Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Teğet Akış Ultrafiltrasyon: Kolloidal Gümüş Nanopartiküllerin Boyutu Seçme ve Konsantrasyon için "Yeşil" Yöntemi

Published: October 4, 2012 doi: 10.3791/4167
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Wright State University, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University

Summary

Teğet Akış ultrafiltrasyon (TFU) biosamples ağırlığı bazlı ayrılması için kullanılan bir devridaim yöntemi. TFU boyutu-select (1-20 nm çapında) uyarlanmış ve yüksek polidispers gümüş nanopartikülleri büyük bir hacmi (15.2 mikrogram ml 4 L konsantre edildi

Abstract

Günümüzde yaygın olarak bunların AGNPS güçlü antimikrobiyel özellikleri nedeniyle tüketici ürünleri, 1 su dezenfektanlar, 2 Therapeutics, 1, 3 ve 4 Biyomedikal cihazların üretiminde kullanılmaktadır. 3-6 Bu nanoparçacık uygulamalar kuvvetle AgNP boyut ve toplama durum tarafından etkilenmektedir . Birçok zorluklar kontrollü imalat 7 ve kapaklama / ajanlar veya organik çözücüler stabilize agresif kimyasal arınmış unfunctionalized, homojen AGNPS büyüklüğü tabanlı yalıtım 4,8 var. 7-13 Sınırlamalar, reaktiflerin toksisitesi yüksek maliyetler ortaya veya azaltılmış AgNP sentez veya izolasyon yöntemleri (örneğin, santrifüj, boyut bağımlı çözünürlük, boyut dışlama kromatografisi vb) verimlilik. 10,14-18 Bunun üstesinden gelmek için, son zamanlarda TFU büyükse, konsantrasyonu üzerinde kontrol ve izin gösterdi Creighton AGNPS (300 agregasyonu devletBöyle Ultrasantrifügasyon gibi izolasyon geleneksel yöntemlere kıyasla 198.7 mg ml -1) 15.3 mg ml -1 ml aşağı 10 ml. 19

TFU genellikle proteinler, virüslerin ve hücrelerin ağırlık temelli izolasyon için kullanılan bir devridaim yöntemi. Kısaca 20,21, sıvı numune kD 1.000 ila 10 kD arasında değişen gözenek büyüklüğüne sahip içi boş elyaf membran bir dizi geçirilir. Büyük bileşenlerin (retentat) aynen korunurken örnek küçük askıya veya çözünmüş bileşenler (süzüntü) çözücü ile birlikte gözenekli bariyer geçecek. TFU o ne zarar örnek olarak "yeşil" bir yöntem olarak kabul veya zehirli aşırı ayıraç ve yan ortadan kaldırmak için ek çözücü gerektirir olabilir. Her ikisi de hidrofobik ve hidrofilik filtreler bulunmaktadır Dahası, TFU nanoparçacıklar büyük bir çeşitlilik için uygulanabilir.

Bu çalışmanın iki temel amacı vardı: 1) göstermek içinBir davet video deneyimi ve 2 ile TFU yaklaşımın deneysel yönlerini) kolloidal nanopartiküller ve retentat daha küçük hacimli büyük hacimler için TFU yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için. İlk olarak, unfuctionalized AGNPS (4 L, 15.2 ug ml-1) NaBH4 ile AgNO 3 azaltılması ile iyi kurulmuş Creighton 22,23 yöntem kullanılarak sentezlendi. AgNP polidispersite sonra iki 100-kD (200 cm 2 ve 20 cm 2) Filtreleri takip AGNPS ve AgNP-agrega daha büyük 50 nm, kaldırmak için bir 50-nm filtresi (460 cm 2) kullanılarak bir 3-adım TFU yoluyla minimize edildi AGNPS konsantre. Örnek örnekleri transmisyon elektron mikroskobu, UV-Vis absorpsiyon spektrofotometresi, Raman spektroskopisi ve indüktif eşleşmiş plazma optik emisyon spektroskopisi ile karakterize edildi. Nihai retentat yüksek konsantrasyonlu (4 mi, 8,539.9 mg ml-1) henüz birleştirilmiş ve homojen aşağı oluşuyorduÇapı 1-20 nm AGNPS. Bu, yaklaşık% 62 arasında bir konsantrasyonda gümüş verim karşılık gelir.

Protocol

1. Kolloidal AGNPS sentezi

Creighton yöntemi (biraz değiştirilmiş ucuz) 22 için reaksiyon mekanizması istenmeyen hidroliz, oda sıcaklığında ya da daha yüksek NaBH4 yan reaksiyon ile birlikte referans Pavel et.al arasında desteklenmesi bilgi de ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 23

  1. 4-12% 40 etanol banyosu içinde bir 1.25 M NaOH içinde, hr ve son olarak otoklav, daha sonra da% 10 HNO 3 banyosu içinde 12-24 saat için her cam temizleyin. Züccaciye asit ve baz banyo adımlardan sonra ultra saf su (MΩ 17 veya daha yüksek) ile iyice beş kez en az durulanmalıdır.
  2. Bir 2 mM NaBH4 çözeltisi, 300 ml ve 10 soğutuldu otoklavlanmış su ° C'ye kullanılarak 1 mM AgNO 3 çözelti, 100 ml hazırlanması Daha düşük sıcaklıklarda NaBH4 gibi bir yan reaksiyonu önlemek olacaktır.
  3. Bir 500 ml Erlenmeyer şişesi reaksiyon devam 2 mM NaBH4 çözeltisi 300 mlBir karıştırma çubuğu aining ve gümüş oksitlenmeyi önlemek için alüminyum folyo ile sarın şişesi. Bir karıştırma plakası üzerinde bir buz banyosu içinde şişeye yerleştirin ve 10 dakika için 325 rpm'de çözelti karıştırılır.
  4. Saf su dolu bir kolon ile durulama ile asal bir 25 ml büret. Priming sonra alüminyum folyo ile AgNO 3 çözüm ve şal ile büret doldurun.
  5. Karanlık bir odada, sürekli karıştırma (Şekil 1A) ile NaBH4 çözelti 1 damla saniye-1 hızında 1 mM AgNO 3 solüsyonundan 50 ml eklenir. AgNO 3 ilavesi sırasında ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir "folyo çadır" ile, cihazın orta bölümünde kaplayın. AgNO 3 ek 30-40 dakika gerektirir. Periyodik buz banyosu doldurun.
  6. AgNO 3 ilave işlemi tamamlandıktan sonra, buz banyosu doldurmak ve bir ilave 45-50 dakika boyunca koloidal çözelti karıştırmaya devam edin. Kolloidal AGNPS oluşumu renksiz gelen renk değişikliği ile bildirilirbir altın sarı için, hangi AGNPS bir yüzey plazmon rezonans maksimum (Şekil 1B) bir özelliğidir.
  7. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, kolloid buzdolabında soğutun. Kolloid tutarlı kalmıştır varsa Kolloidal AgNP toplu bir hafta sonra kombine edilebilir, yani kolloidal çözelti toplanmaz ve toplu mümkün toplama veya kirleticileri belirlemek için UV-Vis absorpsiyon spektrofotometresi ve Raman spektroskopisi ile karakterize edilmiştir.

2. Kolloidal AGNPS Karakterizasyonu

Bir Cary 50 UV-VIS-NIR spektrofotometre (Varian Inc) ve bir Olympus BX41 konfokal mikroskop Raman donatılmış bir LabRamHR 800 Raman sistemi (Horiba Jobin Yvon, Inc) AgNP karakterizasyonu için kullanılmıştır. Cary WinUV yazılım LabSpec v.5 ve Kökeni 8.0 yazılımı veri toplama ve analiz için kullanılmıştır.

Not: tedarik parametreleri fo optimize edilmesi gerekmektedirr diğer enstrümantasyon modelleri.

UV-Vis Spektrofotometresi üzerinden Kolloidal AGNPS bir Yüzey Plazmon Rezonans Belirlenmesi

  1. 1:10 hacim oranında Creighton kolloid ve ultra saf su ile 1 cm 3 tek küvetini doldurun. Boş bir temel düzeltme için ultra saf su ile başka bir 1 cm 3 küvetini doldurun. Bir Kimwipe ile her ikisi de küvetlerin dışında silin.
  2. 1.0 Y maksimum -0,5 bir Y den en az absorbans moduna spektrofotometre ayarlayın. 200-800 nm X tarama penceresinde ayarlayın ve taban düzeltme ile 4,800 nm dk -1 hızlı tarama hızı seçin.
  3. Cihaz içine su dolu küvet takın ve bir temel taraması çalıştırın. Gerekirse sıfır olmayan bir temel kontrolü elde edilene kadar tekrarlayın.
  4. Örnek küveti ile boş küvetin değiştirin ve kolloidal numunenin UV-Vis absorpsiyon spektrumu (Şekil 1C) toplanması için bir absorbans tarama başlatabilir.

    Raman spektroskopisi ile Kolloidal AGNPS Saflık Testi

    Video gösterisi (10-15 dak video) zamanaşımı ve protokol metni alan kısıtlaması (en fazla 3 sayfa) nedeniyle, bu deneysel bölümde videoya olmayacaktır.

    1. Uyarma kaynağı (632,8 nm He-Ne), filtre (hiçbir filtre, numune, lazer gücünü ~ 17 mW), konfokal deliği (300 mikron), spektrometre (730 cm -1), holografik parmaklığı aşağıdaki gibidir: Cihaz parametre ayarlarını (600 bahçeleri / mm), objektif lens (50x uzun bir çalışma mesafesi hava objektif), maruz kalma süresi (30 sn) ve birikim döngüleri (5).
    2. Kolloid ile 2 ml kuvars küvetine doldurmak için temiz bir pipet kullanın ve yavaşça fişi takın. Küvetin yüzeyinden parmak izleri, lekeler veya kolloid kapalı temiz bir Kimwipe kullanın. Anlamlı mikroskop sahne indirin. 50x objektif lens seçin ve sahneye küvet yerleştirin.
    3. Las Odakdoğrudan cihaz ve Olympus kameranın video modunu kullanarak küvetin iç duvar altında AgNP kolloid üzerine er kiriş. Oda ışıkları kapatın ve Raman spektrumu (Şekil 1D) kazanır.

    3. Teğet Akış Ultrafiltrasyon (TFU) aracılığıyla Boyutu seçimi ve Kolloidal AGNPS Yoğunlaşması

    Bir KrosFlo II Araştırma filtre sistemi (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) AgNP polidispersite sınırlamak için ve onları (Şekil 2) yoğunlaştırmak için kullanılmıştır. TFU işlemi üç adımlar şunlardır: bir 50 nm MidiKros polisülfon modül (460 cm 2), 2) boyutu seçimi ve konsantrasyonu kullanılarak AGNPS ve 50 nm arasında AgNP-agrega çap ve daha büyük (1) boyutu seçimi , 100 kD MicroKros polisülfon filtresi (20 cm2) (Şekil 3) ile bir 100 kD MidiKros filtre (200 cm 2) ve (3) daha fazla hacim azalması ile çapı 1-20 nm AGNPS.

    1. 2A Şekil göre peristaltik pompa boyutu 17 MASTERFLEX besleme hortumu bağlayın. Y-bağlantı ve boru bağlantı kurulumu için gerekli olacaktır. 50-nm MidiKros modülü tüp takın. Zip bağları kullanarak filtre hortumu güvenli olduğundan emin olun. BOYUT düğmesini kullanarak tüp boyutu 17 seçin.
    2. DIR düğmesi kullanılarak pompa yönü saat yönünün tersi seçin. MODE düğmesine INT açık olduğundan emin olun.
    3. Pompayı çalıştırmadan önce 300 Aşağıda ml dak -1 pompa hızı düşürün. Pompa hızı ikinci boru boyutuna göre ayarlanmalıdır. Bu, operatör derhal olası kaçak ancak yine de astarlama sisteminin bir etkiye sahip olmak için yeterince büyük reaksiyona izin vermek için küçük bir ayar olmalıdır. Haznesinden tüp ve filtre içine kolloid çekmek için gereken vakumu yaratmak için, hortumun orta Y-birleşme bölgesinin üst kısmına doğru, filtrenin alt bölümünde yol açar boru kesilir.
    4. Sıvı tüp aracılığıyla serbestçe sonra, pompa kapatmak bir boru kavşak ile tüp kırık bölümü katılmak ve zip bağları ile sabitleyin. Pompayı yeniden açın ve filtrasyon devam.
    5. Sızıntı boru devresini kontrol edin. Bir sızıntı bulunursa, bir zip kravat uydurma ayarlama veya yeniden güvence altına alarak sızıntısı düzeltmez. Bir kez tüp sistemi pompa debisi hiçbir büyük 700 ml'den dk -1 artabilir sızıntı ücretsiz olduğunu. Bu pompa hızı değeri boru arızasından kaçınmak için tüp büyüklüğüne göre optimize edilmelidir. Rezervuar şişe içinde sıvı neredeyse hiçbir şey bitene kadar filtrasyon devam edin.
    6. Filtreleme işlemi tamamlandıktan sonra, 50 nm çaplı ve Smal ve AGNPS içeren süzüntü toplamakler. Retentat belirli AgNP uygulamaya göre daha fazla analiz için kaydedilebilir.

    Adım 2

    1. % 2 HNO 3 ve önce 100 kD MidiKros 50 nm modül için olduğu gibi, aynı ayar kullanarak filtre yüklenmesi için saf su ile birlikte tüp durulayın.
    2. 100-kD MidiKros modülünü kullanarak 3.3 adımı yineleyin.
    3. Filtreleme işlemi tamamlandıktan sonra, tüp ve filtre (100 kD retentat) içeriğini toplamak. Hacim yaklaşık 50 ml olmalıdır.

    Adım 3

    1. 2B Şekil göre peristaltik pompaya FİLTRE boyutu 14 MASTERFLEX tüp ve 100 kD MicroKros bağlayın. Zip bağları ile tüm kavşaklar sabitleyin. SIZE düğmesine ve 30 ml dak -1 pompa hızı düşük kullanılarak pompa hortumunu boyutu 14 seçin.
    2. Filtrasyon işlemine başlayın. Sızıntı boru devresini kontrol edin. Bir sızıntı bulunursa, uygun ayarlayarak sızıntısı düzeltmezting veya yeniden güvence zip kravat.
    3. Bir kez tüp sistemi sızıntı ücretsiz, pompa debisi hiçbir büyük 90 ml'den dk -1 artabilir. Rezervuar şişe içinde kalan sıvı konsantre asgari bir miktarını içeren kadar filtrasyon devam edin.
    4. Tüp ve filtre kalan içerik pompa çalışır durumdayken şişe besleme borusu kaldırarak rezervuar şişe içine alınabilir. Boru ve filtre içerikleri rezervuar şişe girdikten sonra, pompa kapalı olabilir.

    4. Endüktif Eşleşmiş Plazma Optik Emisyon Spektroskopisi (ICP-OES) ile Kolloidal AGNPS Gümüş Tutar Kantitasyonu

    Her kolloidal numune kimyasal sindirildi ve gümüş miktarı A 710E spektrometre (Varian Inc) kullanarak ICP-OES ile ölçüldü. Gümüş için lineer regresyon kalibrasyon eğrisi (Şekil 4) sekiz gümüş standartlar (0, 3 kullanılarak inşa edildiEser metal analiz (Ultra Scientific) için bir 10,000 ug ml-1 gümüş standart elde edildi, 7, 10, 15, 25, 50, ve 100 ug M-1).

    1. Kimyasal HNO 3 örnekleri kullanılarak sindirmek. Temsili numuneler orijinal kolloid (adım 1), 50-nm süzüntü (adım 1), 100-kD retentat (adım 2), ve son 100-kD retentat (adım 3) (Şekil 3).
    2. Için ilk olarak 100 kD retentat için 50 nm süzüntü, 1/25.000 için orijinal koloit, 1:1000 için 1:1000, ve 1:250,000: Örnekler% 2 HNO 3 Aşağıdaki birim oranlarını kullanan ile sulandırılıp Nihai 100 kD retentat. Gümüş liç önlemek için, tüm örneklerin düşük yoğunluklu polipropilen kaplarda muhafaza edilmelidir.
    3. Ag için dalga boyu (328,068 nm), güç (1.20 kW), plazma akışı (15.0 L dk -1), Yardımcı akım (1,50 L dak -1) ve nebulizatör basınç (200 kPa aşağıdaki gibidir: ICP-OES cihazı parametreleri ayarlayın ).
    4. Her sample 10 saniyelik bir süre ile tekrarlanan üç kopya halinde ölçülmelidir. 15 sn ve 30 sn numune alımı gecikme Arasında ölçümü stabilizasyon zamanı kullanılmalıdır. Bir yöntem boş çapraz kontaminasyon riskini azaltmak için her numune arasındaki getirilmelidir.

    5. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ile Kolloidal AGNPS Büyüklüğü Dağılımı

    A Phillips EM 208S TEM koloidal AGNPS görselleştirmek için kullanılmıştır. Elektron mikroskop yüksek çözünürlüklü Gatan Bioscan fotoğraf makinesiyle çekilmiştir ve ImageJ yazılım analiz edilmiştir. 24

    1. Ultra saf su (1:100 hacim oranında) ile 100 kD retentat örnek seyreltilir. 300-örgü formvar kaplı altın ızgaraları (Elektron Mikroskobu Bilimler) üzerine orijinal kolloid ve seyreltilmiş 100-kD retentat (adım 3) Mevduat 20 ul. Izgaraları bir desikatörde kurumaya bırakın. Bir gün içinde görüntüle.
    2. AGNPS görselleştirmek için 70 kV TEM aracın hızlanma potansiyeli ayarlayın. Cyüksek çözünürlüklü kamera kullanarak elektron mikroskop (Şekil 5) apture ve etiketli görüntü dosya biçimi (TIFF) olarak kaydedebilirsiniz.

    6. Temsilcisi Sonuçlar

    Kolloidal AGNPS Sentezi ve Karakterizasyonu

    Creighton kolloidal AGNPS Dört litre başarıyla Şekil 1A görüntülenen kurulum kullanılarak sentezlenmiştir. Nihai kolloid karakteristik altın sarısı bir renk (Şekil 1B). 22, 23 Bu kolloid UV-Vis absorpsiyon spektrumu 394 nm (Şekil 1C) tipik bir keskin, simetrik yüzey plazmon pik (SPR) vardı. Özgün Creighton koloit ve son 100 kD retentat ve Raman spektrumu sadece üç yani titreşim modlarının, bükme (1640 cm-1) ve H2O arasında simetrik ve asimetrik germe modları (3245 cm-1 ve 3390 cm-1 sunulmuştur , sırasıyla) (Şekil 1D). </ P>

    Kolloidal AGNPS arasında TFU

    TFU kurulum ve 3-adım TFU sürecinin şematik, sırasıyla Şekiller 2 ve 3 'te gösterilmektedir. 1. Aşamada, bir 50 nm filtre (460 cm2) için kullanılmıştır boyutu-seçme ve orijinal kolloid (50 nm retentat yaklaşık 100 mL) 50-mil çaplı ve daha büyük AGNPS ve AgNP-agregatları uzaklaştırmak için. Bu adım aynı zamanda 50-nm süzüntü 3.9 L aşağı orijinal kolloid 4 L küçük bir hacim azalması eşlik etti. Hiçbir bozulma geri yıkama ya da akış adımı kullanıldı. Büyük hacim azaltma (yani, su kaldırma) 50-nm süzüntü sonradan 100 kD filtresi (200 cm 2) ile çalıştırıldı 2. adımda elde edildi. Elde edilen 100 kD retentat 50 ml'lik bir toplam hacmine sahipti. Sentez yan ve fazla reaktifler çoğu su çözücü (100 kD süzüntü 3.850 ml) ile bu adımda bertaraf edildi. Dahası, konsantrasyon AgNP addit elde edilmiştirDaha önce rapor edilen prosedür için üçüncü bir süzme aşaması. 19, bu adım 3, daha küçük bir yüzey alanı (20 cm 2) yaklaşık 100 kD bir filtrede iyon 4.0 ml ile 100 kD retentat hacmi azalır. TEM ölçümler bu son 100 kD retentat çapı 1-20 nm asılıyor toplu AGNPS çoğunlukla oluşur olduğunu gösterecektir.

    Kolloidal AGNPS ICP-OES ve TEM

    Gümüş için bir lineer regresyon kalibrasyon eğrisi (Şekil 4) sekiz standartları (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50, ve 100 ug L-1) imal edilmiştir. Dört temsili örnekleri koloidal her gümüş miktarı, daha sonra bilinen veriler okumada kalibrasyon eğrisinden belirlenmiştir: ilk orijinal kolloid (15.2 ppm, Şekil 3A), 50 nm Süzülen madde (14.1 ppm, Şekil 3B), 100 - kD retentat (683,1 ppm, Şekil 3C) ve son 100-kD retentat (8,538.9 ppm, Şekil 3B).15.2 ppm gerçek verim Creighton reaksiyon için 15.4 ppm tipik teorik verim çok yakındır. AGNPS ve aşırı konsantrasyonu (ppm 8,538.9 4 ml) ile bir son 100 kD retentat (Şekil 3, şişe resim parçalar) için koyu kahverengi için orijinal koloit için altın sarısı renk belirgin bir değişiklik ile yansıtılmıştır. Filtre kalite 1 adım için, özellikle de TFU süreci için kritik olduğu bulunmuştur. Nihai retentat konsantrasyonları 3,390.1 ppm filtreleri (ağırlıklı yepyeni karşı kullanılır) durumuna bağlı 9,333.3 ppm arasında değişmektedir. Membran zarar görür gözenekleri ise, daha az 50 nm'den daha çaplara sahip AGNPS da korunur ve daha sonra süzülen madde toplanır AGNPS toplam miktarını azaltacaktır. Basıncı izleme ve uygun temizlik dahil filtrasyon işlemi optimizasyonu filtrelerin ömrünü artırabilir.

    Temsilcisi TEM mikrografları özgün Creighton koloit ve son 100 kD retentat (adım 3), sırasıyla, Şekil 5A ve 5C 'de gösterilmektedir. Onların Ayrı ayrı devlet, AGNPS daha açık gri arka plan üzerinde siyah yuvarlak alanlar olarak görünür. Yaklaşık olarak 800 AGNPS İki numunenin her birinin TEM mikrografları tespit edilmiştir ve Görüntü J yazılımı kullanılarak analiz edildi. Bir parçacık tam ve kapalı çevre tarafından tanımlanmıştır. Bir alan eşik değer TEM mikrografları çözümüne göre 1.0 nm 2 olarak belirlendi. AgNP sayar ve alan veriler Microsoft Excel ve AgNP çapları ekstrapole edilmiştir içine ihraç edilmiştir. Özgün koloit ve son 100 kD retentat içinde ortalama çap AgNP sırasıyla, 9.3 nm ve 11.1 nm olarak ölçüldü. AGNPS çapı ölçümleri daha sonra Menşe 8.0 yazılımı ihraç edildi ve TEM boyutu histogram (Şekil 5B ve 5D) her bir örnek için inşa edilmiştir.

    1 "src =" / files/ftp_upload/4167/4167fig1.jpg "/>
    Şekil 1. A) Sentez kurulum, B) Karakteristik renk, C) UV-Vis absorpsiyon spektrumu ve Creighton kolloidal AGNPS D) Raman spektrumu.

    Şekil 2,
    Şekil A) 1. ve 2. adımları için 2 TFU deney düzeneği:. I) Rezervuar Creighton kolloidal AGNPS içeren. Süzüntü toplama II) Rezervuar. Tüp III) Y-bağlantı. IV) Peristaltik pompa kafası. . V) Ya 50-nm veya 100-kD Midi Kros filtresi B) Adım 3: I) Rezervuar Creighton kolloidal AGNPS içeren. Süzüntü toplama II) Rezervuar. III) 100-kD Mikro Kros filtresi.

    Şekil 3
    Şekil 3. Flowchart TFU süreci tasvir. Mavi gölgeli kutular daha fazla analiz için toplanan AGNPS arasında kolloidal süspansiyonlar işaretleyin. Flakon photographs 50-nm süzüntü 100 kD Midi Kros kullanarak hacim küçültme sonrasında elde 50-nm filtresi (460 cm 2), C) ilk 100-kD retentat yoluyla orijinal kolloid işledikten sonra toplanan) A) Orijinal kolloid toplu, B göster Filtre (200 cm 2), ve 100 kD Mikro Kros filtre (20 cm 2) kullanarak hacim azalması sonucu D) nihai 100 kD retentat. 100-kD süzüntü suyu gibi görünüyor.

    Şekil 4,
    Şekil 4, sekiz gümüş standartları kullanılarak yapılan okumada doğrusal kalibrasyon:. 0, 3, 7, 10, 15, 25, 50, ve 100 ug L-1.

    Şekil 5,
    A) Orijinal Creighton AGNPS ve C Şekil 5. TEM mikrografları) son 100-kD retentat (ölçek çubuğu100 nm). TEM boyutu histogramlar B için yaklaşık 800 AGNPS) orijinal Creighton AGNPS analiz ederek inşa, ve D) son 100-kD retentat. Şekil 5B içerlek karşılaştırma amacıyla genişletilmiş 41-75 nm boyut aralığı gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

UV-Vis Absorbsiyon Spektrometresi ve Kolloidal AGNPS Raman Spektroskopisi

Bu, iyi bir kolloid absorbsiyon spektrumunu, yüzey plazmon rezonans tepe sayı AGNPS artar simetri olarak azalttığı bilinmektedir. Ayrıca, daha geniş veya daha AgNP toplama kırmızı-kaydırılmış zirveleri görünüme neden olur. 25,26 394 nm 'de bir tek, keskin ve simetrik SPR tepe varlığı orta toplama ve boyut dağılımının küçük, yuvarlak AGNPS göstergesidir.

Önce ve ultrafiltrasyon sonra koloidal numunelerin saflığı H 2 O. karakteristik sadece üç titreşim modlarının teşhir orijinal Creighton koloit ve son 100 kD retentat, bir Raman spektrumları ile gösterildi Organik safsızlıklar veya büyük Raman kesit ultrafiltrasyon kirleticiler ile ilişkili Raman sinyal AgNP için hemen yakınlık yoluyla geliştirilmiş olacaktıryüzey (yani, sözde yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) etkisi).

Ultrafiltrasyondan Kolloidal AGNPS ICP-OES ve TEM

Daha önce bildirilen TFU prosedür 19, bir üçüncü, 100 kD süzme aşamasının ilave retentat bir 1000-kat daha küçük bir hacim içinde Creighton koloidal AGNPS daha büyük bir hacim başarılı bir şekilde azaltılması (15.2 ppm 4L batch) (4 ml kolaylaştırmıştır 8,538.9 ppm). Bu, yaklaşık olarak% 62 dikkate AGNPS ve 50 nm çaplı ve kaldırılmış olduğu daha büyük AgNP-agrega miktarda alarak bir TFU konsantrasyon verim karşılık gelir. Son 100-kD retentat çoğunlukla 1-20 çapı nm ve aşırı ayıraç ve yan dan özgürdü monodisperse AGNPS oluşuyordu, çünkü konsantrasyon derecesi dikkate değerdir. Üçüncü, 100 kD süzme aşaması 45% 20-62 'den% konsantrasyon verimi daha iyi bir. Boyut seçimi ve AGNPS konsantrasyonunun daha ileri gelişmeler TFUilave içi boş elyaf membranlar kullanılarak elde edilebilir. M 2 5.1 10 kD ve yüzey alanlarına kD 1,000 8 cm 2 arasında değişen gözenek büyüklüğüne Filtreler hidrofobik ve hidrofilik örnekleri hem şu anda mevcuttur. Tampon değiş tokuş da alt-uygulamalara bağlı olarak, TFU sırasında gerçekleştirilebilir. Hacim küçültme 800 kat (hacminin en az 5 ml 4 L azalır yani) aştığında, konsantrasyon aşırı derecede bağlı kolloidal süspansiyon stabilitesi ve raf ömrü bir azalma var. Bu yüksek konsantrasyonlu, unfunctionalized AgNP için raf ömrü yaklaşık bir iki hafta 10 ° C'dir Sakıncalı iken, bu sınırlama dikkatli araştırma planlama ve hazırlık ile yönetilir. Bu yoğunlaşma aşırı derecede farklı konsantrasyonlarda eden nanotoxicity çalışmalar için istenen edildi. AGNPS azı konsantre gruplar daha kararlı ve uzun raf ömrü olması bekleniyor.

(Şekil 5A ve 5C) görsel muayene gibi orijinal kolloid ile karşılaştırıldığında son 100-kD retentat minimal toplu AGNPS sıklığı arasında gösterdi. Iki koloidal örnekleri (Şekil 5B ve 5D) ve TEM boyut histogramları daha fazla Creighton koloidal AGNPS bir polidispersite TFU ile sınırlı olduğunu doğruladı. Daha dar molekül ağırlığı dağılımına sınırlama daha küçük gözenek boyutları filtrasyon membranları bir dizi kullanılarak elde edilebilir. Creighton AGNPS ve çapları, 1 nm 75 nm (genişletilmiş 41-75 nm boyutuna bidonları gösteren Şekil 5B ve inset) değişmekteydi ederken AGNPS ve / veya 50 nm ve daha büyük AgNP-agrega (% 0.9 üzerinden yüzde toplam AGNPS) son 100-kD numunenin TEM boyutu histogramı (Şekil 5D) olarak yoktu. 100-kD retentat çoğunlukla 1-20 nm çaplarında vardı AGNPS oluşuyordu; 2 AGNPS küçük bir katkı (% 12.4) vardı1-40 boyutu bidonları. Şekil 5B ve 5D boyut dağılımı eğilim 1-5 nm boyut aralığı dışında TFU sürecinde 100 kD retentat için tutulduğunu doğruladı. Süzüntü membran içine filtre boyunca geçirilerek AgNP atfedilen 100 kD numune için çap olarak 1-5 nm daha küçük AGNPS sıklığı farkedilir bir azalma (% 33.2 den% 21.3 kadar), oldu. Sonuç olarak, ortalama çapı AgNP nihai 100 kD retentat 11.1 nm orijinal koloit için 9.3 nm çıkmıştır. Yaklaşık 800 AGNPS hem kolloidal örnekleri incelendi Çünkü, 1-5 nm (% 11,9) ve 6-10 nm (% 1.3) boyut aralıkları içinde küçük AGNPS azalmasına sıklığı büyük AGNPS sıklığında bir artış eşlik etti 11-25 nm boyut kutularına (yani 100-kD retentat özgün kolloid 12.8% 'i).

Sonuç olarak, TFU si için etkili, "yeşil" bir yöntem olduğu kanıtlanmıştırze-seçim ve çeşitli ses ölçeklerde minimal agregasyonu ile kolloidal AGNPS konsantrasyonu. Bunların terapötik indeksi arttırırken AgNP sentezi (iyi boyut, şekil ve toplama kontrolü için) kimyasal olarak agresif reaktifler veya organik solventlerin kullanımı ortadan kaldırmak önemli AgNP toksisite azaltabilir. Sınırlı polidispersite arasında AGNPS kendi optoelektronik 28, 29 27, geliştirilmiş katalitik veya SERS tabanlı biyoalgı özellikleri nedeniyle diğer acil endüstriyel ve araştırma uygulamaları bulabilirsiniz. 9,19,30,3131 Lander ve arkadaşları tarafından çok yakın bir çalışma. 32. göstermiştir ki mikro ve beş farklı polimerik malzemeler (polisülfon, polyethersulfone, naylon, selüloz asetat, ve polyvinylidenefluoride) yapılmış ultrafiltrasyon membranı ile başarılı bir şekilde fonksiyonel grubuna nanopartiküllerin boyutu seçimi için uygulanabilir. Çapı 2-10 nm Bu MP'larına Ag, Au veya Ti 2 O çekirdek vardı ve neden organik polimer kaplamalar ile fonksiyonelleştirilmiş edildipozitif veya negatif yüzey ücretleri. Çekirdek ve nanopartiküllerin yüzey özelliğe Hem Membranların (0.2 nM 0.22 um) vasıtasıyla NP tutma veya geçit içinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Beklendiği gibi, pozitif yüklü MP'larına tamamen NP çapları daha 20 kat daha büyük gözenek boyutu vardı negatif yüklü membranlar tarafından (>% 99) reddedilmiştir. Bu deneyler sonucunda, tek bir etkileşim mekanizması dikkatle Fonksiyonlu MP'larına ile gelecekteki çalışmalarda düşünülmesi gerektiğini öğrenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Mühendislik ve LEADER Konsorsiyum Programları NUE yoluyla Ulusal Bilim Vakfı Fon minnetle kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silver nitrate (AgNO3) Acros Organics Inc. CAS: 7761-88-8
Sodium borohydride (NaBH4) Acros Organics Inc. CAS: 16940-66-2
Nitric acid (HNO3, Optima) Fisher Scientific Inc. A467-1 Trace metal grade for ICP analysis
10,000 μg ml-1 silver standard, EnviroConcentrate Ultra Scientific US-IAA-047
KrosFlo Research IIi Tangential Flow Filtration System Spectrum Laboratories Inc. SYR2-U20-01N
0.05 μm PS (0.5 mm) 460 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X30S-900-02N
Midi 100 kD PS 200 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X3-100S-901-02N
Micro100 kD PS 20 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X1AB-300-10N
MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 17 Cole-Palmer Instrument Co. 06424-17
MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 14 Cole-Palmer Instrument Co. 06424-14
Cary 50 UV-VIS-NIR spectrophotometer Varian Inc.
LabRam HR 800 system Horiba Jobin Yvon Inc.
Varian 710ES ICP-–S Varian Inc.

Table 1. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Project on Emerging Nanotechnologies. , Available from: http://www.nanotechproject.org/inventories/consumer/analysis_draft (2011).
  2. Savage, N., Diallo, M. S. Nanomaterials and Water Purification: Opportunities and Challenges. Journal of Nanoparticle Research. 7, 331-342 (2005).
  3. Jain, J. Silver Nanoparticles in Therapeutics: Development of an Antimicrobial Gel Formulation for Topical Use. Mol. Pharmaceutics. 6, 1388-1401 (2009).
  4. Dal Lago, V., Franca, dO., de, A. G., Kobarg, J., Borba Cardoso, M. Size-selective silver nanoparticles: future of biomedical devices with enhanced bactericidal properties. J. Mater. Chem. 21, 12267-12273 (2011).
  5. Panacek, A. Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity. J. Phys. Chem. B. 110, 16248-16253 (2006).
  6. Elechiguerra, J. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3, 6 (2005).
  7. Jana, N. R., Sau, T. K., Pal, T. Growing Small Silver Particle as Redox Catalyst. J. Phys. Chem. B. 103, 115-121 (1999).
  8. Tolaymat, T. M. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers. Sci. Total Environ. 408, 999-1006 (2010).
  9. Willets, K. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) for probing internal cellular structure and dynamics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 85-94 (2009).
  10. Novak, J. P., Nickerson, C., Franzen, S., Feldheim, D. L. Purification of Molecularly Bridged Metal Nanoparticle Arrays by Centrifugation and Size Exclusion Chromatography. Anal. Chem. 73, 5758-5761 (2001).
  11. Hossain, M. K., Kitahama, Y., Huang, G. G., Han, X., Ozaki, Y. Surface-enhanced Raman scattering: realization of localized surface plasmon resonance using unique substrates and methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 1747-1760 (2009).
  12. Henglein, A., Giersig, M. Formation of Colloidal Silver Nanoparticles: Capping Action of Citrate. J. Phys. Chem. B. 103, 9533-9539 (1999).
  13. Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
  14. Al-Somali, A., Krueger, K. M., Falkner, J. C., Colvin, V. L. Recycling Size Exclusion Chromatography for the Analysis and Separation of Nanocrystalline Gold. Anal. Chem. 76, 5903-5910 (2004).
  15. Hanauer, M., Pierrat, S., Zins, I., Lotz, A., Sonnichsen, C. Separation of Nanoparticles by Gel Electrophoresis According to Size and Shape. Nano Lett. 7, 2881-2885 (2007).
  16. Sweeney, S. F., Woehrle, G. H., Hutchison, J. E. Rapid Purification and Size Separation of Gold Nanoparticles via Diafiltration. J. Am. Chem. Soc. 128, 3190-3197 (2006).
  17. Clarke, N. Z., Waters, C., Johnson, K. A., Satherley, J., Schiffrin, D. J. Size-Dependent Solubility of Thiol-Derivatized Gold Nanoparticles in Supercritical Ethane. Langmuir. 17, 6048-6050 (2001).
  18. Schaaff, T. G. Isolation of Smaller Nanocrystal Au Molecules: Robust Quantum Effects in Optical Spectra. J Phys Chem B. 101, 7885-7891 (1997).
  19. Trefry, J. C. Size Selection and Concentration of Silver Nanoparticles by Tangential Flow Ultrafiltration for SERS-Based Biosensors. J. Am. Chem. Soc. 132, 10970-10972 (2010).
  20. Bhattacharjee, S., Bhattacharjee, C., Datta, S. Studies on the fractionation of & beta-lactoglobulin from casein whey using ultrafiltration and ion-exchange membrane chromatography. J. Membr. Sci. 275, 141-150 (2006).
  21. Eppler, A., Weigandt, M., Schulze, S., Hanefeld, A., Bunjes, H. Comparison of different protein concentration techniques within preformulation development. Int. J. Pharm. 421, 120-129 (2011).
  22. Creighton, J. A., Blatchford, C. G., Albrecht, M. G. Plasma resonance enhancement of Raman scattering by pyridine adsorbed on silver or gold sol particles of size comparable to the excitation wavelength. J. Chem. Soc. Faraday Trans. 2, 790-798 (1979).
  23. Pavel, I. E. Estimating the Analytical and Surface Enhancement Factors in Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS): A Novel Physical Chemistry and Nanotechnology Laboratory Experiment. J. Chem. Educ. , (2011).
  24. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
  25. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. J. Phys. Chem. B. 107, 668-677 (2003).
  26. Śileikaitċ, A., Prosyčevas, I., Puišo, J., Juraitis, A., Guobienċ, A. Analysis of Silver Nanoparticles Produced by Chemical Reduction of Silver Salt Solution. Mater. Sci. (Medziagotyra). 12, 287-291 (2006).
  27. Lewis, L. N. Chemical catalysis by colloids and clusters. Chem. Rev. 93, 2693-2730 (1993).
  28. Li, Y., Wu, Y., Ong, B. S. Facile Synthesis of Silver Nanoparticles Useful for Fabrication of High-Conductivity Elements for Printed Electronics. J. Am. Chem. Soc. 127, 3266-3267 (2005).
  29. Sun, Y., Xia, Y. Shape-Controlled Synthesis of Gold and Silver Nanoparticles. Science. 298, 2176-2179 (2002).
  30. Han, X., Zhao, B., Ozaki, Y. Surface-enhanced Raman scattering for protein detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 1719-1727 (2009).
  31. Pavel, I. Label-Free SERS Detection of Small Proteins Modified to Act as Bifunctional Linkers. J. Phys. Chem. C. 112, 4880-4883 (2008).
  32. Ladner, D. A., Steele, M., Weir, A., Hristovski, K., Westerhoff, P. Functionalized nanoparticle interactions with polymeric membranes. J. Hazard. Mater. , (2011).

Tags

Kimya Sayı 68 Biyomedikal Mühendisliği Kimya Mühendisliği Nanoteknoloji gümüş nanopartiküller boyut seçimi konsantrasyon teğet akış ultrafiltrasyon
Teğet Akış Ultrafiltrasyon: Kolloidal Gümüş Nanopartiküllerin Boyutu Seçme ve Konsantrasyon için &quot;Yeşil&quot; Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anders, C. B., Baker, J. D.,… More

Anders, C. B., Baker, J. D., Stahler, A. C., Williams, A. J., Sisco, J. N., Trefry, J. C., Wooley, D. P., Pavel Sizemore, I. E. Tangential Flow Ultrafiltration: A “Green” Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles. J. Vis. Exp. (68), e4167, doi:10.3791/4167 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter