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Immunology and Infection

एक स्टेम सेल आधारित जीन थेरेपी ट्यूमर मॉडल के रूप में बीएलटी humanized माउस का प्रयोग

Published: December 18, 2012 doi: 10.3791/4181
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 4, 1,2,3, 1,2,5
1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

और humanized चूहों का उपयोग ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लक्षण वर्णन वर्णित है यहाँ. मानव thymic ऊतक और आनुवंशिक रूप से संशोधित मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं immunocompromised चूहों में प्रतिरोपित कर रहे हैं. एक इंजीनियर मानव प्रतिरक्षा विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के vivo परीक्षा में के लिए अनुमति प्रणाली के पुनर्गठन में यह परिणाम है.

Protocol

बीएलटी चूहों के ए पीढ़ी

भ्रूण ऊतक और CD34 मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की तैयारी के प्रसंस्करण (1), (2) मानव ऊतक के प्रत्यारोपण, और (3) माध्यमिक प्रत्यारोपण: बीएलटी चूहों की पीढ़ी तीन (3) भागों में विभाजित किया गया है. सभी प्रोटोकॉल के लिए, हम अभिकर्मक जानकारी के साथ तालिका 1 प्रदान की है.

1. ऊतक और CD34 मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के प्रसंस्करण अलगाव

ताजा भ्रूण ऊतक या ऊतक विभिन्न अंग खरीद एजेंसियों से बर्फ पर रातोंरात भेज इस्तेमाल किया जा सकता है. अक्सर भ्रूण ऊतक बाँझ नहीं है, के रूप में मध्यम आसपास के प्रति मिली लीटर खून अगर पर 1,000 जीवाणु कॉलोनियों के उत्पादन से सबूत. हम नियमित ऊतक दो बार धोने बाँझ पीबीएस के 40 मिलीलीटर में. हालांकि यह सभी बैक्टीरिया को दूर नहीं करता है, यह एक सफल प्रत्यारोपण श्रृंखला और एक परिणाम में जो प्राप्तकर्ता चूहों के अधिकांश में बैक्टीरियल शिकार के बीच एक फर्क कर सकतेfection. एक जोड़ा कदम के रूप में, आगे ऊतक कीटाणुरहित, हम एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में सेल निलंबन संस्कृति.

भ्रूण Thymic ऊतक का 1.1 प्रसंस्करण

  1. ब्लीच का एक बीकर में मध्यम डालने के लिये और स्केलपेल का उपयोग करने के लिए ब्लीच में फिसलने से ऊतक को रोकने के द्वारा thymus धो लें. पीबीएस के साथ ट्यूब भरें. कैप और एक बार कुछ पलटना thymus धो लो. ब्लीच में पसाना तैरनेवाला. दोहराएँ.
  2. RPMI की 8 मिलीग्राम में थाइमस ऊतक + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम एक 60 मिमी और 1.5 से 2 मिमी दो नलियां के साथ टुकड़ों में पकवान कतरनी में रखें. नलियां साथ कर्तन फाड़ और हानिकारक ऊतक बिट्स minimizes. क्षतिग्रस्त ऊतकों की सूजन, चिपचिपा, और प्रत्यारोपण सुई में आकर्षित करने के लिए मुश्किल हो जाता है. प्राप्त बिट्स की संख्या transplantable चूहों पर पहली ऊपरी सीमा है.
  3. एक T25 फ्लास्क में एक 25 मिलीलीटर pipet (ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए) के साथ निलंबित बिट्स स्थानांतरण. फ्लास्क और संस्कृति के लिए (Zosyn) piptazo की 70 μl रातोंरात जोड़ें 2. यह काफी contaminating बैक्टीरिया को कम कर देता है. यदि आप ऊतक टाइपिंग या किसी भी अन्य phenotyping assays करना चाहते हैं, कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर ले.

भ्रूण ऊतक जिगर के 1.2 प्रसंस्करण

  1. 1.1.1 कदम के रूप में जिगर धो लें.
  2. Iscove एक 100 मिमी पेट्री डिश में मध्यम और पसाना सब कुछ के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. दो नलियां, छोटे टुकड़ों (~ 3 मिमी) में जिगर पासा. यदि आप सफेद संयोजी ऊतक में चलाते हैं, यह से जिगर परिमार्जन और यह ब्लीच में त्यागें.
  4. यह एक 12 मिलीलीटर सिरिंज में एक 16 गेज कुंद सुई 3 या 4 बार और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित करने के साथ फिट चूसने से ऊतक homogenize.
  5. ऊतक पाचन के लिए एंजाइमों के रूप में निम्नानुसार तैयार: कोलैजिनेज प्रकार (1 मिलीग्राम / एमएल) चतुर्थ, hyaluronidase (1 मिलीग्राम / एमएल), DNase मैं (2 / यू: के Iscove एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर, प्रत्येक के 200 μl जोड़ें मिलीलीटर) है.
  6. एक 12 मिलीलीटर सिरिंज में एंजाइमों ड्रा और यह एक 0.22 μ फिल्टर के साथ फिट. Enzy फ़िल्टरमुझे / सेल निलंबन में सीधे मध्यम.
  7. कैप और Parafilm के साथ कोशिकाओं सील. 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएँ.
  8. एक 100 μ सेल झरनी के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब सेट. Pipet सेल इस झरनी के माध्यम से पचाने.
  9. कोशिकाओं पीबीएस जोड़ें 50 मिलीलीटर मात्रा में लाने के. 25 मिलीलीटर की दो नलियों में इस भाजित.
  10. Ficoll की 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं बुनियाद. ब्रेक के बिना 20 मिनट के लिए 2400 rpm पर स्पिन.
  11. इंटरफ़ेस मोटी होना चाहिए. यह 5 मिलीग्राम pipet और एक और ट्यूब को हस्तांतरण के साथ बाहर चूसना. आप अंतरफलक के दो नलियों होना चाहिए. प्रत्येक और 1,200 rpm पर 10 मिनट के लिए स्पिन पीबीएस के 50 मिलीलीटर जोड़ें.
  12. एक ट्यूब में छर्रों का मिश्रण है और PBS 2% FCS युक्त तीन गुना अधिक धो लो.
  13. अंत में RPMI + 10% FCS और गिनती trypan नीले कोशिकाओं का उपयोग कर के 50 मिलीलीटर में स्थगित कर देते हैं. ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, तो आप 10 8 से 10 9 कुल hepatocytes प्राप्त कर सकते हैं.
  14. एक T150 फ्लास्क को कोशिकाओं स्थानांतरण और RPMI + 10% FCS के 30 मिलीग्राम और 0.8 मीटर जोड़नेpiptazo के एल.
  15. 37 में 1 से 1.5 घंटे के लिए सेते ° C पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने.

1.3 छँटाई और CD34 hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के पारगमन

  1. 1.2.15 चरण में कोशिकाओं की कुर्की के बाद, फ्लास्क आगे और पीछे धीरे को उत्तेजित करना है एक ढीला कोशिकाओं स्थानच्युत करना मिनट के लिए. Fibroblasts और सतह के लिए इस तरह के अटक के एक बहुत हो जाएगा.
  2. फिर से गिनती एक 1 से 20 कमजोर पड़ने का उपयोग और कोशिकाओं की कुल संख्या का रिकॉर्ड. बाद धुंधला करने के लिए एक मिलीलीटर की कुछ दसवां सहेजें. आप अपने प्रारंभिक कोशिका की गिनती (1.2.13 कदम) से लगभग 30% कम कोशिकाओं को होना चाहिए.
  3. नीचे स्पिन और एमएसीएस बफर के 40 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने.
  4. CD34 कोशिकाओं Miltenyi बायोटेक CD34 प्रत्यक्ष किट का उपयोग कर हल कर रहे हैं. हम वास्तव में निर्माता की रास एक ही कंपनी द्वारा उपलब्ध कराए गए स्तंभों का उपयोग प्रोटोकॉल का पालन करें.
  5. बरामद कोशिकाओं 5 मिलीग्राम में होगा. गणना और कुल कोशिकाओं की गणना. CD34 + कोशिकाओं की अपनी उपज को अपने कुल सेल गिनती के 3-5% होना चाहिए. यह वें के साथ बदलता रहता हैई भ्रूण जिगर की उम्र. छोटी भ्रूण यकृत CD34 + कोशिकाओं के एक उच्च उपज दे देते हैं.
  6. 6 1x10 द्वारा कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करते हैं. यह transplantable चूहों पर 2 ऊपरी सीमा देता है.
  7. (के माध्यम से प्रवाह और washes) CD34 अंश और 6 आरक्षित 10 x माउस प्रति 6 प्रत्यारोपित किया जा गिनो. संस्कृति इन RPMI + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के 50 से 80 मिलीलीटर में रातोंरात कोशिकाओं + 1% piptazo.
  8. CD34 + अपने lentiviral वेक्टर के साथ रातोंरात कोशिकाओं transduce. हम Takara द्वारा retronectin बिल्कुल निर्माता के निर्देशों का पालन करने का उपयोग करें.
  9. अगले दिन, फसल कोशिकाओं CD34 ट्रांसफ़ेक्ट CD34 + कोशिकाओं और गिनती.
  10. आधे में CD34 + कोशिकाओं को विभाजित: भाग ए और पार्ट बी
  11. नीचे स्पिन भाग एक CD34 + transduced कोशिकाओं और ठंड मध्यम के 4 से 6 मिलीग्राम (RPMI + 10% FCS फ़िल्टर्ड + 10% DMSO, 0.22 μ बाँझ) को निलंबित. ठंड शीशियों और लेबल में. "HuFetalCD34 शीशी में कोशिकाओं की संख्या, तिथि, और अपने इनीशियल्स साथ 1 मिलीलीटर aliquots रखो.
  12. प्रत्येक माउस 0.5x10 भाग 6 मिश्रण CD34 B + कोशिकाओं और 4.5x10 CD34 कोशिकाओं एक बाँझ पेंच टोपी microfuge ट्यूब में 6, गोली और बर्फ पर रख transduced. इसके अलावा बर्फ पर Matrigel (बी.डी. बायोसाइंसेज) की एक ट्यूब पिघलना करने के. इन सभी ट्यूबों बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब तक इस्तेमाल किया (2.10 कदम के लिए जाना).

2. ऊतक प्रत्यारोपण

इस कदम का लक्ष्य एनएसजी माउस गुर्दे कैप्सूल के तहत एक मानव भ्रूण thymus / जिगर organoid प्रत्यारोपण है. यह organoid बेहतर मानव टी सेल चयन और परिपक्वता की प्रक्रिया की प्रक्रिया mimics मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के रूप में उनके भेदभाव के लिए अलग टी सेल और अन्य lymphoid प्रजातियों साइट के रूप में मानव thymus और माउस का उपयोग नहीं होगा. प्रत्यारोपण प्रक्रिया में CD34 कोशिकाओं का उपयोग फिर से उत्पन्न भ्रूण जिगर stroma और बेहतर और प्रत्यारोपण के प्रत्यारोपण के विकास के लिए अनुमति देता है. एनएसजी इस्तेमाल चूहों की उम्र 6-8 सप्ताह पुराना है.

  1. दवाओं की सु के लिए तैयारrgery:
    1. Isoflurane: रोल एक 2 इंच धुंध पैड और यह एक 15 मिलीलीटर screwcap अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामान. सीधे बोतल से isoflurane के बारे में 1 मिलीलीटर में डालो.
    2. Ketamine / zylazine: एक 20 खारा के इंजेक्शन के लिए मिलीग्राम शीशी ketamine (Ketaset) (100 मिलीग्राम / एमएल) की 0.52 मिलीग्राम और xylazine (Anased) (100 मिलीग्राम / एमएल) के 0.52 मिलीलीटर जोड़ें. जल्द से जल्द अवसान हो रहा है घटक की समाप्ति की तारीख के साथ लेबल और रखने के -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर की जरूरत तक.
    3. Carprofen (Rimadyl). सिर्फ एक शल्य प्रक्रिया से पहले इस पतला. शीशी से एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 25g सुई के साथ 0.1 या 0.2 मिलीलीटर वापस 1:100 पतला. इंजेक्शन के लिए नमक की एक 10 या 20 मिलीलीटर में सुई. लेबल और तारीख. केवल एक दिन के लिए फ्रिज में रखें. 25G सुइयों के साथ 3 मिलीलीटर सीरिंज में लोड.
  2. सर्जरी के लिए तालिका सेट. यह बाँझ नीले पैड, और प्रत्येक सर्जन के लिए एक बाँझ तौलिया के साथ कवर. प्रत्येक सर्जन निष्फल उपकरणों के अपने बॉक्स से हो जाता है 4 "कैंची, घुमावदार कुंद संदंश की जरूरत है:ले नाक संदंश, hemostat, 16G पा trochar, और घाव क्लिप applicator. इसके अलावा, वे एक घुमावदार सुई Vicryl सीवन, isopropanol पैकेट पोंछ के एक ढेर, एक 35 मिमी पीबीएस पेट्री डिश, और एक 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ भर सिरिंज की जरूरत है.
  3. तालिका Betadine के 2 सेमी और 2 कपास swabs के साथ एक गिलास Coplin जार के बीच में सेट. एक 60 मिमी पेट्री डिश में थाइमस बिट्स डालो.
  4. संज्ञाहरण एक अलग मेज पर या एक बाँझ नीले पैड के साथ कवर हुड में किया जाता है. दो छोटे रैक और करने के लिए चूहों को पकड़ बीकर के साथ एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन सेट. एक रैक का उपयोग करने के लिए 0.5 मिलीलीटर एक्स 28G इंसुलिन ketamine / xylazine और अन्य के साथ लोड करने के लिए 3 carprofen मिलीलीटर सीरिंज पकड़ सीरिंज पकड़. इसके अलावा biohazard अपशिष्ट के पास कंटेनर ले जाने के लिए मुंडा फर पकड़.
  5. वजन एक पिंजरे में सभी चूहों (6-8 सप्ताह पुराना) 15 / / ketamine xylazine की μl जी की एक खुराक के साथ औसत वजन और लोड सीरिंज. पिंजरे में सभी चूहों इंजेक्षन.
  6. बाद चूहों सुस्त हो अपने lef दाढ़ीटी कूल्हे से पीठ के केंद्र और नंबर 40 ब्लेड के साथ एक Oster क्लिपर साथ पेट के बीच में कंधे की ओर. अपने वजन के रिकार्ड, और नंबर के लिए उनके कानों पंच.
  7. 0.3 मिलीलीटर carprofen subcutaneously इंजेक्षन कंधे पर.
  8. एक पंजा फैलाएंगे के माउस के संज्ञाहरण स्तर की जाँच करें. माउस flinches अगर, के बारे में 12 सेकंड के लिए एक ट्यूब से isoflurane प्रशासन. तो पंजा निचोड़ फिर कोशिश करें. Isoflurane के कम शॉट दे रखें जब तक पंजा पलटा गायब हो जाता है. दाएँ से बाएँ का सामना करना पड़ रहा तरफ माउस निर्धारित करना.
  9. टिप दायर दौर के साथ एक कैंसर 16 गेज प्रत्यारोपण सुई के लिए ऊतक सम्मिलित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाहर trochar पीबीएस के पकवान में कुछ बार फ्लश. यह टिप अंदर सिर्फ छड़ी के साथ क्षैतिज होल्डिंग. Thymus की needlenose संदंश के साथ एक टुकड़ा जोड़ें और इसे चूसना अंदर
  10. सहायक कोशिकाओं की एक ट्यूब (1.3.12 कदम) के लिए एक Eppendorf सकारात्मक विस्थापन pipet के साथ ठंड Matrigel के 5 μl, कहते हैं और कोमल सरगर्मी से घोला जा सकता है. सर्जन holडी एस trochar क्षैतिज और छड़ी वापस धीरे खींचती के रूप में सहायक trochar में Matrigel मिश्रण pipets. मिश्रण कमरे के तापमान पर जैल है.
  11. Betadine साथ नंगे त्वचा झाड़ू. तो यह एक isopropanol पोंछने के साथ बंद पोंछे. दोहराएँ.
  12. त्वचा के नीचे तिल्ली का पता लगाएँ. यह अंधेरी जगह है. माउस गुर्दे प्लीहा के लिए 5 पृष्ठीय मिमी, जो मुंडा त्वचा के माध्यम से देखा जा सकता है के बारे में स्थित है.
  13. इस मौके पर कुंद संदंश के साथ त्वचा और लेने के बारे में 15 मिमी लंबा तिल्ली के लिए एक कट समानांतर बनाने. पेरिटोनियम मांसपेशी नीचे की परत में एक समान कटौती. पुरुषों में, गुर्दे सीधे दिखाई हो सकता है और आप बस पेट निचोड़ यह बाहर पॉप चाहिए. महिलाओं में, आप hemostat साथ अंडाशय लेने और गुर्दे खींचें हो सकता है. यह शरीर के बाहर गुर्दे को बनाए रखने में मदद मिल सकती है. पुरुषों के लिए, आप पेट पर अपने बाएँ हाथ के साथ कुछ दबाव रखने के लिए गुर्दे उजागर रखना होगा.
  14. Posterio में एक छोटे से छेद प्लकगुर्दे कैप्सूल के आर अंत. यह एक छोटे से खून बहाना कर सकते हैं.
  15. इस छेद में और गुर्दे के साथ trochar स्लाइड तक trochar के छिद्र पूरी तरह से गुर्दे कैप्सूल से कवर किया जाता है. फिर अपने दाहिने हाथ की छोटी उंगली का उपयोग कर, ऊतक इंजेक्षन.
  16. गुर्दे बंद hemostat के साथ धीरे में वापस धक्का. एक डबल पता के साथ बंधे पेरिटोनियम में एक सिलाई रखो. निचोड़ एक पर्स की तरह त्वचा और दो घाव क्लिप में डाल दिया.
  17. प्रत्येक आंख पर पीबीएस की एक बूंद रखो और अपने पक्ष पर पिंजरे बिस्तर पर माउस रखना. सुनिश्चित करें कि सभी चूहों उन्हें छोड़ने से पहले उनके पेट पर बिछाने के लिए लौट आए हैं.
  18. अगले दिन, प्रत्येक माउस carprofen के एक शॉट देना.

3. माध्यमिक ट्रांसप्लांटेशन

बीएलटी चूहों की पीढ़ी में इस कदम का लक्ष्य moue मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के साथ अस्थि मज्जा आबाद है. प्रक्रिया (2) से प्रतिरोपित प्रत्यारोपण वें की पूर्ण पुनर्गठन का समर्थन करने के लिए पर्याप्त नहीं हैई इन चूहों में मानव प्रतिरक्षा प्रणाली. माध्यमिक प्रत्यारोपण के दौरान, हम उप lethally चूहों चमकाना के murine अस्थि मज्जा की कोशिकाओं खलाना इस प्रकार मानव CD34 + कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए "अंतरिक्ष" पैदा.

  1. चार से छह सप्ताह बाद 2.7 Gy के साथ चूहों चमकाना. चूहों में एक ही दिन एक CD34 + transduced कोशिकाओं भाग के साथ इंजेक्शन हैं. समय सीमा और तेरा / लिव प्रत्यारोपण चरण 2 में प्रत्यारोपित की स्थापना और विकास पर आधारित है. आमतौर पर, इस समय के दौरान प्रत्यारोपण में काफी वृद्धि हुई है हमें अगले कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देता है.
  2. बाहर भाग पिघलना के एक CD34 + transduced कोशिकाओं धो, और माध्यम में 5x10 6 मिलीग्राम / एक एकाग्रता को निलंबित.
  3. कोशिकाओं के 0.1 मिलीलीटर (10 5 माउस प्रति 0.1 मिलीग्राम प्रति 5x10 5 कोशिकाओं) के साथ 0.5 मिलीलीटर एक्स 28G इंसुलिन सीरिंज और चूहों की एक पिंजरे (प्रत्येक पिंजरे 5 चूहों के एक अधिकतम शामिल) के लिए लोड उन्हें एक दूर का सामना करना पड़ रहा रैक पर रखना.
  4. Isoflurane ट्यूब के साथ एक माउस anesthetize यह scruffing और इसकी होल्डिंगके बारे में 20 सेकंड के लिए ट्यूब में नाक. समय का ट्रैक रखने गिनो.
  5. तो यह सही करने के लिए चेहरे, और अंगूठे और बाएं हाथ की तर्जनी के साथ अपनी गर्दन के चारों ओर त्वचा तंग करना. अपने 3 खोजक के साथ अपने जबड़े के नीचे प्रेस इतना है कि इसकी सही आंख बाहर bulges. होल्डिंग है माउस सिर के लंबी अक्ष के समानांतर सिरिंज, सुई आँख के पीछे पर्ची और यह धीरे स्लाइड जब तक यह बंद हो जाता है. प्रेस, नहीं किसी भी आगे है, लेकिन के बारे में 2 सेकंड से अधिक लोड इंजेक्षन.
  6. दो से तीन महीने के बाद चूहों retroorbitally लहूलुहान EDTA लेपित गिलास pipettes का उपयोग कर रहे हैं. आप केवल माउस प्रति माह प्रति रक्त की 200 μl की एक अधिकतम ले सकते हैं. रक्त की 50-100 μl FACS विश्लेषण के लिए पर्याप्त होना चाहिए. वैकल्पिक खून बह रहा रणनीतियों चेहरे की नस bleeds और पूंछ नस bleeds शामिल हैं. बाद आप खून की बहुत छोटी मात्रा कि एकाधिक assays के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है दे देंगे.
  7. रक्त नमूने मानव लिम्फोसाइट मार्कर CD45 पुनर्गठन का आकलन करने के लिए के लिए अभिव्यक्ति के लिए दाग रहे हैं. बीlood नमूने 1 मिलीग्राम लाल रक्त कोशिका lysis बफर (160 मिमी एनएच 4 सीएल, 100 मिमी KHCO 3, 0.01 मिमी EDTA) में जोड़ा जाता है और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubated.
  8. Lysis बफर, 1200 rpm पर 5 मिनट और यदि आवश्यक हो तो दोहराने में कोशिकाओं को धो लें.
  9. 3.8 के रूप में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और 3% भ्रूण बछड़ा सीरम (FACS पीबीएस) के साथ पूरक पीबीएस में धो.
  10. तैरनेवाला निकालें और 100 μl FACS पीबीएस में फिर से को निलंबित छर्रों.
  11. एंटीबॉडी जोड़ें मानव लिम्फोसाइट पुनर्गठन का आकलन करने के लिए. आम तौर पर हम निम्नलिखित (मानव लिम्फोसाइट मार्कर) CD45, CD8, CD4, CD14 और CD16 मैक्रोफेज और monocytes के लिए, बी कोशिकाओं के लिए CD19 और CD56 एन.के. कोशिकाओं के लिए शामिल हैं.
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  13. 3.9 चरण में धो और FACS विश्लेषण के लिए 2% paraformaldehyde में कोशिकाओं को निलंबित.
  14. अगर चूहों का पुनर्गठन कर रहे हैं, हम ट्यूमर इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ना है. मानव लिम्फोसाइटों के पुनर्गठन के स्तर रक्त कोशिकाओं की कुल संख्या में 40% करने के लिए कम से कम 1% से बदलती हैं. lymphoc और स्तर प्रकारYTE प्रजातियों एक स्वस्थ मानव रक्त दाताओं से क्या उम्मीद करेंगे तुलना कर रहे हैं. हालांकि, गैर - टी सेल प्रजातियों की संख्या में उतार चढ़ाव की उम्मीद है. यदि संख्या 12-सप्ताह की समय सीमा के भीतर स्वीकार्य नहीं हैं आप 3.1 कदम से माध्यमिक प्रत्यारोपण प्रक्रिया को दोहरा सकता है.
  15. ट्यूमर सेल लाइनों निर्माता या प्रयोगशाला की सिफारिशों के अनुसार संवर्धित कर रहे हैं. कोशिकाओं काटा धोया और एक 1:1 अनुपात (50 μl cells/50 μl Matrigel) Matrigel में resuspended. नमूने सभी समय पर बर्फ पर रखा जाता है.
  16. चूहे anesthetized और इंजेक्शन के क्षेत्र में मुंडा हैं. क्षेत्र में एक isopropanol पैड का उपयोग कर निष्फल है. पूर्व में एक सहायक भार सेल निलंबन 23g 1 मिलीलीटर सीरिंज ठंडा. ट्यूमर कोशिकाओं subcutaneously इंजेक्शन हैं. एंटीबायोटिक मलहम के साथ इंजेक्शन की साइट समझो. ट्यूमर को स्थापित करने के लिए और 4 सप्ताह में बढ़ शुरू करना चाहिए.

Vivo पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) में बी.

हम अपने अध्ययन के लिए परीक्षाine ग्लूकोज (तेज [18 एफ] fluorodeoxyglucose ([18 एफ] FDG) इस प्रकार चूहों 4-6 घंटे का उपवास कर रहे हैं इमेजिंग / MicroPET सीटी स्कैन करने से पहले कर रहे हैं microPET Inveon (सीमेंस Preclinical समाधान) स्कैनर और MicroCATII सीटी स्कैनर का उपयोग किया ( Siemens) PreclinicalSolutions छवि विश्लेषण OsiriX (Pixmeo, स्विट्जरलैंड) सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है लक्ष्य को ट्यूमर की चयापचय गतिविधि को मापने के लिए और अंततः पीईटी इमेजिंग का उपयोग करने के लिए शारीरिक रूप से ट्यूमर प्रतिगमन को मापने के लिए एक विकल्प के रूप में है. जैसा कि चित्रा 2 में देखा, हम ट्यूमर है कि शारीरिक रूप और आकार के आधार पर का सामना करना पड़ा है लक्षित लेकिन नहीं रहते पीईटी इमेजिंग व्यापक ऊतक परिगलन का पता चला रहे हैं इस पद्धति ट्यूमर प्रतिगमन के एक और अधिक संवेदनशील और सटीक सूचक के रूप में सेवा कर सकते हैं.

  1. Anesthetizing (2% isofluorane) चूहों के लिए एक कक्ष, और FDG पीईटी स्कैनिंग ("चैम्बर इंतज़ार कर रही") से पहले 60 मिनट के तेज के रूप में एक कक्ष निर्दिष्ट. दोनों कक्षों में नीले पैड रखें.
  2. के रूप में पशुओं anesth हैंलंबी अवधि में etized, वे 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी भरा दस्ताने कि एक माइक्रोवेव में गरम कर रहे हैं और गर्मी पैड पर पिंजरों रखने के प्रयोग के माध्यम से रखा.
  3. पर इस कक्ष के लिए isoflurane प्रवाह मुड़ें. Isoflurane कक्ष में किसी भी चूहों रखने से पहले लगभग 5-10 मिनट के लिए anesthetizing चैम्बर भरने के लिए अनुमति दें. यकीन है कि ढक्कन बंद कर दिया और बंद कसकर isoflurane लीक से बचने.
  4. Anesthetizing चेंबर में पहला माउस प्लेस और ढक्कन कसकर लॉक. 5-10 मिनट की अनुमति दें या जब तक माउस बेहोश है.
  5. Anesthetizing कक्ष, लेबल माउस की पूंछ (पिंजरे के प्रति अलग रंग) से निकालें और माउस के साथ intraperitoneally माउस इंजेक्षन [18 एफ] FDG (80 μCi). समय माउस इंजेक्ट किया गया था के ध्यान में रखना. anesthetized माउस फिर से इस Timepoint से 50 मिनट हो जाएगा, की अनुमति के लिए 10 मिनट पीईटी स्कैन के लिए स्थापित करने के लिए (60 मिनट की कुल के लिए [18 एफ] पीईटी स्कैन से पहले FDG तेज).
  6. प्रतीक्षा कक्ष में इंजेक्शन माउस प्लेस, की अनुमति [18 एफ] FDG तेज पीईटी स्कैन से पहले 1 घंटे के लिए. ढक्कन लॉक नहीं. ढक्कन airflow की अनुमति ढीला छोड़ दें.
  7. तुरंत FDG इंजेक्शन के लिए anesthetizing चेंबर में अगले माउस जगह है. बाद के चूहों इंजेक्शन 10 मिनट के अलावा दूरी पर होना चाहिए, क्योंकि पीईटी स्कैनिंग की प्रक्रिया 10 मिनट है. तुरंत बाद एक माउस स्कैन है, अगले स्कैन होने के लिए माउस के लिए 60 मिनट FDG तेज बिल्कुल अलग 10 मिनट के लिए तैयार हो जाएगा.
  8. जारी anesthetizing और चूहों इंजेक्शन लगाने के रूप में 7-9 चरणों में कहा गया है.
  9. 1 माउस इंजेक्शन Timepoint से 50 मिनट के बाद, anesthetizing चेंबर में पहली माउस इंजेक्शन फिर जगह (जबकि अभी भी anesthetize और चूहों इंजेक्षन जारी).
  10. ऑक्सीजन और isoflurane लाइनों माउस बिस्तर कनेक्ट, और बिस्तर के लिए पर isoflurane प्रवाह की बारी. बिस्तर पर एक नीले पैड प्लेस.
  11. बिस्तर पर पीईटी स्कैन के लिए तैयार माउस प्लेस, हथियार और खींचपैर और टेप के साथ इस स्थिति धारण. आंखों पर स्नेहक रखें. यह सबसे महत्वपूर्ण कदम है पशु की स्थिति के बाद से अपने इमेजिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं.
  12. Isoflurane और ऑक्सीजन लाइनों डिस्कनेक्ट करें, और जल्दी से पीईटी स्कैनिंग मशीन पर बिस्तर माउंट. Isoflurane और ऑक्सीजन लाइनों रखें. सुनिश्चित करें कि isoflurane प्रवाह पीईटी स्कैन मशीन के लिए है. पीईटी स्कैन केबल कनेक्ट और स्कैन शुरू.
  13. एक बार पीईटी स्कैन पूरा हो गया है तो सीटी स्कैनर पशु ले जाने. इस स्कैन के बाद अपने संबंधित पिंजरे पशु चाल.

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Representative Results

प्रत्यारोपण प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट चित्र 1 ए में दिखाया गया है. तेरा / लिव प्रत्यारोपण की एक तस्वीर चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. thymic ऊतक सामान्य रूप से विकसित और मानव CD4 और CD8 टी कोशिकाओं के एक शारीरिक वितरण किया गया है. पुनर्गठन के बाद, जानवरों CD4, CD8 टी कोशिकाओं और अन्य प्रतिरक्षा सेल प्रजातियों के सामान्य वितरण के साथ एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली ले.

ट्यूमर के आकार और ऊतक रहने के बीच विसंगति चित्रा 2 में दिखाया गया है. जबकि सीटी स्कैन (ग्रे क्षेत्र) vivo पीईटी इमेजिंग में एक बड़े ट्यूमर के विकास के संकेत से पता चला है कि यह ज्यादातर परिगलित और ऊतक निशान (2 चित्रा) था. यह ट्यूमर प्रतिगमन और निकासी का आकलन करने के लिए एक और अधिक संवेदनशील और सटीक तरीका के रूप में पीईटी इमेजिंग की उपयोगिता को रेखांकित करता है.

चित्रा 1 चित्रा 1 (ए) संशोधित बीएलटी काइमेरिक चूहों मार्ट एक विशेष टी कोशिकाओं को ले जाने की पीढ़ी के लिए इन अध्ययनों में प्रयुक्त मॉडल पर एक योजनाबद्ध आरेख. प्रत्यारोपण तेरा / लिव से transduced और CD34 एक ऑटोलॉगस भ्रूण जिगर से अलग कक्षों में transduced गैर पुनर्निर्मित किया गया. Transduced कोशिकाओं के एक अंश में जमे हुए है और विकिरणित चूहों में इंजेक्शन 4-6 हफ्ते बाद. (बी) तेरा / लिव humanized चूहों में प्रत्यारोपण के एक प्रतिनिधि छवि. प्रत्यारोपण एक शारीरिक ऊतक वितरण और CD4/CD8 अनुपात के रूप में आईएचसी और प्रवाह cytometry आंकड़े द्वारा दिखाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 एक एक मेलेनोमा ट्यूमर ले माउस की एक छवि पीईटी और सीटी.ग्रे क्षेत्र ट्यूमर के भौतिक आकार इंगित करता है, जबकि लाल रंग ट्यूमर चयापचय गतिविधि है, जो बहुत ही सीमित है इंगित करता है.

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Discussion

संशोधित बीएलटी humanized माउस vivo पीईटी इमेजिंग में साथ मिलकर मॉडल पुरानी मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं. इस प्रणाली बीएलटी माउस मॉडल है और यह एचआईवी अनुसंधान के लिए सीमित दायरे से परे अग्रिम लेता है. इसके अलावा, यह एक महान प्रणाली है जिसमें हम विभिन्न जीन थेरेपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटोकॉल नैदानिक ​​तकनीकों की जांच से पहले वे नैदानिक ​​सेटिंग तक पहुँच सकते हैं कर सकते हैं. बाद चूहों बनाम primates का उपयोग करने की कम लागत के साथ मिलकर यह एक बहुत ही उपयोगी मॉडल बनाता है.

पीईटी इमेजिंग तकनीक हमें हमारे दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए अनुमति दी. यदि हम विशेष रूप से ट्यूमर के शारीरिक माप पर भरोसा, हम हमारे ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न अर्बुदरोधी प्रतिक्रिया की शक्ति को कम करके आंका होता है. व्यापक scarring और necrotic ऊतक एक बड़े ट्यूमर है, जो वास्तविकता में मृत ऊतक का रूप दे दिया.

अंत में, संशोधित बीएलटी माउस मीटर की उपयोगिताODEL अन्य रोग मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है. जबकि अभी भी कुछ नुकसान ऐसे चूहों के कम उम्र के रूप में जारी रहती है, यह एक बहुत मजबूत उपकरण vivo में मानव प्रतिरक्षा, परीक्षण के कई पहलुओं का आकलन और उपन्यास उपचारात्मक उपायों का विकास हो सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम एल्विन वेल्च और लैरी वेदना उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. सीआईआरएम नई संकाय पुरस्कार RN2 +००९०२ 1, इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) पुरस्कार P50 CA086306 पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) RC1 - ००,१४९ 1 और RS1 के +००,२०३ 1 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था , कैलटेक UCLA translational चिकित्सा के लिए संयुक्त केन्द्र, एड्स अनुसंधान के लिए UCLA केंद्र (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA एड्स संस्थान, सीआईआरएम उपकरण और प्रौद्योगिकी पुरस्कार RT1 01,126, और UC Multicampus अनुसंधान कार्यक्रम और कैलिफोर्निया से पहल Antiviral ड्रग डिस्कवरी के लिए केंद्र (संख्या - 143,226 MRPI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Invitrogen 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove's 12440061
Fetal Calf Serum 16000085
Collagenase type IV Sigma Aldrich C5138
Hyaluronidase H3506
DNAse I Roche Diagnostics 10104159001
Piptazo (Zosyn) Pfizer Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus) Ge Healthcare Life Sciences 17-1440-02
MACS Buffer Miltenyi Biotech See comments MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit 130-046-702
LS Columns 130-042-401
Retronectin Takara T100A
Matrigel BD Biosciences 354263
Isofluorane Baxter http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl) Pfizer Animal Health https://www.rimadyl.com/default.aspx

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References

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  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
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  5. Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
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कैंसर जीवविज्ञान 70 अंक स्टेम सेल बायोलॉजी इम्यूनोलॉजी बायोमेडिकल इंजीनियरिंग मेडिसिन बायोइन्जिनियरिंग जेनेटिक्स कैंसर विज्ञान humanized चूहों स्टेम सेल प्रत्यारोपण स्टेम सेल, टी कोशिकाओं कैंसर पशु मॉडल
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Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, … More

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, S. G., Levin, B., Liu, W., Radu, C. G., Kitchen, S. G., Zack, J. A. Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model. J. Vis. Exp. (70), e4181, doi:10.3791/4181 (2012).

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