Summary
بروتوكول رواية ذكرت في هذه الدراسة الكشف يسمح الانتقائي لالانبثاث الرئة في قرار خلية واحدة في الفئران عن طريق الجمع بين
Abstract
ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة في معظم أنواع السرطان، وبالتالي التركيز الرئيسي في أبحاث السرطان. ومع ذلك، والكشف عن طريق التصوير الإشعاعي micrometastases والنجاح في القضاء عليها العلاجية تبقى محدودة.
بينما النماذج الحيوانية أثبتت أنها لا تقدر بثمن أدوات لأبحاث السرطان 1، رصد / تصور micrometastases لا يزال يشكل تحديا والتقييم غير دقيق من انتشار النقيلي في الدراسات قبل السريرية يؤدي إلى نتائج مخيبة للآمال يحتمل في التجارب السريرية 2. وبالتالي، هناك اهتمام كبير في صقل أساليب الكشف أخيرا للسماح للتكرار وموثوق بها من الانبثاث وصولا الى مستوى خلية واحدة في الأنسجة الطبيعية. التركيز الرئيسي لذلك على التقنيات، التي تسمح للكشف عن الخلايا السرطانية في الجسم الحي، مثل التصوير المقطعي الكمبيوتر الصغيرة (المتناهية الصغر CT)، التصوير المقطعي بوزيترون الانبعاثات (PET)، تلألؤ بيولوجي أو التصوير مضان <سوب> 3،4. نحن حاليا الأمثل لهذه التقنيات في رصد الجسم الحي للنمو الورم الرئيسي والانبثاث في نماذج مختلفة عظمية. ويمكن أيضا بعض من هذه التقنيات يمكن استخدامها لتحليل فيفو السابقين من ورم خبيث بجانب الطرق التقليدية مثل qPCR 5، 6 أو FACS أنواع مختلفة من تلطيخ النسيجية. كمقياس، وضعنا في هذه الدراسة على ترنسفكأيشن مستقرة أو تنبيغ الخلايا السرطانية مع الجينات lacZ ترميز الانزيم البكتيرية β-غالاكتوزيداز أن يؤيض الركيزة مولد اللون 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D galactopyranoside-(X-غال) إلى صبغ غير قابلة للذوبان الأزرق النيلي 7 و يسمح حساسة للغاية وانتقائية تلطيخ الأزرق النسيجية من الخلايا السرطانية في الأنسجة الحية السابقين الماوس وصولا الى مستوى خلية واحدة كما هو موضح هنا. هذا هو أداة منخفضة التكلفة وليس المعدات المكثف، والذي يسمح التحقق من صحة الانبثاث الدقيق للدراسات 8 في تقييم جديد لticancer العلاجات 9-11. وهناك عامل يحد من X-غال تلطيخ هو النقيض منخفضة لمثل الدم الحمراء ذات الصلة تلطيخ الأنسجة أوعية دموية أيضا. يمكن في أنسجة الرئة يمكن حل هذه المشكلة عن طريق نضح الرئة في الوضع الطبيعي، وهي تقنية تم إنشاؤها مؤخرا من قبل BORSIG وآخرون ال 12 الذين perfused الرئتين من الفئران تحت التخدير لمسح عليها من الدم وإصلاح وتضمينها في الموقع تحت التضخم من خلال القصبة الهوائية. هذا الأسلوب كما يمنع انهيار الرئة ويحافظ بالتالي مورفولوجية الحويصلات الهوائية الرئة الوظيفية، مما يحسن من نوعية الأنسجة للتحليل النسيجي. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول جديد، والذي يستفيد من مجموعة من X-غال تلطيخ الخلايا lacZ، معربا عن الورم وفي الموقع. التروية وتثبيت من أنسجة الرئة يسمح هذا البروتوكول المكررة عالية الحساسية الكشف عن الخلايا المتنقل واحدة في الرئة ومكنتنا في دراسة حديثة لدetect "نائمة" micrometastases الرئة في نموذج الفأر 13، التي وصفت في الأصل أن تكون غير النقيلي 14.
Protocol
1. الإرواء الرئة في الوضع الطبيعي وتثبيت
- تخدير الفئران مخزنة عن طريق الحقن IP من الفوسفات ميكرولتر 150 ~ المالحة (PBS) التي تحتوي على 112،5 مغ / كغ (وزن الجسم) الكيتامين، 16.5 زيلازين ملغ / كغ، و 15 ملغ / كغ آسيبرومازين. (أو آخر التخدير التي تحتوي على مسكنات الألم المناسبة)
- عندما ردود الفعل من الماوس لم تعد احظ اصلاحها على طاولة العمليات مرة أخرى إلى أسفل والرطب الفراء مع الايثانول 70٪ إلى أسفل الشعر البقعة.
- فتح الجلد من البطن حتى العنق وتسحبه على الجانبين أو إزالته.
- فتح الغشاء البريتوني والصدر وإلى حجم وافرة. منع تمزق الأوعية الكبيرة (مثل الوريد الوداجي) لتجنب انخفاض الكفاءة من نضح لاحقة.
- قطع الوريد الأجوف الذنبية تحت الكبد.
- استخدام حقنة 20 مل مزودة 21G - 24G إبرة لحقن ببطء 10-15 مل PBS إلى البطين الأيمن من القلب النابض حتى الرئة بيضاء تماما ويتوقف القلب (توقف الانقباض).
- قرصة قبالة الأوعية الدموية فوق الكبد والحجاب الحاجز مع المشبك الأوعية الدموية.
- استخدام حقنة 10 مل مزودة 21G - 24G إبرة لحقن ~ 2 مل من بارافورمالدهيد 3٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى البطين الأيمن.
- كشف القصبة الهوائية خارج القفص الصدري. استخدام نفس الحقنة لحقن ~ 3 مل من PFA 3٪ في برنامج تلفزيوني الجمجمة (خارج القفص الصدري) في القصبة الهوائية حتى يتم نفخ الرئة. مباشرة بعد إزالة الإبرة، قرصة قبالة القصبة الهوائية الذيلية من ثقب مع المشبك الأوعية الدموية والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح التثبيت.
- القطع الأوعية الدموية فوق المشبك الأوعية الدموية، وإزالة المشبك وحقن 2 مل PBS ~ إلى البطين الأيمن لإزالة PFA الزائدة.
- ثقب الأجزاء السفلى من الفص جميع بإبرة الرئة، وإزالة المشبك الأوعية الدموية في القصبة الهوائية وحقن 3-5 مل من محلول PolyFreeze تضمين المتوسطة / PBS 01:01 الذيلية في القصبة الهوائية للثقب الأول حتى PFA في رئةيتم استبدال فصوص من الحل.
- إزالة بعناية الرئة عن طريق سحب القلب مع ملقط وtransecting الأربطة النسيج الضام، والأوعية الدموية والقصبة الهوائية و. الحفاظ على القلب متصلا إلى الرئتين.
- اعتمادا على كيفية المضي قدما في الرئة تحليل الأنسجة تواصل مع البروتوكولات المحددة في القسمين 2 أو 3. إذا كنت تريد أن تفعل كل التحليلات، إزالة أحد الفص الرئة والمضي قدما كما هو موضح تحت 3. معالجة فصوص المتبقية متصلة القلب كما هو موضح تحت 2.
2. التصور من الخلايا الموسومة lacZ الورم النقيلي في الفصوص الرئة بالكامل
- وضع الرئة في كوب من البلاستيك مع غطاء محكم وإغلاق اصلاحها مع الفورمالديهايد 2٪ في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- إزالة تثبيت الحل واغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة ما لا يقل عن 10 مل الطازجة 5-برومو-4-كلورو-3-β-indolyl-D-غالاكتوزيد (X-غال) تلطيخ الحل (محلول المخزون X-غال [40 ملغ / مل فيثنائي ميثيل فورماميد] 1:40 مخففة في الحل تلوين الأساسية؛ درجة الحموضة 7.1 (الجدول 1)؛ بعيدا عن الضوء).
- وضع قطعة من الشاش على رأس الرئة السباحة للحفاظ عليها تماما في الحل ووضع غطاء فضفاض فقط على وعاء للسماح بتبادل الهواء.
- احتضان في C ° 37 ساعة لمدة 3-5 محمية من الضوء.
- إزالة X-غال الحل، شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا X-غال الحل (اختياري) وإضافة PFA 4٪.
3. التصور من الخلايا الموسومة lacZ الورم النقيلي في الرئة Cryosections
- ملء مسبق قالب المسمى التضمين إلى 3/1 مع غير مخفف PolyFreeze المتوسطة التضمين. وضع الفص الرئة على رأس وملء مع تضمين المتوسطة حتى يتم تغطيتها بالكامل الفص. محاولة لمنع الفقاعات.
- احتضان جزءا لا يتجزأ من الرئتين في C ° 4 لمدة 20 دقيقة.
- تجميد ثم الرئتين جزءا لا يتجزأ ببطء في خليط من الثلج الجاف ونظير البنتان وتخزينها في -80 ° C.
- 7-10 ميكرون قطع البردأقسام على ناظم البرد وجبل لهم على شرائح المجهر SuperFrostPlus.
- احتضان المقاطع على الفور مع حل تلطيخ X-غال عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في غرفة مرطب.
- شطف الشرائح في 2 مرات لمدة 5 دقائق PBS ثم في الماء المقطر لفترة وجيزة.
- مكافحة وصمة عار مع الأحمر بسرعة 10-30 النووية للثانية، وشطف في الماء المقطر وتركيب الشرائح مع اللقاحات جبل.
4. ممثل النتائج
عصاي وآخرون ذكرت في المقال الأصلي على نموذج دن LM8 المستمدة من الماوس OS أن الأورام الأولية SC المستمدة من الخلايا دان الوالدين، تختلف عن تلك المستمدة من النقيلي غاية LM8 خط الخلية الفرعية، لا تشكل عفويا الانبثاث الرئة كشف في مسانج الفئران C3H 14. مع تقنيات ذكرت هنا، أعيد التدقيق فيها ونحن تشكيل الانبثاث في نماذج الماوس OS Dunn/LM8. ونحن قد استفادت من دان lacZ-transduced مستقرة والخلية LM8ق وبروتوكول لنضح الرئة في الموقع وتثبيت في الفئران. صور ممثل الرئتين perfused وغير perfused-حقن تحت الجلد من الفئران مع lacZ-transduced وغير transduced ترد تحكم دان والخلايا LM8 في الشكل 1. في حقنها بخلايا الفئران دن السيطرة، ظلت الانبثاث المجهري العيانية وغير قابل للكشف في الرئتين غير perfused وperfused (الشكل 1A، من الأول إلى الرابع). ولكن، ومن المثير للاهتمام، في الفئران حقن مع دن-lacZ الخلايا، كشفت X-غال تلطيخ الأزرق micrometastatic بؤر من الخلايا وحيدة الخلية أو مجموعات صغيرة (<0.1 مم) على سطح غير perfused الرئتين (الشكل 1A، والسادس). داخل نضح الموضع وتثبيت للالرئتين زيادة تحسين الكشف من دن-lacZ micrometastases (الشكل 1A، والثامن). ومع ذلك، لم يكن لوحظ ثمرة لبؤر العيانية (الشكل 1A، والخامس، والسابع). </ P>
في الفئران حقنها بخلايا LM8 السيطرة، شفافة، بالكاد يمكن كشفها macrometastatic البؤر تم الاعتراف أكبر من 0.1 مم وقطرها في غير perfused الرئتين (1B الشكل الأول). لم نضح من الرئة (1B الشكل، والثالث) لا تحسين الكشف عن بؤر. ومع ذلك، في الفئران حقن مع LM8-lacZ خلايا متعددة X-غال الملون الأزرق الكلي تم الكشف عن (1B الشكل، والخامس) وmicrometastases (1B الشكل، والسادس) على سطح غير perfused الأجهزة. وعلاوة على ذلك، نضح في الرئتين زيادة تحسين الكشف الكلي وmicrometastases (1B الشكل، السابع - الثامن). ونتيجة لذلك، أصبح الصغيرة وmacrometastases مرئية في أعلى كثافة وعدد أكبر، ويرجع ذلك أساسا إلى الشفافية من الأنسجة perfused التي بؤر تحت السطح الجهاز أيضا أصبح مرئية.
وح إضافيةوأكد التحليل باستخدام istological cryosections من أنسجة الرئة والكشف الانبثاث الرئة تحسين حقن الفئران في lacZ-transduced مع دان والخلايا LM8. في الفئران مع أورام الأولية المستمدة من دن-lacZ أو الخلايا LM8-lacZ، على عكس الأورام في الفئران مع الخلايا الأولية من السيطرة منها، أو واحد حتى micrometastases بؤر الخلايا والمعترف بها في أقسام الرئة (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، كانت أكثر وضوحا أيضا macrometastases بوضوح في الفئران حقن مع LM8-lacZ الخلايا في الحيوانات من حقن الخلايا سيطرة LM8 (الشكل 2C، D).
الشكل 1. الكشف عن الانبثاث عفوية غير transduced (من الأول إلى الرابع) وlacZ-transduced (الخامس إلى الثامن) دان (A) وLM8 (B) في الخلايا غير perfused (الأول والثاني، والخامس، والسادس) وperfused (الثالث، الرابع، السابع، الثامن) الرئتين في فئران C3H. الانبثاث في ممثل X-غال ستاكله الرئتين INED (الخامس والسابع في ألف وباء) ومنها لقطات مقربة (السادس، والثامن في A و B) تظهر زرقاء. يشار إلى بؤر Macrometastatic (> 0.1 ملم) في أجهزة حقن الفئران بخلايا LM8 غير الموسومة (من الأول إلى الرابع في الإفطار) من خلال العلامات النجمية. هو مبين في مناطق شكا من وثيقة تمثل لكامل الرئتين. تشير على نطاق والحانات 1 مم في صور الرئتين كله و0.1 ملم في شكا من وثيقة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. الكشف عن ودان LM8 micrometastases في cryosections الرئة. وحضنت أقسام الأنسجة أكتوبر الرئة جزءا لا يتجزأ من الحل-X غال في تلطيخ C ° 37 لمدة 24 ساعة في غرفة ومرطب ثم counterstained مع الأحمر سريع النووية. الأسهم تشير إلى بؤر micrometastatic المعترف بها في أقسام الرئة من الفئران حقن مع دن-lacZ (B) أو LM8-lacZ الخلايا (D). Mظلت icrometastases لا يمكن الكشف عنها في أقسام الرئة من الفئران حقن مع المنظمات غير transduced دان (A) أو LM8 خلايا (C). تشير على نطاق والحانات 0.1 ملم.
Discussion
النتائج المعروضة هنا في النموذج Dunn/LM8 OS الماوس إثبات قوة الأسلوب المنشأة حديثا يجمع بين تلطيخ X-غال من lacZ الموسومة الخلايا السرطانية مع نضح في الموقع / التثبيت من أنسجة الرئة. هذا المزيج من الطريقتين يسمح عالية الحساسية كشف الآفات micrometastatic وصولا الى مستوى خلية واحدة ويحسن أيضا من التصور macrometastases على سطح الرئة (الشكل 1)، وكذلك في أقسام الرئة (الشكل 2). في حين أن تلطيخ X-غال كما يسمح للكشف عن (الصغرى) الانبثاث في الأجهزة الأخرى، نضح في الموقع / تثبيت يحسن الكشف عن بؤر المنتشر في الأنسجة الأخرى من الرئة قليلا فقط بسبب لون الدم الطبيعية والأنسجة المتصلة هذه الأجهزة 13. حتى إذا تم توجيه نضح إلى جهاز آخر، مثل الكبد، وإزالة الدم جزئيا فقط تحسين الرهان على النقيضوين X-غال تلطيخ واللون الطبيعي للجهاز. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تنطبق على أي نوع من الخلايا الموسومة lacZ الأورام، وتحسين الكشف بشكل كبير من ورم خبيث الرئة وصولا الى مستوى micrometastases وحيدة الخلية النائمة وتمكن من القياس الكمي سهلة وموثوق بها من micrometastases الكلي و. وجود قيود على هذا الأسلوب وجميع التقنيات الأخرى التي تعتمد على الجينات مراسل، بما في ذلك البروتينات الفلورية ووسيفيراز، هو استقرار للتعبير التحوير. كما هو مبين في الشكل 2D، ملطخة ليس كل الخلايا السرطانية داخل البؤر macrometastatic الأزرق، مما يشير إلى عدم وجود بيتا غالاكتوزيداز النشاط. وهذا قد يكون متعلق ب نخر، ولكن من الأرجح بسبب خسارة التعبير التحوير. لاحظنا أن الخلايا دان وLM8 هي فعالة جدا في تنظيم لأسفل من الجينات المحورة وlacZ الأخرى حتى في ظل اختيار المستمر للتعبير. ولذلك نحن تحولت في الدراسات الحديثة إلى K12 الفئرانوK7M2 وملتحقا الإنسان، وSaOS 143B-2 خلية عظمية خطوط، التي حافظت على كل lacZ مستقرة التعبير في المختبر وكذلك في الجسم الحي ما يصل الى 100٪ مع مرور الوقت.
ويضمن استقرارا مرة lacZ التعبير عن ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية في الدراسات مع الجينات التلاعب الخلايا السرطانية، على سبيل المثال ميكانيكي للتحقيق في عملية استعمار الأنسجة 13 وكذلك لتطوير واختبار علاجات جديدة تهدف إلى القضاء على الآفات النقيلي 15 ، 16. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون بمثابة مؤشر لتحسين تقنيات التصوير الإشعاعي الحالي، مثل PET، CT (الصغرى) والتصوير بالرنين المغناطيسي، وتستخدم للكشف المبكر عن آفات النقيلي. في دراسة حديثة PET (غير منشورة) مع استشفاف مختلفة ونحن في الجسم الحي التحقق من الكشف عن الانبثاث الرئة فيفو السابقين في وقت لاحق مع بروتوكول صفها. في دراسة مستمرة مع الحيوانات صغيرة جديدة الصغرى CT (SkyScan) نحن حتى الآن ABجنيه للكشف عن الانبثاث الرئة في الجسم الحي وصولا الى حجم 0.5 مم وفيفو السابقين وصولا الى 0.3 مم، ولكن نحن نهدف بدرجة وضوح 0.1 ملم. ومن المثير للاهتمام، وهذا هو الحد الأقصى لحجم التي وضعناها للتمييز الكلي من micrometastases مع أسلوب مجتمعة في الموقع ونضح تلطيخ X-غال. هذا يؤكد مرة أخرى حساسية وفائدة هذه التقنية سهلة وفعالة من حيث التكلفة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Lubor BORSIG (معهد علم وظائف الأعضاء في جامعة زيوريخ) لنصيحته على تقنية نضح الرئة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من Krebsliga من زيورخ Kanton، والتر وL. جوانا مؤسسة وولف، زيوريخ، وهي مؤسسة Hochstrasser ليديا، زيورخ، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، SNF، وسويسرا، وVEREIN Balgrist Schweizerischer، والجامعة من زيوريخ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
|||
References
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).
- Fass, L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).
- Puaux, A. L. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).
- Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models. Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).
- Schmidt, C. M. Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry. Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).
- Horwitz, J. P. Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies. Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).
- Arlt, M. Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model. Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).
- Arlt, M. J. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer research. 66, 936-943 (2006).
- Banke, I. J. Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity. Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).
- Borsig, L. Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).
- Arlt, M. J. LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis. J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).
- Asai, T. Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung. International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).
- Arlt, M. J. The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity. International journal of cancer. , (2011).
- Steinmann, P.
