÖLÜM B: rekombinant proteinlerin Robotik saflaştırılması.
2. Robotik Platform hazırlayın
20 mM imidazol içeren tampon yıkama makyaj,% 0.1 Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-asetat, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 mM ZnOAc 2,% 10 gliserol, ve elüsyon tampon oluşan 0.5 M imidazol,% 0.1 Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-asetat, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 mM ZnOAc 2,% 10 gliserol. Bu arabellekleri etiketli proteinler onlara bağlı edildikten sonra boncuklar yıkamak için, ya da sırasıyla, boncuklar proteinleri elüt edilmesi için kullanılır.
- Bakteriyel seyreltici (15 ul köpürmeye reaktifi ile 100 ml saf su) Makyaj. Bu çözelti kullanılacaktıroptik yoğunluk (A600) ölçümleri için bakteriyel gecede kültürlerin dilüsyonları yapmak. Seyreltici olarak köpük önleyici varlığı plaka okuyucu ölçümleri ile engel hava kabarcığı oluşumunu engeller.
- 10x Fastbreak reaktif, numune başına 2 ul Lysonase ve 15 mM MgOAc 2 oluşan lizis çözüm Makyaj. Fastbreak bakteriyel hücre duvarları yıkmak ve hücre içi proteinlerin salınımını kolaylaştırmak deterjan ve tuz karışımını içerir. Lysonase lizozim ve nükleaz tescilli bir karışımıdır. Lizozim hücre duvarı kesintiye asist ve nükleaz yayımlanan bakteriyel nükleik asitler sindirir.
- İsteğe bağlı: 6 M guanidin hidroklorür solüsyonu Makyaj. Bazı rekombinant proteinler Teflon kaplı pipetleme iğne sopa eğilimindedir. Guanidin hidroklorür solüsyonu yıkılır proteinler ve rutin olarak her st sonra yıkanabilir robotik pipetleme ipuçları durulama için kullanılan sudan daha etkili bir şekilde kapalı yıkarep.
- Karıştırma bicinchoninic asit çözeltisi (reaktif A) ve bakır sülfat çözeltisi (reaktif B) ile BCA (bicinchoninic asit) protein miktarının reaktif hazırlanması: Peptid bağların + BCA reaktif içinde mevcut CuSO 4 bileşeninden Cu 1 ila Cu2 + vasıtasıyla azaltmak Cu 1 + miktarı çözeltisi içinde mevcut peptit bağlarının sayısı ile orantılıdır. İkinci adımda, bicinchoninic asit şelat Cu 1 iki molekül + mor renk elde edilir, 562 nm Absorbans vardiya sonuçlanan. Renkli reaksiyon süresi bağlıdır ve genellikle kesin olması için birkaç saat gerekir. Daha sonra renk birkaç saat boyunca stabildir.
- Sağ boyutu olukları veya plakaları doldurun ve robotik platformu öncesi tahsis durumlara sokar.
- Guanidin hidroklorür atık için yer bir 24 plaka, OD 600 ve absorbans ölçümleri ve bir mavi 96-th için plaka için iki net 96-kuyucuğuE platformda konumlarını proteinler saflaştırılmış. Manyetik stand biri 96-derin kuyu plaka yerleştirin.
- MagneHis seyreltin Ni-parçacıklar oluşturarak proteinleri bağlamak distile su içinde 5 kat ve boncuk-karıştırma ünitesi içine doldurmak onların His-etiketleri ile şelatları. Süspansiyon boncuk tutmak için karıştırıcı açın.
- Robot platformu açın ve aksi pipetleme doğruluğu engel olacak hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç dakika için pipetleme iğneler yıkayın. Yeniden kullanılabilir pipetleme iğneler bireysel pipetleme adımlar arasında temizlendi. Alternatif olarak, tek kullanımlık uçları kullanılabilir. Tüm takip eden adımlar robot tarafından yapılmaktadır. Robotik protokol istek üzerine mevcuttur.
3. Hücre Büyümesi OD600 Ölçme tarafından İşaretli
- Gece boyunca kültür 10 ml seyreltici çözelti 90 ul içinde seyreltilir.
- Bakterilerin benzer yoğunlukları büyüdü sağlamak için OD 600 ölçün(Şekil 1).
4. Hücreler Proteinler bırakın ve bekleyin kadar Broken olan Boncuk bağlayıcı
- Ni-manyetik boncuk süspansiyonu 100 ul, ikinci bir 24 oyuklu plakanın her oyuğuna dağıtılır.
- Her bir küçük ölçekli bakteri kültürü 900 ul boncukları ihtiva eden 24 oyuklu plaka içine aktarılır. 10x Fastbreak / Lysonase karışımı 100 ul ekleyin.
- 24 oyuklu plaka, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hızlı bir sallama (800 rpm) için sallama platforma aktarılır. Bakteriyel hücre duvarları mekanik kuvvetler ve kimyasal eylem ve Birleştirilerek üretilen proteinlerin çözelti içine salınır kombinasyonu ile bozulur. Afiniteleriydi etiketler ile hemen paramanyetik şelatlama nikel boncuk bağlamak.
5. Boncuk Yıkanmış edilir
- Yeniden süspanse manyetik boncuklar içeren hücre lizatları m olan bir ayak üzerinde konumlandırılmış bir 96-derin kuyu plakası aktarılıragnetic çubuklar bu kuyular arasındaki slayt. 96 oyuklu plakalar süpernatan daha kolay çıkarılması sağlayan bir kare koni-şekilli alt var. Kuyuları 2,1 ml kadar hacimleri tutabilir ama çok küçük miktarlar ile doldurulur. Bu bizi sıçratarak örnek çapraz kontaminasyon olmadan dinç sallayarak adımları gerçekleştirmenizi sağlar.
- Pipet uçları 6 M guanidin-HCl ile bireysel pipetleme adımlar arasında yıkanır. Bu adım çapraz bulaşmayı önlemek için TFIIB ve diğer "yapışkan" proteinlerin saflaştırılması için çok önemlidir. Diğer proteinler sayesinde pipetleme adımlar arasındaki su ile yoğun iğneler durulama için yeterli olabilir.
- Manyetik stand manyetik çubuklar, paramanyetik boncuk çekmek kuyuların merkezlerinden uzağa çekerek ve pipetleme iğneler süpernatant ücretsiz erişim sağlar. Süpernatan atılır.
- Yıkama tamponu 500 ul önce 24 oyuklu plakaya ilave edildi ve daha sonra e göre 96-kuyucuklu plakaya aktarılırboncuk tam transfer nsure. 24 oyuklu plaka çalkalayıcısı kaldırılır.
- Yıkama tamponu diğer bir 500 ul 96-kuyulu plaka üzerine direkt olarak ilave edilir, plaka çalkalayıcı aktarılır ve 1 dakika süreyle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Plaka manyetik stant geri taşındı ve yıkama tamponu atılır.
- Bu basamak iki kere tekrarlanır ve yıkama işlemini levha herhangi bir tampon kalıntıları çıkarılarak tamamlanır.
6. Seyreltme Tampon maddesi olarak Proteinler elute
- Elüsyon tampon 100 ul boncuklar ilave edilir, plaka çalkalayıcı taşınır ve kuvvetli bir şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalanır.
- Plaka saflaştırılmış rekombinant proteini içeren, çalkalayıcı ve elüsyon için geri hareket eder, yeni bir plaka için transfer edilir.
7. Saflaştırılmış Proteinlerin konsantrasyonları ölçün
- BCA reaktif karışımı 190 ul açık bir 96-kuyucuklu plakaya aktarılır ve pro 10 ul olduğuTein çözeltisi eklenmiştir.
- İnkübasyon (genellikle 5-6 veya gece) birkaç saat sonra, absorbans ölçmek ve saflaştırılmış protein preparatları (Şekil 2) her konsantrasyonlarını belirlemek için BSA standartları ile karşılaştırın.
- Saflaştırılmış proteinler şu anda uygun konsantrasyonları (Şekil 3) aşağı uygulamalar için de kullanılabilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Arıtma protokolü, iki kalite kontrol aşamaları, gösterilmektedir ki örneklerini sunmaktadır. Biz saflaştırılmış protein verimleri (Şekil 2) değerlendirilmesi üzerine bakteriyel büyüme evresi (Şekil 1) ve daha sonra olası sorunları belirlemek ve belgelemek için edebiliyoruz. Biz genellikle protein arındırmak ve üç nüsha halinde onları test. Bu, iki kalite kontrol aşamaları ile birlikte, bizi bizim fonksiyonel deneylerde gözlenen herhangi bir değişiklik mutant phenotyp bağlı olduğu güven verirE (Şekil 3) ve denemedeki varyasyonları veya başarısız arındırmalardan kaynaklanır. Verimi 50-200 mikrogram, tipik aralığı elde edilir ve çeşitli fonksiyonel testler için yeterli daha vardır.
Şekil 1. Gecede kültürleri ile 24 kuyulu plakanın OD ölçümlerin Histogram. Yanı sıra yabani-tip TFIIB itibaren altı TFIIB mutant varyantları Üç klonları büyümüş edilmiştir. Orta olmayan bir ifade plazmid ve iyi taşıyan iki klonları sadece negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. OD ölçümleri bireysel kültürler arasındaki büyüme oranlarındaki küçük farklılıklar olduğunu göstermektedir.
Şekil 2. Bir BCA yöntemi ile belirlenir ve SDS PAGE tarafından onaylandıktan bu kültürlerden elde edilen protein verimleri. Çeşitlerinden biri yüksek seviyelerde eksprese edilmez. Com olarakŞekil 1 ile kombi, bu diferansiyel hücre büyümesi nedeniyle değildi ama nedeniyle protein ekspresyonu düzgün indüklenen olmamak sonucuna varabiliriz.
Şekil 3,. Bir transkripsiyon tahlilin Örnek sonucudur. Bu RNAP göre küçük başarısız transkript üretimi üzerinde TFIIB türevleri uyarılması etkinliği ölçülmüştür. Burada, TFIIB kalıntı K87 arasında tek bir amino asit ikamesine, tam bir kütüphane uyarma etkileri gösterilmiştir. Tekrarlanabilirliği yüksek derecede küçük hata oranları ile teyit edilir. Yabani-tip (wt), negatif kontrol (NC) ve elüsyon tampon ile karşılaştırıldığında üç mutantların performansını gösteren bir örnek jel sadece kontrol altında tasvir edilmiştir.
Discussion
Burada açıklanan otomatik bir rekombinant protein saflaştırma yöntemi, en az bir insan müdahalesi ile büyük ölçüde yeniden üretilebilir koşullar altında küçük çaplı bir biçimde mutant proteinlerin bir çok sayıda üretim ve arıtma sağlar. Şekiller 1 ve sistematik bir kalite kontrol ve örnekleri 2 kez sonuç proteinler saflaştırılmıştır. Şekil 3, bu örnekte kullanılan saflaştırılmış transkripsiyon faktörleri işlevsel tahlillerde bir çok tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştiren.
Işlem arkeal TFIIB saflaştırılması için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu yakınlık-etiketli proteinlerin saflaştırılması için yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu tür otomatikleştirilmiş arıtma protokolü kullanımı böylece önemli ölçüde rekombinant proteinlerin biyokimyasal analiz kolaylaştıracak ve böylece el ile elde etmek zordur, bir ölçek üzerinde protein-protein etkileşimleri anlaşılmasında daha fazla olacaktır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma ROJW yanında a Wellcome Projesi Hibe (078043/Z/05/Z) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C.
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
