Summary
В патогенезе костных метастазов, ангиогенез является важным процессом и, следовательно, представляет собой мишень для визуализации и терапии. Здесь мы представляем крысиной модели конкретных участков груди метастазы рака костей и описать стратегии неинвазивно изображения кровеносных сосудов
Protocol
1. Культуре клеток
- Культура MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы (Американская коллекция типовых культур) в RPMI-1640 (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% FCS (Sigma, Германия). Держите всех культур в стандартных условиях (37 ° C, увлажненной атмосфере 5% CO 2) и прохождение клеток 2-3 раза в неделю, чтобы держать их в логарифмического роста. Для животных моделях, описанных ниже, нет необходимости для использования в костной сублиний MDA-MB-231 клеток опухоли скорость взять более 90% 1.
- Урожай суб-сливной опухолевых клеток после использования 2 мМ ЭДТА в PBS-(фосфатно-солевом буфере без Са 2 + и Mg 2 +) и 0,25% трипсина (Sigma, Тауфкирхен, Германия). Граф MDA-MB-231 клеток в камере Нойбауэр и приостановить их в RPMI-1640 (5x10 5 клеток в 1 мл).
2. Обнаженная модель крысы костных метастазов
- Все эксперименты были одобрены ответственными правительственными анимал комитета по этике.
- Используйте обнаженной крыс в возрасте 6-8 недель и держать их на возбудителя без условий в соответствующей небольшой системы животного (например, мини-барьер системы). Держите животных в контролируемых условиях (21 + / - 2 ° C комнатной температуры, влажности 60% и 12 час свет-темнота ритма) и предлагают автоклавного корм и воду без ограничений объявление на крысах.
- Прежде чем животное операции, вводят обезболивающий препарат (например, Carprofen 4 мг / кг подкожно, в связи с его однократного введения и коротким периодом полувыведения (около 8 часов), carprofen не должны влиять на рост опухоли). Обезболить крыс смесью кислорода (0,5 л / мин) и ИФ (1-1,5% об.) И убедитесь, что крысы под наркозом правильно и регулярно вдыхает до начала следующей процедуры.
- Положите под наркозом животным под соответствующий операционный микроскоп бинокулярный (например, Leica) и работать с увеличением в 16 раз.
- Начало хирургического вмешательства путем разрезания кожи и подкожной клетчатки в ИнгуИнал области при длине 2-3 см с помощью ножниц (BC060r Iris ножницы 108 мм). Все артерии, отходящие в бедренную артерию (ФА) должны быть расчлененным в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА).
- Поместите клипы на бедренной артерии проксимальнее происхождения СЭО, а также на DGA, PA и SA на временно закрывают местный кровоток. Перевязывать моря в его дистальной части, чтобы открытие этого судна без кровотечения (рис. 1а).
- Разрежьте SEA с помощью ножниц (Vannas Micro-SCRS протектором STR 85 мм) из проксимальных перевязки (рис. 1б) и управления 1% папаверин решение на море, чтобы облегчить последующие вставки иглы за счет расслабления сосудов ( Рис 1С).
- Отрежьте примерно половина диаметра моря с ножницами и вставить иглу (0,3 мм и 42 мм длиной) в просвет на море, holdiнг разреза конца сосуда с пинцетом (рис. 1D, E). Если возможно, фиксировать иглу в внешнее устройство к снижению нелегальной движений, которые могут привести к перфорации стенки сосуда. Подключите шприц с иглой. Удалить клип из дистального Англии и разместить его на подкожной артерии (рис. 1F).
- Вводите MDA-MB-231 приостановлены клеток в 0,2 мл среды медленно в море. В силу клипы MDA-MB-231 клеток направлены на DGA и ПА. Вытащите иглу и перевязывать море, чтобы предотвратить кровотечение перед взлетом артерии клипов. Закройте рану с помощью хирургического клипы и прекратить ингаляционной анестезии.
- Для пост-процедура наблюдения, крысы, как правило, усыпляют 7-8 недели после прививки опухоли клетки, чтобы избежать тяжелых костных осложнений. За это время животные должны контролироваться ежедневно оценить размер опухоли и каких-либо признаков боли (например, поведенческие отклонения, потеря веса, двигатель дефекты). Если животные показать опухольразмер превышает допустимый предел этически или свидетельство о боли во время роста опухоли, они должны быть умерщвлены.
- Иммуно-дефицитные (ню) крыс были использованы для ксеногенной трансплантации человеческих MDA-MB-231 клеток рака молочной железы. Голая крысы не были выбраны, чтобы лучше представить себе растущую опухоль.
3. Магнитно-резонансная томография (МРТ)
- После прививки опухоли клетки, позволяющие приблизительно 25-30 дней роста опухоли до начиная с изображениями. Для МРТ использовать специальный сканер или экспериментальной системы человека MR с соответствующей катушкой животных. Мы использовали человеческие MR системы (симфонии, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации, выполненная в виде цилиндрического объема резонатора с внутренним диаметром 83 мм и полезная длина 120 мм (рис. 2A).
- Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью крана е. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 0,1 ммоль / кг Gd-DTPA примерно 0,5 мл; Магневист, Bayer Schering-Германия).
- Положите крысу в системе MR поддержания ингаляционной анестезии. Начнем с последовательности морфологических MR, чтобы найти костных метастазов (например, Т2 взвешенное: турбо последовательности спинового эха, TR 3240 мс, TE 81 мс матрицей 152 х 256, угол обзора 90 х 53,4 мм 2, толщина среза 1,5 мм, 3 средних, сканирование Время 3:40 мин).
- Определить кусочек костных метастазов с большим диаметром и начать последовательность DCE-MRI (например, насыщенность восстановление турбо мигания, TR 373 мс, TE 1,86 мс матрицей 192 х 144, угол обзора 130 х 97,5 мм 2, толщина среза 5 мм, измерение 512, в среднем 1, время сканирования 6:55 мин). После примерно 30 секунд, начала вводить контрастное вещество в течение периода времени от 10 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения МРТ примерно 15-20 минут на одно животное.
- Выберите подходящую систему КТ, либо человека или экспериментальных сканера. Здесь мы использовали прототип плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (рис. 2В; Объем КТ, Siemens, Германия).
- Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 1 г йода на кг примерно в 0,5 мл; Imeron 400 Бракко, Германия).
- Положите крысу на сканере при ингаляционной анестезии. Используйте следующие параметры сканирования для ДКТ: трубки напряжение 80 кВ, ток трубки 50 мА, время сканирования 51 сек, скорость вращения 10 секунд, кадров в секунду, 120, матрицы 512 х 512 и толщина среза 0,2 мм. Вводите контрастное вещество во втором вращения плоской системы управления. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения ДКТ экспертизы составляет примерно 5-10 минут в анимдр..
- Реконструкция изображений с модифицированной FDK (Фельдкамп-Davis-Кресс) в конусе лучей алгоритм восстановления (ядро H80a, Афра, Германия).
5. Ультразвуковое исследование (США)
- Экспериментальные и клинические США системы для этой цели. Мы использовали клинические системе Acuson Sequoia 512 Ультразвуковая система с линейным датчиком 15L8 (рис. 2, Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
- Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий микропузырьков контрастного вещества (например, 1,6 мл / кг около 0,5 мл; SonoVue, Бракко, Италия). Закрепите датчик США на соответствующей задней ноги штатива и применять гель США между датчиком и задние ноги.
- Выполните B-режиме (частота передачи: 17 МГц; механический индекс: 0.51) для определения наибольшего диаметра костных метастазов и установить датчик в тсвою позицию. Добавить доплеровский сигнал на В-режим изображения для получения информации о тканевой перфузии. Пожалуйста, имейте в виду, что только поражения, которые нарушают кортикальной кости доступны в США волн.
- Для динамической контрастности повышенной США (DCE-US), настройки устройства США в каденцию отличие импульса последовательности (CPS) режиме (частота передачи: 7 МГц; механический индекс: 0.18), вводят микропузырьков и записывать кино петля длиной 90 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения экспертизы США составляет примерно 10-15 минут на одно животное.
6. Постобработка данных изображений
- Использование морфологического информации от МРТ, ДКТ и США характеризуют мягкие ткани опухоли (МРТ, США) и скелетных уничтожения (ДКТ) костных метастазов и определения местоположения, размер повреждения и объем поражения с DICOM Viewer (например, Osirix Dicom Viewer).
- Для получения ветвления сосудов в метастазах в кости (ангиография), ДКТ данные могут быть использованы. Повторнопостроить 2D или 3D-изображения, используя информацию артериальной фазы с или без методов вычитания (например, Osirix Dicom Viewer).
- Для количественной оценки показателей васкуляризации от DCE-MRI, DCE-VCT и DCE-США, использовать программные средства для конкретных условий. Для DCE-MRI, определить амплитуду сосудистые параметры (связанные с объемом крови) и обменного курса к постоянной р (связанные с перфузии и судно проницаемости) в костных метастазов с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия) на основе двух- Отсек модель Brix 8,9. Альтернативные фармакокинетические модели для оценки имеются, например, Tofts модель 10.
- Для количественной оценки DCE-VCT данных, выполнять описательный анализ данных для расчета параметров, таких как площадь под кривой (AUC) и пик повышения (PE) с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия).
- Количественной информации в режиме реального времени DCE-американского использования количественных программного обеспечения для анализа (например, Qontrasт, Бракко, Италия), анализируя кино-петли в соответствии с моделью осуществляется введение болюса. Поместите области интереса (ROI) в костных метастазов, определение или описательным такие факторы, как площадь под кривой или количественные параметры из цветных карт, например, региональные объема крови, регионального кровотока и время заполнения.
7. Представитель Результаты
После внутриартериального введения MDA-MB-231 клеток в море (рис. 1), сайт-специфические метастазы в кости развиваются в соответствующих задние ноги обнаженной крысы. Остеолитические поражение ограничивается бедра, голени и малоберцовой кости могут быть отображены неинвазивно с помощью МРТ, ДКТ и США (рис. 2), начиная примерно 25-30 дней после инъекции и после-до нескольких недель. При объединении МРТ, ДКТ и США, включая родных и контрастным усилением техники, дополнительная информация может быть оценен в костных метастазов, которые состоят из мягкой тканиопухоли (опухолевых клеток и стромы) и соответствующие поражения остеолитические (костной деструкции). Для сравнения соответствующих данных между методами, все три формы изображения могут быть использованы последовательно в том же крыса. МРТ показывает морфологии костного метастатического мягких тканей, что изначально ограничены полости костного мозга, а затем превышает кортикальной кости в процессе развития. Функциональные параметры, такие как региональные объем крови, перфузии и судно проницаемость может быть получена от DCE-MRI и количественно (рис. 3). Структура кости и, в частности остеолитические изменений в метастазах оценивается в высоком разрешении по ДКТ. В дополнение к МРТ, остеолитические поражения расположены рядом с интрамедуллярного рост опухоли. ДКТ ангиография выявляет измененные архитектуры macrovessel метастазов в кости, и DCE-VCT отображает соответствующие аспекты микроциркуляции (рис. 4). В связи с локального разрушения кортикальной кости в metastatiС поражением США применяется для оценки морфологических и функциональных особенностей мягких тканей опухоли с использованием B-режима и доплеровского методов. По заявлению микропузырьков, DCE и США позволяет в режиме реального времени изображения васкуляризации метастазы в кости (рис. 5).
Рисунок 1. Задние ноги обнаженной крысы готовы к опухоли клетки прививки изображение получено путем операции микроскопом. , Ветвящиеся структуры бедренной артерии (FA) в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА). Артериальная клипы размещены на СА, ПА и проксимальных Англии, а также перевязки МОРЕ, В, SEA была вырезана из проксимальных перевязки, C, мышечная релаксация море после того папаверина, D, разрез по СЭО (подхвачена щипцы), E, введение иглы в море, F, фиксируется игла в море (внешний Fi xating устройства) и инъекции MDA-MB-231 опухолевых клеток по СЭО в DGA и ПА в силу клипов.
На рисунке 2, человеческая система MR (Симфония, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации помещен в сканер;. B, плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (КТ том, Siemens, Германия), C, клинической ультразвуковой системы Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
Рисунок 3. Осевая MR разделов. Левая панель, T2w МРТ, средняя панель, амплитуда (DCE-MRI), правая панель, обменный курс к постоянной р (DCE-MRI). Стрелки указывают на метастазы в кости. Цветовую карту для DCE-MRI данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).
78/4178fig4.jpg "/>
Рисунок 4. 3D реконструкции ДКТ в остеолитические метастазы кости (левая панель) и ангиография (средняя панель), а также DCE-VCT раздел ориентации осевой от повышения параметров пик (справа). Цветовую карту для DCE-VCT данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).
Рисунок 5. США изображений в В-режиме (морфология, на левой панели), доплеровский (перфузии, средняя часть) и CEUS (на правой панели, максимальное повышение после инъекции микропузырьков в реальном масштабе времени изображений васкуляризации) из костных метастазов.
Справочная фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод вызывая экспериментальные метастазы в кости, представленные здесь, в сочетании с изображениями процедуры позволяют последующих остеолитические поражения в обнаженном крыс в продольном направлении. В нашей модели MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы вводят в море, которое анастомоза между подвздошной артерии через pudendoepigastric ствола и бедренной артерии. Таким образом, приток крови в область поставляется в коленном суставе сохраняется после перевязки СЭО. Преимущества этой модели по сравнению с установленным образцам костных метастазов являются сайт-специфические появление метастазов в кости по сравнению с моделью внутрисердечных инъекций 11 и включение патогенных процессов опухолевых клеток и кровоизлияние миграции в ткани-мишени по сравнению с Модель голени инъекций 12. Кроме того, в этой модели системной нагрузки опухоли, в частности, висцеральный распространения опущен, который позволяет для продольного исследования по себеveral недель, и таким образом позволяет снизить необходимую животных 1,13.
Роль ангиогенеза в качестве основных процесса, направленного на пролиферацию опухолевых клеток и вызывает резорбции костной ткани в патогенезе костных метастазов было ранее продемонстрировано в экспериментах исследования естественных 14,15. Здесь мы представляем в естественных методов визуализации для неинвазивно оценить ангиогенез в этих поражениях применением МРТ, ДКТ и США. Использование обнаженной модели крысы, дополнительную информацию, васкуляризации в том числе информацию о функциональных объема крови и проницаемость судно / перфузии (DCE-MRI, DCE-VCT), судно морфологии в высоком разрешении (ДКТ ангиография), перфузии (США Доплера) и в режиме реального времени визуализации васкуляризации (DCE-US) может быть получена 1-7,16.
Визуализация ангиогенных параметров с помощью МРТ, ДКТ и США позволяет выяснения патогенетической роли ангиогенеза в скелетных метастазов неинвазивным и в естественных условиях 3,4,6. Еще одно применение вышеупомянутых методов визуализации является исследование терапевтического эффекта в продольных исследованиях на антиангиогенного или стандартной терапии для скелетных метастазов. Для демонстрации фармакологический ответ, продольных исследований, охватывающих до 70 дней после прививки опухоли клетки с группой размеры от 8 до 17 крыс были выполнены для демонстрации противоопухолевой, анти-ангиогенеза и анти-резорбтивного эффекта 2-7,17. В связи с применением методов визуализации на сканеры для человека в животное клинически значимые модели, представленной процедуры высоких поступательных значение для оценки ответа на лечение у больных с метастазами в кости 16.
В заключение, используя этот сайт-специфические животных моделях рака молочной железы, метастазы в кости, морфологические и функциональные аспекты ангиогенеза могут быть отображены неинвазивным и в естественных условиях
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 и SFB-TR 79, туберкулезом и DK). Авторы хотели бы поблагодарить Ренате Bangert Карин Leotta и Лиза Зейлера за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | American Type Culture Collection | HTB-26 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 61870 | |
| FCS | Invitrogen | 10270 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300 | |
| Carprofen Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | PZN 110208 | |
| Magnevist | Bayer-Schering | PZN 6961516 | |
| Imeron 400 MCT | Bracco | PZN 228654 | |
| SonoVue | Bracco | PZN 1567358 | |
| Papaverin | Alfa Aesar | L 04152 | |
| Isofluran | Baxter Internationl Inc. | HDG 9623 | |
| Symphony (Magnetic resonance imaging) | Siemens AG | ||
| Volume CT (Volumetric computed tomography) | Siemens AG | ||
| Acuson Sequioa 512 (Ultrasound) | Siemens-Acuson |
References
- Bäuerle, T. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).
- Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W., Bäuerle, T. Sorafenib tosylate and paclitaxel induce anti-angiogenic, anti-tumor and anti-resorptive effects in experimental breast cancer bone metastases. Eur. J. Cancer. 47, 277-286 (2010).
- Bäuerle, T. Cilengitide inhibits progression of experimental breast cancer bone metastases as imaged noninvasively using VCT, MRI and DCE-MRI in a longitudinal in vivo study. Int. J. Cancer. 128, 2453-2462 (2011).
- Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: a longitudinal in vivo study. Clin. Cancer Res. 16, 3215-3225 (2010).
- Bäuerle, T. Imaging anti-angiogenic treatment response with DCE-VCT, DCE-MRI and DWI in an animal model of breast cancer bone metastasis. Eur. J. Radiol. 73, 280-287 (2010).
- Bäuerle, T. Bevacizumab inhibits breast cancer-induced osteolysis, surrounding soft tissue metastasis, and angiogenesis in rats as visualized by VCT and MRI. Neoplasia. 10, 511-520 (2008).
- Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging anti-angiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. , Forthcoming (2012).
- Brix, G. Pharmacokinetic parameters in CNS Gd-DTPA enhanced MR imaging. J. Comput. Assist. Tomogr. 15, 621-628 (1991).
- Brix, G. Microcirculation and microvasculature in breast tumors: pharmacokinetic analysis of dynamic MR image series. Magn. Reson. Med. 52, 420-429 (2004).
- Tofts, P. S. Estimating kinetic parameters from dynamic contrast-enhanced T(1)-weighted MRI of a diffusable tracer: standardized quantities and symbols. J. Magn. Reson. Imaging. 10, 223-232 (1999).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48, 6876-6881 (1988).
- Kjonniksen, I., Winderen, M., Bruland, O., Fodstad, O. Validity and usefulness of human tumor models established by intratibial cell inoculation in nude rats. Cancer Res. 54, 1715-1719 (1994).
- Bäuerle, T. Treatment of bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells with an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Oncol. 28, 573-583 (2006).
- Andersen, T. L. A physical mechanism for coupling bone resorption and formation in adult human bone. Am. J. Pathol. 174, 239-247 (2009).
- Nyangoga, H., Mercier, P., Libouban, H., Basle, M. F., Chappard, D. Three-dimensional characterization of the vascular bed in bone metastasis of the rat by microcomputed tomography (MicroCT). PLoS One. 6, e17336 (2011).
- Bäuerle, T., Semmler, W. Imaging response to systemic therapy for bone metastases. European Radiol. 19, 2495-2507 (2009).
- Bretschi, M. Cilengitide inhibits metastastic bone colonization in a nude rat model. Oncol. Rep. 26, 843-851 (2001).
