Summary
En kombinatorisk funktionell screening metod för att få inblick i konsekvenserna av den molekylära sammansättningen av mikromiljöer på cellulära funktioner beskrivs. Metoden utnyttjar befintliga microarray-baserade tekniker för att generera matriser av definierade kombinatoriska mikromiljöer som stöder cellvidhäftning och funktionell analys.
Abstract
Samspelet mellan celler och deras omgivning mikromiljö har funktionella konsekvenser för cellulär beteende. På den enda cellnivå, kan distinkta mikromiljöer införa differentiering, migration och fenotyper spridning och på vävnadsnivå mikromiljön processer så komplicerat som morfogenes och tumorigenes 1. Inte bara cellen och molekylära innehåll mikromiljöer påverkar cellerna i, men det gör elasticiteten 2 och geometri 3 av vävnaden. Definieras som summan av cell-cell,-ECM och-lösliga interaktioner faktor, förutom fysiska egenskaper, är mikromiljön komplex. De fenotyper av celler inom en vävnad är delvis på grund av deras genomiska innehåll och delvis på grund av de kombinatoriska interaktioner med microenviroment. En stor utmaning är att koppla specifika kombinationer av microenvironmental komponenter med distinkta beteenden.
ENT "> Här presenterar vi mikromiljön microarray (MEArray) plattform för cellbaserad funktionell screening av interaktioner med kombinatoriska mikromiljöer 4. Metoden möjliggör samtidig styrning av molekylära sammansättning och elasticitetsmodul, och kombinerar användandet av allmänt tillgängliga microarray och micropatterning teknik. MEArray skärmar kräver så få som 10.000 celler per matris, vilket underlättar funktionella studier av sällsynta celltyper som vuxna stamceller. En begränsning av tekniken är att hela vävnad mikromiljöer kan inte helt rekapituleras på MEArrays. Men jämförelse av svar i samma celltyp till många relaterade mikromiljöer, t.ex. parvisa kombinationer av ECM-proteiner som kännetecknar en viss vävnad, kommer att ge insikter i hur microenvironmental komponenter framkallar vävnadsspecifika funktionella fenotyper.MEArrays kan skrivas ut med ett brett utbud av rekombinant growth faktorer, cytokiner, och renade ECM proteiner, och kombinationer därav. Plattformen är begränsad endast av tillgängligheten av specifika reagens. MEArrays är mottagliga för tiden löpt analys, men oftast används för analyser slutpunkt cellulära funktioner som är mätbara med fluorescerande prober. Till exempel är DNA-syntes, apoptos, förvärv av differentierade tillstånd, eller produktion av specifika genprodukter vanligen mäts. Kortfattat är det grundläggande flödet av en MEArray experiment för att förbereda bilder belagda med utskrift substrat och förbereda befälhavaren plattan av proteiner som ska skrivas ut. Sedan arrayer är tryckta med en microarray robot celler får fästa, växa i kultur, och sedan är kemiskt fixeras vid uppnående den experimentella slutpunkt. Fluorescerande eller kolorimetriska analyser, avbildas med traditionella mikroskop eller skannrar microarray, används för att avslöja relevanta molekylära och cellulära fenotyper (figur 1).
Protocol
1. Utskrift substrat Förberedelse
Beslutet att använda polydimetylsiloxan (PDMS)-belagda eller polyakrylamid (PA)-belagda objektglas beror på de viktiga parametrarna för experimentell design. Elasticitetsmodulen av båda polymererna kan avstämmas för att efterlikna styvheten hos olika vävnader genom att förändra basen / härdningsförhållandet av PDMS, och akrylamid / bis-akrylamid-förhållande av PA. PDMS kan härma styvare vävnader i intervallet 1-10MPa (t.ex. brosk, hornhinna, och arteriella väggar), och PA kan härma mjukare vävnader i intervallet 100Pa-100kPa (t.ex. bröst, hjärna, lever, och prostata) 5. PDMS är billig, lätt att förbereda, och geometrin av de tryckta funktioner kommer att vara identisk med chefen för utskrift stift. Således storleken och formen av funktionerna kan styras exakt med stift med olika geometrier spets. PDMS är mer hydrofob än PA, vilket orsakar vissa problem under cellens hantering och immunoslande steg, och kan vara oförenliga med vissa cellinjer. Eftersom PA är en hydrogel och en infödd icke-fouling yta kommer celler fäster endast platser där det finns proteiner som stöder cellvidhäftning. Geometrin för de tryckta funktioner på PA geler inte exakt följer geometri knappnålshuvud, vanligtvis blir de cirklar på grund av diffusion, oavsett knappnålshuvud geometri som används. Skriva kontakttid och Kolvbultsdiameter parametrar kan bestämmas empiriskt för optimal funktion storleken på PA geler.
Polydimetylsiloxan (PDMS)
- I en engångs plastmugg kombinera Sylgard 184 bas silikonelastomer med härdaren vid ett 10:01-förhållande, blanda kraftigt med en trä eller plast tungspatel avluftas i rumstemperatur vakuum klocka i 30 min.
- Centrum en standard objektglas på vakuum aktiverade chuck med spinnbeläggarens, sedan duggregn 0,5 ml av den blandade polymeren elasten på mitten av glidytan. Snurra vid6.000 rpm under 60 sek.
- Härda de PDMS-belagda objektglas i en 70 ° C ugn eller på en digital värmeplatta (skyddat från damm) under 4 h till över natten.
- Härdade diabilder kan användas direkt eller lagras i flera månader i en bild låda som är förseglad i en plast plastpåse och förvaras i en låda. PDMS drar till sig damm så det måste vara väl skyddade från rum luftcirkulation.
- Obs: Nitril eller andra icke-latexhandskar måste användas vid arbete med PDMS elastomer kit. Tillfällig kontakt med latexhandskar kommer att hämma PDMS polymerisation.
Polyakrylamid (PA)
- NaOH etsning: Placera glasen på värmeblock vid 80 ° C. Tillsätt 1 ml 0,1 N NaOH på varje bild, och se till att täcka hela glidytan. Låt NaOH avdunsta (en vit film bör bildas på glidytan). Eftersom PA gelen kan bara bifoga stadigt på NaOH etsade ytor kommer PA gelen lossnar under uttorkning steg om hela bilden surfaAce omfattas inte av NaOH. Om glidytan inte helt täckt, upprepa genom att tillsätta 1 ml 0,1 N NaOH. Objektglasen kan sedan lagras vid rumstemperatur (RT) under flera dagar. Obs: Ett alternativ till NaOH etsning är att ozon-eller plasma-rengör bilderna.
- 3-aminopropyltrietoxisilan (APES) beläggning: I ett dragskåp bilder plats i en 15 ml skål, och tillsätt 300 pl APES på varje NaOH etsad bild. Låt aporna reagerar med NaOH glider i 5 min. Överskrider denna tid kommer att orsaka svårigheter att tvätta ut oreagerad APES reagens. Skölj APES noggrant med avjoniserat vatten 2:58 gånger på båda sidor av bilderna. Om tvätten inte är komplett kommer APES att oxideras genom Glutaraldehyd att bilda en brun beläggning på bilder i steg 1,8.
- Glutaraldehyd oxidation: Sug alla lösningar från glidytorna. I varje 15 cm skål, tillsätt 25 ml 0,5% glutaraldehyd i PBS. Reagera under 30 min i ett mörkt område. Efter 30 minuter, aspirera alla glutaraldehyd och använda icke-lint arbetskraftatory våtservetter (t.ex. Kimwipes) att noggrant torka bilderna. Objektglasen kan sedan lagras vid rumstemperatur under upp till en dag.
- Gelpreparat: Efter beredning PA blandningar, inklusive akrylamid, bis-akrylamid och DDH 2 O i enlighet med tabellen nedan, avgasa under 30 minuter, och sedan placera PA blandningar på is för att bromsa polymerisation. Lägg APS och TEMED och blanda väl rätt innan gelerna. Pipettera PA blandningar på glidytorna och plats 24 mm x 50 mm, nummer 1 täckglas ovanpå PA. Undvik att trycka täckglas och objektglas tillsammans och undvika bubbelbildning. För geler> 40.000 Pa använda 100 ^, för andra geler används 350 ul.
| Önskade modulen (Pa) | Akrylamid% | Bis-akrylamid% | Akrylamid från 40% lager (ml) | Bis-akrylamid från 2% lager (ml) | Avjoniserat vatten (ml) | APS (il) | TEMED (il) |
| 480 ± 160 3 | 0,06 | 0,75 | 0,3 | 8,95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0,15 | 1,25 | 0,75 | 8 | 100 | 10 |
| 40.400 ± 2390 | 8 | 0,48 | 2 | 2,4 | 5,6 | 100 | 10 |
Anpassad från 6,7.
- Låt PA gelen polymeriseras under 2 timmar och ta sedan bort täckglas i avjoniserat vatten.
- Tvätta PA gel bilder i stora Coplan burkar i vatten över natten (~ 8 timmar) för att avlägsna oreagerade akrylamid.
- Torra bilder i en 37 ° C ugn i 2-4 timmar eller tills PA gel härdar helt.
- PA gel-bilderna kan lagras vid 4 ° C under en månad i en förseglad låda bild.
2. Protein masterplatta Beredning
- Alla proteiner should kan alikvoteras i lager av 10X lösningar inom buffertar som rekommenderas av leverantören och förvaras vid -80 ° C. De flesta ECM-proteiner är lösliga i avjoniserat vatten, men pH-värdet kan behöva justeras med droppar ättiksyra. De flesta tillväxtfaktorer, cytokiner, och rekombinanta receptor extracellulära domänerna framställs i PBS med BSA, men tillverkarens betingelser varierar. Filtrera protein portioner genom ett 0,45 um 4-mm nylon sprutfilter (Nalgene) före lagring.
- Utforma en master platta i enlighet med önskat protein kombinationer och utspädningar. Vidhäftande celler förlitar vanligtvis på närvaron av åtminstone en kompatibel ECM att förmedla celladhesion, men antikroppar mot epitoper på cellytan kan också mediera fastsättning ibland. Det är en bra idé att lägga fri FITC färgämne eller en fluorphore-konjugerad protein minst en väl så att arrayer kan lätt orienteras senare.
- Förbered befälhavaren plattan genom att späda proteinet kombinationer med tryck buffert bestående av 100 mMTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5,2. Typiskt varje brunn i en 384-brunnars platta innehåller inte mer än 10 | il.
- Anteckna innehållet i varje brunn i varje mästare plattan i en tabbavgränsad databas fil och ge varje mästare platta med ett unikt identifikationsnummer. Ett sexsiffrigt datum följt av formgivarens initialer tjänar ofta syftet (MMDDYYinitial). Eftersom brunnsvolymer är små, kan protein alikvoter användas effektivt för att generera ett stort antal parallella plattor. Det rekommenderas att befälhavaren plattorna lagras vid -80 ° C och varje masterplatta bör genomgå högst två frysnings-upptiningscykler.
3. MEArray utskrift
- MEArrays kan skrivas med de flesta konventionella robotar microarray utskrift. Quill pin skrivare som använder antingen silikon eller rostfritt stift stål fungerar bra, men protein viskositet kan vara problematiskt. Kapillära skrivare är idealiska microarray utskrift robotar för denna applikation, eftersom de arbetarVäl med viskösa proteinlösningar.
- För att uppnå god statistisk kraft i en array, är 10 till 12 likadana fläckar av varje mikromiljö rekommenderas. En sådan konstruktion kommer möjliggöra jämförelser av aktivitet i en mikromiljö förhållande till en annan i samma array med enkla t-test. Dunnette test kan användas för att jämföra aktiviteten i en kontroll miljö med andra mikromiljöer. Denna konstruktion fungerar bäst när en funktionell fenotyp har associerats med kontroll mikromiljö innan du utför MEArray experiment.
- Luftfuktighet bör upprätthållas runt 50%. Fuktreglering är viktigt eftersom en låg fuktighet kan torka lösningen inuti stiften eller i brunnarna i master plattan orsakar ineffektiv avsättning på utskrift substrat. Fuktighet kan styras effektivt genom drapering roboten med icke-porös plastfolie och användning av både en luftfuktare och en de-luftfuktare för att bibehålla 50% fuktighet. Kylda utskrift plattens kan useful för att bevara vissa proteiner, men försiktighet måste vidtas för att undvika kondens på bilderna.
- Varje tryckt matris bör märkas med frys-bevis objektglasetiketter kodade med ett serienummer som består av befälhavaren plattans identifierare följt av ett tresiffrigt nummer (MMDDYYinitial-nnn). Eftersom varje rad används eller distribueras ska uppgifter om deras experimentella behandlingar hållas i en databas. Spårning datum för utskrift och antalet frys-tö cykler av befälhavaren plattorna kommer att bidra till att identifiera de optimala förutsättningarna för att upprätthålla reproducerbarhet.
- Tryckta MEArrays bör förvaras i förseglade slide lådor vid -20 ° C i högst en månad. Reproducerbarhet minskar märkbart därefter.
4. Odling däggdjursceller på MEArrays för funktionell analys
- Bifoga kultur kammare: att begränsa volymen av media och antal celler krävs kulturen på MEArrays, är en plast kammare fitted att omge den tryckta arrayen. För många arrayer, kan en enda kammare från en 2-kammare slid (Nunc) som innehåller ett område av 4,2 cm 2 användas. Ta kamrarna från den tillverkade kammaren bilden och skär kamrarna i halv med ett rakblad. Använd en 3 ml spruta för att applicera en tunn sträng av akvarium silikon (DAP) till kanten av en kammare och tryck på ytan av en MEArray. Undvik att placera tillämpas kammarens akvarium silikon på array funktioner.
- Blockering och sköljning: MEArrays måste vara väl sköljas för att avlägsna oreagerade monomerer, vilka kan vara toxiska för celler. Om PDMS-belagda objektglas användes, då regionerna mellan de tryckta funktioner måste först blockeras med ett icke-påväxt beläggning för att förhindra celladhesion, inkubera uppsättningarna i 1% Pluronic F108 (BASF) i vatten eller 2% BSA i vatten under 15 minuter under vakuum. PA gel bilder kräver inte en blockerande steg. I samtliga fall, skölj arrayer med cellodlingsmedia tre gånger under fem minuter (medierna val berorpå de använda cellerna, men användning av antibiotika rekommenderas oavsett media eller celler). PA geler kräver ytterligare 30 min inkubation i media för att rehydrera gelen.
- Cellvidhäftning: Fyra till fem arrayer kan passa inuti en enda 15 cm steril petriskål. Täck Petri-skål med ett lock för att hålla uppsättningarna steril. Tillsätt hälften av den slutliga medievolym till MEArray genom tillsats av cellerna i media till en slutlig koncentration av 10.000 till 1.000.000 celler / ml. Celler kommer att fästa till de tryckta På olika beroende på sammansättningen av den tryckta mikromiljön. Kontrollera om enhetlig infästning genom att visa arrayer genom ett omvänt fas mikroskop i 15 till 20 minuters intervall. Genom att försiktigt skaka MEArrays och tillbaka, kan celler knutna på ett mönstrat sätt skiljas från de flytande, obundna celler.
- Avlägsnande av obundna celler: på PA-belagda MEArrays, kan de obundna cellerna aspireras och media kan ersättas med en lämplig volym. På PDMS-belagda MEArrays, kan mediet vara aldrig helt avlägsnas från brunnen eftersom cellerna torka ut och dö nästan omedelbart. Således på PDMS-belagda MEArrays måste obundna celler avlägsnas genom en process av successiva utbyten av halva volymen av media tills alla obundna celler avlägsnas, såsom bestäms genom mikroskopisk inspektion. Den de-vätande effekt PDMS är mindre framträdande när serum-innehållande medium används jämfört med definierade media, och när BSA användes för att blockera de otryckta områdena jämfört med Pluronics F108.
- Celler kan odlas på MEArrays placeras inuti 15 cm petriskålar under många dagar med normala media förändras. Media förändringar på PDMS bilder måste göras med successiva förändringar av halva medievolymen.
- Vanliga fixeringsmedel såsom paraformaldehyd och metanol / aceton, är kompatibla med MEArray system. När färgade celler om PA-belagda MEArrays, kan fixativ tillsättas och tvättas bort precis som de skulle vara i en konventionell färgningsproceduren.Men när färgade celler på PDMS-belagda MEArrays, måste ytan vara våt även under fixeringen. Sug hälften av media och ersätta med ett fixativ. Upprepa processen några gånger tills väl är fylld med en majoritet av fixativ. Efter fixering, är fixativet gradvis ersätts på samma sätt med blockerande buffert som är lämplig för nästa steg i analysen.
- Immunofärgning används vanligen för att analysera cellulära funktioner. Staining rutiner varierar, men när man arbetar på PDMS MEArrays, behöver man utföra alla tvätt och aspiration steg som ovan, förändras gradvis lösningarna och aldrig låta ytan att de-vått. De-vätning kommer att orsaka artefakter i färgning.
- Kamrarna kan tas bort med hjälp av ett rakblad. Täckglas kan monteras på toppen av färgade MEArrays använder Fluoromount-G (Southern Biotech). Detektion kan utföras med de flesta multicolor fluorescens microarray skannrar eller konfokala mikroskop med motoriseradekaklade bildupptagning lägen.
5. Representativa resultat
Ett exempel på mönstrade protein avlagring på en tryckt PDMS-ligamatcherna MEArray hjälp av en kvadratisk spets kisel stift på en hylsa stift microarray-tryckning roboten visas i figur 2. Deponering av olika proteiner som är tryckta kan verifieras genom immunofluorescens med användning av antikroppar (Figur 2A). Utspädningar av proteinlösningarna i master plattan är reflekterande av den mängd (fluorescensintensitet) som är avsatt på skrivarapparaten substrat ytan (Figur 2B). Celler bör fästa de tryckta funktioner i ett mönstrat uppenbar sätt (figur 2C).
Ett exempel på en MEArray experiment som visar att omvända utspädningar av två mikromiljö proteiner framkallade specifika profiler keratin uttryck i en proteinkoncentration-beroende sätt i en human multipotent bröstepitelialceller progenitor cellinje (D920-celler), visas i figur 3. Bubble tomter är användbara för att avgöra om specifika fenotyper införs på celler på upprepade funktioner i en spädningsserie. Till exempel, om en speciell molekyl i en mikromiljö orsakar en distinkt fenotyp, när instruktiv komponenten har spätts tillräckligt i en bakgrund av en neutral ECM fenotypen bör förändras eller försvinna. Immunofluorescens detektering av keratin 8 och keratin 14 mellanliggande proteiner filament utfördes med en Axon 4200a (Molecular Devices) microarray scanner. Tolv replikat spädningsserier trycktes på varje MEArray och log 2 förhållandet av keratin 8 till keratin 14 innebär fluorescensintensitet grafiskt som en bubbla komplott för att ge en realistisk bild av variation och reproducerbarhet av signalen. Visas är data från en MEArray som fastställdes efter celler hade fast och obundna celler tvättades bort (Figur 3A), och efter 24 timmar av kulture (Figur 3B). För denna relativt lilla analys, gjordes en envägs ANOVA användes för att bestämma variansen från medelvärdet signalen vid varje tidpunkt, och grupperas två-tailed T-test användes för att bestämma huruvida de olika utspädningar av typ I kollagen och rekombinant humant P- cadherin orsakade förändringar i keratin uttryck. Det fanns ingen variation från medelvärdet bland celler på de funktioner strax efter fastsättning, men det fanns stora skillnader i keratin uttryck bland celler efter 24 timmar av exponering för olika mikromiljöer. T-test kontrollerat att hög typ I kollagen koncentrationer framkallade högre keratin 8 uttryck, medan höga P-cadherin koncentrationer framkallade en stark keratin 14 signal efter 24 timmar. Detta resultat överensstämde med tidigare rapporter att P-cadherin-haltiga mikromiljöer kommer att införa på K14-uttryckande myoepithelial fenotyp på bi-potenta bröst stamceller 4.
Ett exempel på en hel scanned MEArray tryckt på en 40.000 Pa PA-gel visas i figur 4.
Figur 1. Ett flödesschema av MEArray förfarandet. Först är utskrift substrat framställs antingen med PDMS eller PA. Andra befälhavaren plattorna är förberedda och kommenteras i en databas. Det tredje är MEArrays ut och kodas med serienummer. Det fjärde är kultur kammare fästa, ytor block och / eller sköljas, då cellerna tillåts att fästa och obundna celler tvättas bort. Femte, kan celler behandlas med färgning eller bioanalys efter en inkubationsperiod baserad på experimentell design. Slutligen kan Bilder från MEArray erhållas och analyseras med lämplig scanner och programvara.
Figur 2. Deposition och relativ förekomst av tryckta proteiner kan verifieras med immunfärgning före cellvidhäftning. A) Antikroppar som erkänt typ IV kollagen och laminin-111 användes för att kontrollera deras närvaro i tryckta funktioner i en MEArray. B) Med användning av en genomsnittlig bildpunkt funktion intensitet analys i NIH ImageJ programvara, den relativa förekomsten av de två proteinerna över en serie av utspädningar, utgående från en 200 pg / ml proteinlösning, kan kvalitativt bedömas. C) Fas mikroskop av D920-celler bundna till fyrkantiga inslag i en tryckt PDMS-belagd MEArray.
Figur 3. Ett exempel på en MEArray analys med förändringar i keratin uttryck i en multipotent progenitorcell linje som en funktion av tid och mikromiljö. Varje bubbla representerar förhållandet mellan keratin 8 och keratin 14 proteinnivåer 10 till 15 celler anslutna till en FEAning i en MEArray. Expression bestämdes med immunofluorescerande prober. A) visar de förhållanden keratin i celler strax efter fastsättning, och B) visar de keratin nyckeltal efter 24 timmar på en array som plattades parallellt. Den maximala koncentrationen av båda proteinerna var 200 pg / ml och utspädd 2-faldigt. Diametern av en bubbla representerar storleken av log 2 förhållandet av keratin 8 och keratin 14 medelintensiteten, och den orange och vita färgkodning anger värden> 0 och <0, respektive. F-värden för envägs ANOVA och P-värden från T-test, och konsoler med pilar identifierar de jämförda populationer, visas.
Figur 4. Ett exempel på en MEArray Scan förvärvade med ett kaklat förvärv läge på en laserskanning konfokalmikroskop. HCC1569 celler vi fick under 4 h före fixering införliva DNA analoga edu.DAPI (blå) och Edu (röd) visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MEArray metoden som presenteras här ger funktionella analyser av cell-och kombinatoriska interaktioner mikromiljö 4. MEArray analys kombinerar användning av grundläggande micropatterning teknik, cellbiologi och microarray robotar utskrift och enheter analyser som finns i många flera användare anläggningar. MEArray skärmar är kompatibla med de flesta vidhäftande celltyper, fastän serumfria medier formuleringar kan behöva justeras i vissa fall inkludera BSA eller <1% serum, vilket kan förbättra fastsättning. Denna metod är begränsad genom tillgängligheten av reagens för att analysera en given cellulär funktion, fluorescens-baserade analyser är kompatibla med de flesta array-baserade bildsystem, men kolorimetriska analyser kan också fungera bra. Andra varianter av denna metod finns och stödja den allmänna idén att komplexa mikromiljöer funktionellt kan dissekeras att avslöja vilka roller de enskilda mikromiljö molekyler och kombinationer av dessa spelar i olika cell funktionningar 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
ML stöds av NIA (R00AG033176 och R01AG040081) och laboratoriet Riktat forskning och utveckling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
