Summary
Etkileşimleri ve hücre içi bir ortam içinde antikorların varlığı ile ilgili moleküler mekanizmalar üzerinde etkisi incelemek için hızlı bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntem, bir lipid formülasyonu dayanan bir kovalent olmayan kompleks oluşumu kullanılarak canlı hücreler içine transfekte antikor içerir. Bu teknik, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürleri ve primer hücreler için uyarlanabilir.
Abstract
Antikorlar canlı sistemlerde meydana gelen çeşitli olaylar içine roman fikir edinmek için yeteneği sağlar. Hedef proteinlere yüksek oranda spesifik antikorlar üretmek için yeteneği ele alınması gereken çok hassas biyolojik soruları için izin verdi. Önemlisi, antikorlar sistemik lupus eritematozus (SLE), romatoid artrit (RA), paraneoplastik sendromlar, multipl skleroz (MS) ve insan T-lenfotropik virüsü tip 1 (HTLV-1) de dahil olmak üzere insan hastalıklarının bir dizi patogenezinde oylandı myelopati / tropikal spastik paraparezi (HAM / TSP) 1-9 ilişkilidir. Antikorları hastalığın soruşturma alanıdır ve veri antikorlar ve enflamasyon çeşitli intrasellüler moleküllerin sonuçlar arasındaki etkileşimler, hücresel mesajlaşma ve apoptoz 10 değişmiş olduğunu göstermektedir neden nasıl. MS HAM ve / TSP olan hastalarda hücre içi RNA bağlayıcı protein heterojen ribonuclear protein antikorları üretmek için gösterilmiştir A05-07 Ocak (hnRNP A1) 3, 9, 11. Son veriler içi nöronal ve yüzey antijenleri hem antikor patojenik 3, 5-9, 11 olduğunu göstermektedir. Böylece hücre içi antikor çalışması için izin veren bir prosedür: protein etkileşimleri hastalığı patogenezinde büyük fikir ödünç verirdim.
Genler genellikle birincil hücreler ve kültür hücre hatları transfekte edilir, hücre içine antikorların Ancak transfeksiyon antikor yapısı veya kötü transfeksiyon verimliliği 12 değiştirilmesi engellendi. Transfeksiyondan diğer yöntemler, katyonik lipozomlar (DOTAP / DOPE) ve destek polyethylenimines (PEI) göre antikor transfeksiyonu içerir; kontroller ile karşılaştırıldığında, 12 antikor transfeksiyon içinde bir on-kat azalmaya yol, her ikisi de. Bu çalışmada gerçekleştirilen yöntem katyonik lipid-aracılı yöntemler ile benzerdir ve yoluyla antikorları ile kovalent olmayan kompleks oluşturmak için bir lipid bazlı mekanizmasını kullanır elektrostatik ve hidrophobic etkileşimleri 13. Biz non-kovalent elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla antikor yakalama ve hücrelerin içinde onları sunma yeteneğine bir lipid formülasyonu Ab-deliverin reaktifi kullanılmıştır. Böylece kimyasal ve genetik bağlantıları canlı hücrelerin içine fonksiyonel antikorlar teslimatı için gerekli değildir. Protein etkileşimleri 9: Bu yöntem, bize çeşitli antikor proteini yerelleştirme deneyler, hem de hücre içi antikor moleküler sonuçlarının analiz izleme ve gerçekleştirmek için sağladı.
Bu protokol, biz hızla çoğaltıcı ve transfeksiyon verimliliği yüksek derecede nöron içine antikorlar transfekte nasıl gösterecektir. Örnek olarak, anti-hnRNP A1 ve anti-IgG antikorları kullanır. Transfeksiyon etkililiği, kolay ölçülmesi için biz Atto-550-NHS ve FITC-etiketli IgG ile etiketli anti-hnRNP A1 antikorları kullanılmıştır. Atto550 NHS yüksek moleküler absorbsiyon ve kuantum yi yeni bir etiketsaha. Uyarma kaynağı ve Atto550 için floresan filtreleri Cy3 (Örn. 556 Em. 578) benzer. Buna ek olarak, yüksek Atto550 fotostabilite sahiptir. FITC-etiketli IgG bu yöntem bağımlı boya çok yönlü ve olmadığını göstermek için bir kontrol olarak kullanıldı. Bu yaklaşım ve oluşturulan verilerin hedef antijenleri hücre içi antikorların insan hastalıklarının patogenezinde rolü olabileceği rolü anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Protocol
1. Antikor Etiketleme (Şekil 1)
- 0.1 M NaHCO3 tampon yapın:
- 8.4 g NaHCO 3
- 29.2 g NaCl
- 1 litre H2O
- Bu çözelti (10.6 gr Na 2 CO 3, 29.2 g NaCl, 1 litrelik 2 H 0) ile 8.4 arasında bir pH değerine tampon getirin.
- 70 ul anti-hnRNPA1 ve 500 ul NaHCO 3 tamponu ile 35 ul Atto550 NHS ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca döndürmek. Saat süren dönüş sonra bir diyalizer karışımı içine enjekte ve geceleme PBS 2 litre dialyze.
- Ertesi gün, bir spin kolon (Amicon Ultra 0.5) kullanarak anti-hnRNPA1 diyalizlenmiş Atto550 NHS konsantre.
- Atto550 NHS anti-hnRNPA1 antikor konsantre edilmiş etiketlenmiş sonra, nano-bırakma örnek konsantrasyonunun belirlenmesi.
2. Antikor Transfeksiyon (Şekil 2)
- Dulbecc Tohum 10 5 hücre / 500 içine ulönce transfeksiyon için 8 sıra slayt 24 saat içinde o Modifiye Kartal Orta (DMEM/F12 +10% FBS +1% antibiyotik). Hücre konfluense en az% 70 olması gerekir.
- Yirmi dört saat tohumlama sonra, bir Eppendorf tüp içine Ab-deliverin reaktifi 2 ul ekleyin.
- Sonra aynı Eppendorf tüp anti-hnRNPA1 antikoru etiketli Atto550 NHS 2 mikrogram (0.5 mikrogram / ul) ekleyin ve oda sıcaklığında 10-15 dk inkübe.
- İnkübasyon sırasında, medya aspire ve hücre taze DMEM ortam 394 ul ekleyin.
Not: bir kontrol olarak hareket etmek bakir hücrelerden birinin odasına 500 ul DMEM ekleyin.
- İnkübasyondan sonra, antikor karışımı, 100 ul DMEM eklemek için aşağı yukarı ve pipetleme ile karıştırmak, ve 500 ul toplam hacim için DMEM içinde hücrelere ilave edin.
- Antikor teslimat 48 saat sonra ortamı değiştirin.
Not: Protokol FITC pozitif kontrol olarak Rigg etiketli ile yinelenmiştir.
3. Verimlilik Belirlenir Canlı ve Sabit Görüntüleme
- Görüntü hücreler görüntü transfekte Atto550 NHS etiketli antikorlar bir floresan mikroskop Cy3 filtre kullanarak 48 saat canlı.
- Canlı görüntüleme tamamlandıktan sonra, medya ve düzeltme hücreleri aspire.
- Ortam aspire sonra, oda sıcaklığında 15 dakika için% 0.4 paraformaldehid ile hücrelerin tedavi. Hücreler 4 x 5 dk her PBS ile yıkayın. Sonra, DAPI reaktif ve düzeltme lamel içeren montaj medya ile hücreler monte. Axiovision yazılım ile sabit hücrelerin transfeksiyon etkinliği ölçün. Axiovision yazılımı taraftan değilse, sadece 3.7 'de hesaplama içine el ve fiş sonuçları ederek görüntü olayları saymak. Alternatif olarak, ImageJ yazılım Bu hesaplamalar için de kullanılabilir.
- Birincisi, 20x büyütmede seçtiğiniz görüntü hücrelerinin toplam sayısını saymak için "Olaylar" ölçümü kullanın.
- Sonraki değildi hücreleri saymak "Olaylar" ölçümü kullanınbaşarıyla aynı 20x büyütme görüntü antikorlar ile transfekte.
- Excel tarzı biçiminde ölçülen "Olaylar" a erişmek için, "Özellikler" üzerine tıklayın "Ölçüm" sekmesini tıklatın ve görüntülemek için tıklatın "Tablo gibi."
- Son olarak, iki önceden ölçülen olayları karşılaştırarak transfeksiyon verimliliği belirlemek için aşağıdaki hesaplamayı kullanın: ((Toplam hücreleri - Untransfected Hücreleri) / Toplam Hücreler) x 100 = Transfeksiyon Verimliliği.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Untransfected ve canlı görüntüleri (Şekil 3A) transfekte (Şekil 3B) nöronlar göre antikor etiketleme (her resimde kırmızı veya yeşil) açıkça hücreleri (Şekil 3B, C, D) içinde gözlenen olduğunu ortaya koymaktadır. Aspirasyon sonra ve antikorlar arasında veya hücre yüzeyine yapışık çıkarmak için ortam ile yıkama, etiketlenmiş antikor yine de nöron (Şekil 3C, D) içinde mevcut bulunmaktadır. Transfeksiyon verimliliği hesaplamak için başarıyla transfekte değildi hücrelere göre toplam hücreleri hesaplamak için Axiovision yazılımı kullanın. Bu değerler, toplam hücrelerin yüzdesi (Şekil 4) ve transfeksiyon etkinliğini elde etmek için bir transfeksiyon etkinliği formül girilmiştir.
Şekil 1. Atto 550 NHS ester ile etiket antikorlar için kullanılan prosedürleri akış şeması etiketli antikorlar konsantre için gerekli adımları izledi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Kültür canlı hücrelerin içine etiketli antikorlar transferinde kullanılan prosedürlerin Akış diyagramı.arge.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. Transfekte nöronlar 48 saat aşağıdaki transfeksiyon görüntüleri canlı.
Şekil 4,. Transfeksiyon etkinliği belirlemek için sayıldı olaylar ile Resimler sabit ve durulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özel moleküller ve bunların ekspresyon hipotezi test etmek için, genler ve diğer vektörler genel olarak hücre içine transfekte edilir. Bu işlemin özgün yönü kolaylıkla hedef hücre içine transfekte etmek için antikorlar yeteneğidir. Biz beş ayrı deneylerde çiftleri her bu yöntemi uygulandı. Transfeksiyon verimliliği sonuçları tüm deneyler arasında benzer olarak bulundu. Önemli olarak, yöntem, antikor yapısı veya fonksiyonu değiştirmeden hücre içine antikorların giriş sağlar. Ayrıca, canlı nöronlar floresan mikroskobu kullanımı ile, yaygın olarak% 55 oranında aştığı transfeksiyon etkinliği belirlemek mümkündür. Bu, bir ilgi ve onun hedef hücre içi antikor arasındaki etkileşimi ile doğrudan ilgili hipotezleri test etmeye imkan vermektedir. Burada çalışma olmamakla birlikte, Fab parçaları da kullanılabilir. Alternatif olarak, deneyler gibi inflamatuar sitokinler ekleme gibi kültür koşullarını değiştirmeden Expressi etkilemesi halinde incelemek dizayn edilebilirveya intrasellüler hedeflerin lokalizasyonu.
Antikorlar hücre içi antijenleri hedeflemek olabilir Nasıl soruşturma devam eden bir alandır. Hakim teorisi hücresel yaralanma sonrası, intraselüler antijenleri hedef antijene karşı antikor üretimi sağlayan adaptif immün yanıtı, maruz kaldığını gösterir. SLE hastalarında hnRNPs için antikor cevabı bu olasılığı ortaya nasıl bir örnektir. SLE hastalarında hnRNP P2 antikorlar yapmak ve bunu bir otoimmün yanıtı 14 oluşturmak için mevcut olduğu hedef hücrelerin apoptozu üzerinde, hnRNP P2 hücre yüzeyine taşınır. Bu da nörolojik hastalıklar gösterildi, hangi çalışmalar nöronların sadece yüzey antijenlerinin patojen otoimmün yanıtı 15, 16 hedef olabileceğini düşündürmektedir. Bu fikir şimdi zorlanmaktadır. İlginçtir, antikorlar bir epitopu özgü şekilde nöronlar girebilirsiniz düşündüren veriler artık yoktur. Örneğin, otoimmün retinopati, birnti-enolaz antikorlar nöronların nüfuz ve enolaz'ın işlevi, bir sitoplazmik glikolitik enzim 17 değiştirdi. Ayrıca, sert kişilik sendromu modelinde, anti-amphiphysin antikorları presinaptik işaretleri ve altere GABA sürümü 18 ile birlikte lokalize, in vivo nöron girdi. Bu nöronların eşsiz yapısı ve fonksiyonu ile ilgili olabilir. Otoimmün hastalık patogenezinde çalışılacak devam olarak, bu önemli sorunları gidermek Burada sunulduğu gibi çalışmalar iyi 9 anlaşılmaktadır.
hnRNP A1 intrasellüler antijen 5, 9'dur. Bu nedenle, bize anti-hnRNP A1 antikorlar nöronal disfonksiyonun katkıda bulunuyor olabilir olmadığını test etmek için izin verecek bir teknik gereklidir. HnRNP A1 otoantikorlar 5-7 MS ve HAM / TSP hasta 3, 9, 11 bulundu Çünkü, biz nöronlar içine anti-hnRNP A1 ve kontrol antikorları transfekte. Biz antikor hücreleri girdiğini doğruladı ve takipmikroarray analizleri (kontrol IgG ve denetimler gibi bakir nöronların her ikisini de kullanarak) böylece bu transfeksiyon anti-hnRNP A1 fonksiyonu 9 değiştirmemiştir teyit hnRNP A1 fonksiyonu ile ilişkili genlerin değiştirilmiş gösterdi. Önemlisi, daha mikroarray analizleri, spastinin, mutasyona uğramış bir genin değişmiş ifadesi ile anti-hnRNP A1 antikor yanıtı arasındaki ilişkiyi gösterdi MS ve HAM / TSP hastaların 9 klinik fenotip taklit eder. Bu antikor, transfeksiyon hücre içi hedefleri için antikorlar, hücresel işlevleri değiştirebilir olup olmadığını test etmek için kullanılabileceğini gösterir. Bu tür SLE, RA, ve kansere bağlı paraneoplastik sendromlar gibi diğer otoimmün hastalıkların bir dizi yarar vardır.
Özetle, güvenilir yaşayan hücrelerin içine antikorlar transferinde yeteneği antikor işlevi, antikor soruları sormak için fırsat sağlar:. Normal ve hastalık koşullarında hücreleri içinde hedef etkileşimleri ve hedeflerin lokalizasyonu </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Araştırma ve Geliştirme Dairesi, Tıbbi Araştırma Servisi, Gazi İşleri Bakanlığı tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma bir VA Liyakat İnceleme Ödülü (MCL) ve Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Multipl Skleroz Araştırma Fonu Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
