Summary
Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.
Abstract
Atherogenese wird durch Stoffwechselstörungen, die zu einem erhöhten Zustand des systemischen Entzündung was zu einer endothelialen Dysfunktion beitragen potenziert. Allerdings sind frühe funktionelle Veränderungen im Endothel, dass die individuelle Höhe des Risikos bedeuten nicht direkt zu klinisch therapeutische Strategie Guide helfen zu beurteilen. Darüber hinaus trägt die Regulierung der Entzündung, die durch lokale Hämodynamik zu dem nicht-zufällige räumliche Verteilung der Atherosklerose, aber die Mechanismen sind schwer in vivo zu beschreiben. Wir beschreiben ein Lab-on-a-Chip-basierten Ansatz zur quantitativen Assay metabolischen Störung der entzündlichen Ereignisse in humanen Endothelzellen (EC) und Monozyten unter genauen Strömungsverhältnisse. Standardmethoden der Soft-Lithographie verwendet werden, um vaskuläre mimetischen mikrofluidischen Kammern (VMMC), die direkt an kultivierten EG Monoschichten gebunden microfabricate. 1 Diese Vorrichtungen haben den Vorteil der Verwendung von kleinen Mengen von Reagenzien, währendBereitstellung einer Plattform für direkte Abbildung der entzündlichen Ereignissen an der Membran der EG ausgesetzt zu einer gut definierten Scherfeld. Wir haben erfolgreich diese Geräte angewandt, um Zytokin-, 2 Lipid-3, 4 und RAGE-induzierte Entzündung in fünf menschlichen Aorten-EG (HAEC) zu untersuchen. Hier dokumentieren wir die Nutzung des VMMC zu Assay Monozytenzelllinie (THP-1) Roll-und Festnahme am HAEC Monoschichten, die unter Scher-Differential Eigenschaften bedingt sind und aktiviert durch die inflammatorischen Zytokins TNF-α. Studien wie diese bieten mechanistische Einblicke in atherosusceptibility unter metabolischen Risikofaktoren.
Protocol
1. Zellkultur und Untergrundvorbereitung
- Schneiden Sie 3-Zoll-kreisförmigen Substraten aus einem 100 x 20 mm Gewebekulturschale (BD Falcon) mit einer Drehbank. Sterilisieren von Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol. Platz in einer Petrischale und Mantel mit 4 ml Typ-I-Kollagen (100 pg / ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur, dann mit 4 ml 1 x PBS spülen.
- Suspend menschliche Endothelzellen (HAEC, Passage 4-6) auf 6.5x10 5 Zellen / ml und Samen, indem 1 ml direkt auf das Substrat. In einen 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator und ermöglichen Zellen auf dem Substrat 1 h lang anhaften.
- In 9 ml Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) mit 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung zu den Zellen ergänzt. Ändern Medien alle 2 Tage, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen.
- Pflegen THP-1 Zellen in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS und 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung ergänzt. Passage Zellen, wenn sie eine Dichte von 1 zu erreichen0 6 Zellen / ml.
2. Zelle Shearing Protokoll
Die Zellen werden in einem benutzerdefinierten Kegel-Platte-Zelle Schervorrichtung (CSD) konditioniert. Angaben zum Gerät und Design-Spezifikationen sind in Tabelle 1 und Abbildung 4 dokumentiert.
- Bereiten Sie den CSD. Sterilisieren Sie das Kammergehäuse mit Ethanol und Spülen mit sterilem PBS. Erhitzen des Gehäuses auf 37 ° C und Höhe, um sicherzustellen, dass der Kegel senkrecht zu der Zell-Monolayer. Montieren des Substrats mit den Zellen vom Boden des Gehäuses und stellen Sie den Kegel auf die gewünschte Höhe.
- Verwendung Leibovitz-15 (L-15)-Medium mit Endothelzellen BulletKit als Scherung Medium richtigen pH-Wert in Abwesenheit von CO 2 zu halten ergänzt. Um Entzündung stimuliert, fügen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) zu dem Medium und Scheren zu injizieren 6 ml in der Vorrichtung über eine Spritze mit einem Einlass-Anschluss, dabei nicht um Luft einzuführenBlasen in der Kammer.
- Schere Zellen mit einer hohen Größe stationären Scherspannung (HSS, 15 dyn / cm 2) oder eine oszillierende Schubspannung (OSS, 0 ± 5 dyn / cm 2, 1 Hz) für 4 Stunden. Die gewünschte SS wird durch Drehen des Konus über den Zellen, die genau mit einem Mikro-Schrittmotor, wie zuvor beschrieben gesteuert wird, erreicht 6 Die Wand SS an der Oberfläche (τ w) durch angenähert.:
wobei μ die Viskosität des Mediums ist, ω die Winkelgeschwindigkeit des Kegels, und α ist der Kegelwinkel (0,5 °). Der Kegel Ausrichtung mit dem Substrat innerhalb 0,05 ° bis Präzisionsnivellement und Spalthöhe bei 20 ± 10 mm eingestellt unter Verwendung eines Tiefenmesser Umfangsrichtung und radiale Variation τ w zu minimieren eingestellt. Das Gerät wurde validiert, um Laminar-Flow-Eigenschaften zu gewährleisten. Entfernen cEllen aus dem Gerät und bereiten Sie für die Analyse von Monozytenadhäsion.
3. Herstellung von PDMS Mikrofluidische Kammer
- Erhalten Master-Form zum gewünschten Mikrofluidkanal und Kanal Höhe abhängig von der Anwendung. Die Eigenschaften der spezifischen Design im Sinne dieses Protokolls sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Methode für die Erstellung dieser bereits gut in der Literatur dokumentiert. 1 Kurz gesagt, das Netz der Kanäle wurde entwickelt, unter Verwendung von CAD-Software (Autodesk Inventor) und bei 5000 dpi gedruckt auf Transparenz. Negativen Fotolacks (SU8) auf einem Silizium-Wafer mit einer Dicke von 100 um gesponnen. Die Transparenz überlagert und UV-Licht ausgesetzt. Nicht polymerisierten Photoresists entfernt wird, um die positive Replikat-Master zu erzeugen.
- Um PDMS Lösung Mix Silikonbasis mit Silikon-Härter 10:1 nach Gewicht in einem Boot zu machen wiegen und rühren Sie mit einem 5 ml serologische Pipette. Achten Sie darauf, den Wänden zu kratzender wiegen Boot zu verhindern, dass zusätzliche Kunststoff-Flocken zur Lösung.
- Legen Sie die Master-Wafer in einem 100x15mm Petrischale und gießen Sie die PDMS-Lösung in die Schüssel.
- Decken Sie die Schüssel und legen Sie sie in einen Vakuum-Behälter für 15 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Petrischale heraus und entfernen Sie überschüssiges Luftblasen durch vorsichtiges Einblasen von Luft über die Oberfläche.
- Platzieren Sie die Petrischale in einem Ofen für 1 Stunde bei 70 ° C Entfernen Sie die Schale und schneiden Sie die Mikrofluidik-Kammern mit einer scharfen Klinge.
4. Montage der Geräte auf Mikroskop
- Schalten Sie die Lichtquelle zu inversen Mikroskop und setzen Heizung bis 37 ° C. Befestigen Sie einen Schlauch mit einer 10 ml-Spritze und füllen Sie mit destilliertem Wasser so, dass sich keine Blasen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und eingestellten Durchsatz, eine Mauer zu SS von 1 Dyn / cm 2 zu induzieren. Die Wandschubspannung (τ w) entlang der Mittellinie des Kanals erzeugt wird, angenähert unter Verwendung des StandardGleichung für eine Parallelplatten-Strömungskammer:
wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe, und w ist die Kanalbreite. Hinweis: da die Kanäle mit endlicher Breite sind die tatsächlichen τ w mit w abhängig vom Kanal variieren Seitenverhältnis, und Messungen werden mit 25% am nächsten zu den Seitenwänden vermieden. 1,7 - Platzieren Sie PDMS Kammer in Wasser und verwenden Sie ein 100 &mgr; Mikropipette um die Luft aus den einzelnen Kanälen zu entfernen. Bringen Vakuum-Adapter, um die Kammer darauf achten, dass das Ventil ausgeschaltet ist.
- Platzieren Sie Petrischale mit HAEC Monoschicht gegenüber dem Ziel. Legen Sie die PDMS Kammer über der Petrischale und legen Sie es vorsichtig auf der HAEC Monoschicht gleichzeitig sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen dem Gerät und der Monolage zu bilden. Drehen Sie das Ventil so dass das Vakuum eingeschaltet ist und die Kammer fest angeschlossen ist. Schnitt 19 Gauge-Nadeln stumpf, so dass es nur 5 mm Metall links. Füllen Sie den Behälter mit Kunststoff-Puffer und in PDMS Kammer Eingang. Wiederholen geeignete Anzahl von Kanälen verwendet werden. Befestigen Sie Schlauch von Spritzenpumpen auf PDMS-Kanal beendet.
5. Monozytenadhäsion Assay unter Scherbeanspruchung
- Suspend THP-1-Zellen in 2x10 6 Zellen / ml in HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + + 0,1% HSA. Aktivieren THP-1-Zellen durch Inkubation mit Stromazellen abgeleiteten Faktor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) für 15 min bei Raumtemperatur.
- Schalten Sie Spritzenpumpe zum Fließen zu etablieren, dann werden 50 ul Zellsuspension zu Reservoir ohne Einbringen von Luftblasen. Sobald Flow voll entwickelt ist, beginnt die Datenerfassung.
- Ausführen für 5 min bei passende Strömungsgeschwindigkeit Hinzugeben von Puffer zu dem Reservoir, wenn die Lösung zur Neige geht. Weiter fließt Puffer in die Kanäle zu waschen alle ungebundenen Zellen in der Strömung.
6. Datenerfassung und-analyse
- Erwerben Sie digitale Bildsequenzen bei 3 Bildern / s für 2 min nach voll ausgebildete Strömung entlang der Längsachse des Kanals an 3 Standorten in den Kanal, dabei nicht zu unmittelbar nach Eingang oder vor Austrittsöffnungen oder in der 25% am nächsten der Seite aufzeichnen Wänden.
- Zähle die Anzahl der Zellen pro Feld verhaftet durch die Identifizierung ihrer Phase-hellen Erscheinungsbild in der gleichen Bildebene als Monolayer.
- Firm Zelle Verhaftung wird durch die Bewegung definiert <½ Zelldurchmesser in 10 s. Durchschnittliche Daten über 3 zufällige Felder / Kanal und Quantifizierung mittels ImageJ Software.
7. Repräsentative Ergebnisse
Obwohl das Gefäßendothel, wird gleichmäßig auf Agonisten, die eine systemische Entzündung beitragen ausgesetzt, Atherosklerose ist ein Schwerpunkt Krankheit entwickelt, die vorzugsweise an den Stellen der Strömungsstörung in Arterien, woraus folgt räumliche Heterogenität der endothelialen Funktion. 8 9, 10 TNF-α induziert eine gut charakterisierte Reaktion, die in der EG-up-Regulierung der Zelladhäsionsmoleküle (CAMs umfasst ; zB VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin) und Chemokine rekrutieren dass Monozyten aus dem Blutkreislauf, ein Markenzeichen des frühen atherosklerotischen Läsion 11 Hämodynamik ein wichtiger Regulator der endothelialen entzündlichen Phänotyp ist 12 High Größenordnung Schubspannung (HSS..; z. B. 15 dyn / cm 2) oder pulsatilen Scherspannung (PSS, z. B. 15 ± 5 dyn / cm 2) mit Seiten des Widerstandes gegen Atherosklerose in Arterien nach unten zu regulieren TNF-α-induzierte Antworten zugeordnet. Umgekehrt geringer Größe Scherspannung (LSS, zB 2 dyn / cm 2) oder oszillierende Schere (OSS; zB 0 ± 5 dyn / cm 2), die charakteristisch für Plattformen anfällig vivo verstärken cytokine-induzierte Entzündung. 13, 14 vorzusehen Unsere mikrofluidischen PDMS-Geräte eine Plattform für die Durchführung mechanistische Studien Hypothesen in Bezug auf die Überlagerung von metabolischem Stress mit hydrodynamischen Faktoren bei der Regulation der endothelialen Funktion und Pathologie zu testen. Der Nutzen und die Vielseitigkeit des Ansatzes wird im Großen und Ganzen durch die folgenden repräsentative Ergebnisse dargestellt.
Abbildung 1. Schubspannung differentiell moduliert THP-1-Zell-Adhäsion an TNF-α entzündeten Endothel-Monolayer. Diese Daten erworben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Protokoll detailliert dokumentiert und in dem Video. HAEC Monoschichten wurden gleichzeitig zu einer niedrigen Dosis des inflammatorischen Zytokins TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC 50 für VCAM-1-Hochregulierung) und entweder HSS (15 Dyn / cm 2) oder OSS (0 ± 5 dyn ausgesetzt / cm 2, 1 Hz) in einem benutzerdefinierten CSD für 4 Stunden, wie beschrieBett im ausführliches Protokoll. THP-1-Zelle Verhaftung wurde unter Scherströmung in einem PDMS Flusskammer quantifiziert. Diese Zelllinie, die den Phänotyp von menschlichen Monozyten imitiert wurde auf seine Reproduzierbarkeit und einfache Verwendung ausgewählt. HSS abgeschwächte die entzündliche Reaktion auf OSS im Vergleich, was zu einer verminderten THP-1-Zelle Verhaftung. Die Daten wurden mittels Student t-Test analysiert und sind als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Adaptiert mit Erlaubnis aus DeVerse et al. 5
Die folgenden Daten zeigen die Vielseitigkeit unseres Ansatzes anhand von Beispielen aus unserer Arbeit veröffentlicht. Abweichungen von dem obigen Protokoll angegeben, wo zutreffend.
Abbildung 2. Die Modulation der Zytokin-induzierten VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung in einer Schubspannung Gradienten. A) HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 h unter flo stimuliertw in einem VMMC ausgebildet basierend auf Hele-Shaw Flußtheorie. 15 A lineare Abnahme der SS Größe entlang der Mittellinie des Kanals wurde durch die Entwicklung der Seitenwände der Kammer, um mit den Stromlinien einer zweidimensionalen Staupunktströmung zusammenfallen und Formen des Endes erreicht der Kanal sind der ISO-Potentialleitungen. Die Wandschubspannung (τ w) entlang der Mittellinie des Kanals in einem axialen Abstand von dem Eingang (x) erzeugt wird, gegeben durch:
wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe ist, w 1 die Kanaleingang Breite und L die Gesamtlänge Kanallänge. Q gewählt wurde, um einen Gradienten in SS Größenordnung von 16 zu erzeugen Dyn / cm 2 am Einlass auf 0 im Staupunkt "a" direkt proximal des outlet. B)-C) VCAM-1-Expression wurde in situ durch Immunfluoreszenz mit Antikörpern konjugiert mit Quantenpunkten und als prozentuale mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von unstimulierten Static Control gemessen. SS nicht modulieren Grundniveau von VCAM-1, welche eine geringe unstimulierten HAEC (graue Dreiecke) ist. Jedoch erhöhte VCAM-1-Expression relativ zu TNF-α an LSS Größen, Spitzenwerte liegen bei etwa 2 Dyn / cm 2 und Zurückkehren zu dem TNF-α Baseline oder unten in Scherung Größen> 5 dyn / cm 2 (schwarze Quadrate). D) Monozyten (10 6 / ml) wurden bei 2 Dyn / cm 2 für 5 min in parallelen Strömungskanälen über Monoschichten wie in A) vorkonditioniert perfundiert. Monozytenrekrutierung an das Endothel quantitativ mit den VCAM-1-Expression bei einer gegebenen Scherbeanspruchung Größe korreliert. Vor allem die Fähigkeit, VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung mit feiner räumlicher Auflösung in einem monolaye sondierenr zeigten signifikante Unterschiede in einem engen Bereich in SS-Größe, die nicht durch die Anwendung nur einige diskrete Werte der Scherung in getrennten Experimenten wird gebeten. Die Daten wurden mittels ANOVA mit wiederholten Messungen und Differenzen von Newman-Keuls Posttest beurteilt analysiert, * P <0,05 TNF-α aus unter statischen Bedingungen. Die Daten sind Mittelwert ± SEM 3-6 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis aus Tsou et al. 2
Abbildung 3. Triglycerid-reichen Lipoproteinen (TGRL) modulieren Cytokin-induzierte Entzündung im Verhältnis zu Donor Serumtriglyceridspiegel und VCAM-1-Expression. HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 Stunden gleichzeitig mit TGRL (10 mg / dl stimuliert ApoB) aus menschlichen Probanden nach einer fettreichen Mahlzeit in statischer Kultur isoliert. A) VCAM-1-Expression wurde separat in abgehängten EG mittels Durchflusszytometrie gemessenund Monozytenadhäsion quantifiziert mit einem VMMC wie in der detaillierten Protokoll beschrieben. Die Daten sind als% Wechsel von TNF-α dargestellt. Monozytenarrest in direktem Verhältnis zur endothelialen VCAM-1-Expression, die direkt mit der Höhe der Serum-Triglycerid-Donor erhöht. B) Monozytenarrest für eine Teilmenge von pro-inflammatorischen Spender in der Gegenwart eines VCAM-1 blockierenden Antikörpers aufgehoben wurde variiert. Bedeutung von gepaarten Student t-Test wurde ermittelt, bedeutet ± SEM 3-5 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis von Wang et al. 4
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Discussion
Wir beschreiben die Verwendung von mikrofluidischen PDMS Vorrichtungen zur On-Chip-Bewertung der endothelialen entzündlichen Phänotyp durch die Echtzeit-Bildgebung von CAM-Expression und Monozytenadhäsion. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes liegt in der Fähigkeit, die Ergebnisse mit einer endothelialen Dysfunktion in Zellen, die Entzündungsmediatoren wie diätetische Lipide und Zytokine unter definierten hydrodynamischen Bedingungen, die Schubspannung spiegeln in atherogenen Gefäßen zu quantifizieren. Die VMMC erleichtern die Nutzung von kleinen Mengen an Reagenzien oder Materialien, die nur begrenzt verfügbar sein können und haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie preiswert, individuell anpassbar und zugänglich für hohen Durchsatz.
Die Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen stellt eine Alternative zu makroskopischen Ansätzen, die seit Jahrzehnten verwendet, um die Reaktion von kultivierten EG zu scheren zu untersuchen. Dazu gehören Parallel-Platten-Flow Kammern, zylindrische Rohre und Kegel-Platte-Viskosimeter, von denen jede ca. istPable der Verhängung von stationären, laminaren Strömungsverhältnissen Poiseuille (Übersicht in 16). Änderungen dieser Geräte produzieren können zeitliche oder räumliche Variationen in Wandschubspannung oder sogar rekapitulieren arteriellen Wellenformen. 6 jedoch in der Regel sind diese Geräte benötigen eine große Menge an Medien, sind teuer in der Herstellung, weniger anpassungsfähig, und leiden unter vergleichsweise geringem Durchsatz.
Einschränkungen auch unter Verwendung der VMMCs abgegeben. Diese Geräte basieren auf Parallel-Platten-Flow-Theorie, die unendliche Weite übernimmt konzipiert. Dies ist eine vernünftige Annahme für Geräte, bei denen Makroskala Breite ist viel größer als die Höhe. Jedoch erfordert die endliche Breite der mikrofluidischen Kanälen, die Arbeiten entlang der Mitte der Längsachse des Kanals an der Seitenwand zu eliminieren durchgeführt werden, da die tatsächliche τ w mit w abhängig vom Kanal Seitenverhältnis variieren. 1, 7 Ähnlich , werden die Messungen nicht in der Nähe t genommeno die Ein-und Ausfahrt der Kanäle auf Eingang zu vermeiden. Wir haben keine signifikanten Auswirkungen parakrine Signalisierung oder Entzündungen, die durch Verletzungen oder Schäden an EC durch Abdichten des Geräts an die Monoschicht als Beitrag zu unserer beobachteten Reaktionen hervorgerufen induziert regiert. PDMS hat eine hohe Affinität für hydrophobe Moleküle, die zur Absorption von sezernierten Chemokine und nicht-spezifische Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und der VMMC führen könnte. Allerdings haben wir nicht festgestellt, dass dies ein Problem sein, für die Dauer unserer Studien. 2
Die Verwendung von Flow-Geräte mit kultivierten Zellen stellt einen reduktionistischen Ansatz, der mechanistischen Studien und die Demonstration von Ursache und Wirkung erleichtert in Bezug auf Scherbeanspruchung. Allerdings ist eine Beschränkung von einem In-vitro-Ansatz die Annahme, dass es angemessen zu rekapitulieren, die Komplexität der Umwelt im nativen Arterien. In vivo Endothelzellen chronisch werden, um komplexe Strömungsmuster angepasst undunterliegen Wechselwirkungen mit anderen Zellen, Matrix und humoralen Mediatoren, die ihr Verhalten zu regulieren.
Es ist bemerkenswert, dass alle der oben dargestellten Ergebnisse der kurzfristigen Modelle und als solche kann nicht zeitlich invariant. Jedoch sind sie repräsentativ für Experimente, die man gewöhnlich durchgeführt, um den Mechanismus nach einem akuten entzündlichen Herausforderung zu untersuchen. Eine entsprechende Strategie für unsere Studien ist es, Veränderungen von einer entzündlichen Grundlinie von niedrig dosiertem TNF-α Stimulation, für die 4 Std. repräsentiert die ungefähre Gipfel in VCAM-1-Expression zu überwachen. Wir haben in mehreren Studien dokumentiert, dass Änderungen in der Oberflächen-Expression von VCAM-1 mit verbesserten Monozytenrekrutierung korrelieren unter diesen Bedingungen. 2-4, 17
Darüber hinaus kann die Wahl des SS Wellenform hervorzurufen Differential endothelialen Reaktionen. In unserer repräsentativen Protokoll dokumentieren wir die Nutzung des VMMC zu Monozytenadhäsion Ereignisse in HAEC unter s konditioniert quantifizierenhören Spannungen gewählt Vertreter Seiten der relative Widerstand (HSS) und Empfindlichkeit (OSS) Atherogenese in Arterien in einem benutzerdefinierte Zelle Schervorrichtung sein. In Übereinstimmung mit früheren Befunden in kultivierten EG, HSS abgeschwächten Reaktion auf die Zytokin-Aktivierung in Bezug auf OSS. 12, 13 Die Ergebnisse sind konsistent mit einer größeren Freizügigkeit zu inflammatorischen Aktivierung des EG an den Standorten von Strömungsstörung in vivo. Während diese Bedingungen häufig verwendet, um ungestörter und gestörter Strömung jeweils für sie nicht voll rekapitulieren die Komplexität der Strömung in den Arterien. Allerdings unterstützt eine Fülle von Literatur ihre Verwendung als einfache Annäherungen, die adäquat reproduzieren die hervorstechenden Merkmale fließen. 14
Insbesondere ist unser Kegel-und-Platten-basierenden CSD in der Lage Erzeugen komplexer Signale und Konditionierung Zellen für längere Zeiträume, wie zuvor berichtet. 6 So Koppeln des VMMC mit dem CSD in der beschriebenen protocol vermittelt ein Höchstmaß an Flexibilität. Eine Betrachtung dieses Ansatzes besteht in der Ausrichtung des VMMC mit Bezug auf die Richtung der Scherung Anlage in den CSD, bei dem HAEC Erfahrung Strömung in der Umfangsrichtung. In der Praxis ist die VMMC so ausgerichtet, dass die Kanäle parallel zu der Strömung und der Einlaß stromaufwärts von konditionierten Zellen so weit wie möglich sind. Die Kanäle sind klein genug, dass diese eine angemessene Annäherung darstellt. Wir haben aber auch gezeigt, in einer früheren Studie, der fließt, Monozyten parallel oder senkrecht zur Richtung der Scherung Klimaanlage im VMMC hatte keinen Einfluss auf die Ergebnisse in 2 gezeigt. 2
Weitere Überlegungen mit in vitro-Verfahren sind die Variabilität durch phänotypische Drift mit serielle Passage der EG in der Kultur und Heterogenität in isolierten Monozyten oder EG assoziiert induziert. HAEC sollte in der Regel durch den Durchgang 6 und jede Menge verwendet werdendadurch gekennzeichnet für eine einheitliche entzündliche Reaktion auf TNF-α. Verwendung einer Zelllinie, wie THP-1 zu reduzieren, die Variabilität bei der Verwendung von Monozyten, die in der Aktivität von Donor variieren und können leicht durch ihre Isolierung aktiviert zugeordnet. Um zu gewährleisten, reproduzierbare und genaue funktionelle Positionsanzeigen Zellpräparation und Umsteigezeiten minimiert werden sollte. Die sorgfältige Auswahl der Kontrollen ist notwendig, um eine sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Je nach Experiment, könnte dazu gehören unbehandelten oder statisch-kultivierten Zellen, TNF-α Behandlung nichtaktivierten THP-1 Zellen, die Verwendung von blockierenden Antikörpern, siRNAs oder pharmakologischen Inhibitoren und andere.
Als Beweis für die Vielseitigkeit des Ansatzes, haben wir diese Geräte an Zytokin-, 2 Lipid-3, 4 und RAGE-induzierte Entzündung in 5 HAEC untersuchen angewendet. Unsere Studien haben inklusive Messung der entzündlichen Potenzial der Serum-derived Lipidpartikel aus menschlichem subjects auf Endothelzellen 3, 4 und Monozyten. 17 eine alternative Strategie kann Monozyten mit Substrate mit immobilisierten derivatisierten wie VCAM-1, um die Haftung Mechanismen zu untersuchen vorgelegt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes wir früher gezeigt für eine mögliche Rolle des Adhäsionsmoleküls CD11c, die mit sehr späten Antigens (VLA) -4 in Monozytenarrest an VCAM-1 zusammenwirkt während der Dyslipidämie bei Menschen 17 und Mäusen. 18 Da Monozyten leicht aktiviert werden ihre Isolation, entwickelten wir auch eine Vollblut-Assay für den Einsatz mit unserem Labor-Chip-Baustein für mehr empfindliche und reproduzierbare Detektion zu ermöglichen. 17
Letztlich neben der Bereitstellung Einblick in die frühe entzündliche Ereignisse zugrunde liegen, Atherosklerose, ist unsere Vision, dass diese Technologie Entwicklung wird zu treuen Ex-vivo-Ansätze für die Beurteilung das individuelle Risiko von Entzündungen-vermittelten kardiovaskulären Erkrankungen führen und damit den Way für die Entwicklung personalisierter Diagnostik, die auf die Monozyten-und EC-Aktivierung zu berichten.
| Kegel-Platte-Zelle Schervorrichtung | ||
| Kegelradius | 0,06985 | m |
| Kegelwinkel | 0,00877 (0,5 °) | rad (Grad) |
| Spalthöhe | 20 ± 10 | um |
| Max Angular Velocity (für Experimente hier skizzierten) | 18,85 | rad / s |
| Kinematische Viskosität | 0,00077 | m 2 / s |
| Max R-Nummer (für Experimente hier skizzierten) | 0.000758 | dimensionslose |
| VMMC Spezifikationen | ||
| Channel-Länge | 8,0 | mm |
| Kanalhöhe | 60 | um |
| Kanalbreite | 2 | mm |
| Reynolds-Zahl | 1,67 | dimensionslose |
Tabelle 1. CSD und VMMC Spezifikationen.
Abbildung 4. Querschnittsansicht der Konus-Platte-Zelle Schervorrichtung (CSD). Die CSD besteht aus einem rostfreien Stahl zylindrischen Kegels, die oberhalb einer stationären Zellkultursubstrat dreht. Die Kegelwinkel und Spalthöhe sind kritische Parameter, die die Art des Scherfeldes in Gegenwart von Kulturmedium hergestellt definieren. Eine modifizierte Reynolds-Zahl, die die Beziehung der Zentrifugalkraft, um Reibungskräfte ist gegeben durch:
<br />
wobei r mit einem Radius ist, ω ist die Winkelgeschwindigkeit ist Kegelwinkel α und ν die kinematische Geschwindigkeit des Fluids. Wenn R << 1 Fliehkräfte sind niedrig, laminar ist und rein azimutale und die induzierte Scherbeanspruchung konstant über der Monolage. 19 In unserer CSD, wird das Substrat mit kultivierten Zellen von unten in die Kammer geladen, die die Häuser Kegel. Das Medium wird in die Kammer eingebracht und für die Scherung Fluid. Der Kegel wird mit vorinstallierten Präzisionslager und die Drehung von einem Mikro-Schrittmotor angetrieben wird. Ein Präzisions-Nivellierautomatik hält Ausrichtung senkrecht zu der Zell-Substrat. Die Spalthöhe (definiert durch den Abstand von der Spitze des Kegels, der Zell-Substrat) mit einem Hochpräzisions-Tiefenmesser eingestellt. Ein Fett-fangen und Medien Dichtung vorhanden sind, um sicherzustellen, dass die Kammer die Unterbringung der Zellen stets sauber und frei von Öl und Schmutz.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschuss R01 HL082689 zu Scott I. Simon und Anthony G. Passerini unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
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