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Neuroscience

भ्रूण चूहे की आंत अंग से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) स्वायत तंत्रिका progenitors के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया

Published: August 17, 2012 doi: 10.3791/4188
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Genetic Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

एक अनुकूलित भ्रूण माउस ऊतकों से तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न neuronal progenitors शुद्ध करने की प्रक्रिया में वर्णित है. इस विधि के फ्लोरोसेंट संवाददाता alleles से अभिव्यक्ति का लाभ लेता है प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) असतत आबादी अलग. तकनीक के विकास भर में या वयस्क ऊतकों से neuronal subpopulations अलग लागू किया जा सकता है.

Protocol

1. मीडिया की तैयारी (सभी कदम ऊतक संस्कृति हुड में किया)

  1. निम्नलिखित हारवेस्टर: 44 मिलीलीटर एल -15 मध्यम, 0.5 मिलीग्राम 100X पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 0.5 मिलीग्राम 100 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (BSA), 0.5 मिलीग्राम 1M HEPES, 5 मिलीलीटर टिशू कल्चर ग्रेड जल. BSA और पी / एस जोड़ने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित. इस मात्रा तक की हदबंदी के लिए पाँच अलग अलग ऊतकों प्रकार के लिए पर्याप्त होना चाहिए. यह मीडिया 3.4 चरण में इस्तेमाल किया जाएगा ऊतक के enzymatic पृथक्करण के बाद उपयोग के के शमन समाधान को तैयार हैं.
  2. हालांकि 0.22 माइक्रोन Polyethersulfone फिल्टर (PES) फ़िल्टर मीडिया.
  3. 1X हांक संतुलित नमक (HbSS) समाधान और 1X फास्फेट तैयार खारा में 10X ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी का उपयोग स्टॉक में से (पीबीएस) बफर. 0.22 माइक्रोन पी.इ.एस. फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें. इन अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा में समय से आगे तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, एक ऊतक संस्कृति हुड में छोटे संस्करणों के रूप में की जरूरत है aliquoting.
  4. 1X HbSS, (के साथ एकाधिक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों भरेंट्यूबों के लिए ऊतकों की संख्या) आप उप - विदारक पर योजना बर्फ पर ट्यूब रखने के बराबर की संख्या.

2. विच्छेदन

  1. संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति अनुमोदित प्रोटोकॉल और हस्तांतरण गर्भाशय के अनुसार 60 या 100 मिमी पेट्री डिश से युक्त बर्फ के ठंडे 1X पीबीएस में Euthanize गर्भवती माउस समय पर.
  2. गर्भाशय से भ्रूण निकालें और बर्फ ठंड 1X पीबीएस में शिरच्छेद द्वारा euthanize. प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत अलग - अलग स्क्रीन, सकारात्मक ट्रांसजेनिक और जंगली प्रकार (WT) nontransgenic के पूल में विभाजित है. बहुत ठंडा 1X पीबीएस में विच्छेदन भर भ्रूण रखें.
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, मूत्रजननांगी पथ उप - टुकड़े करना. जगह में ठीक संदंश के साथ forelimb स्तर पर भ्रूण पकड़ो. जिगर से अंतरांग निकालें डायाफ्राम के स्तर पर तो briskly आंतरिक अंगों के नीचे और पृष्ठीय शरीर दीवार से दूर खींच संदंश डालने द्वारा जननांग बीजदाना के लिए.
  4. आगे की उप ऊतक काटनाआसपास के ऊतकों (चित्रा 1) से दूर ब्याज. एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब युक्त बर्फ ठंड 1X HbSS में प्रत्येक व्यक्तिगत उप - विच्छेदित ऊतक प्रकार रखें. पूल प्रत्येक प्रकार के ऊतक के साथ भ्रूण फेनोटाइप (यानी सभी GFP भ्रूण आंत के नमूने एक एकल 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में जमा कर रहे हैं).
  5. समानांतर में, जंगली प्रकार के भ्रूण से तुलनीय ऊतकों प्रवाह cytometry पर मुआवजा नियंत्रण के लिए उपयोग काटना.

3. Subdissected ऊतकों की हदबंदी

  1. गोली 210 सापेक्ष केन्द्रापसारक बल (आरसीएफ), 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा ऊतक उप विच्छेदित. Centrifugation के बाद, के रूप में संभव के रूप में ज्यादा HbSS महाप्राण (व्यंजन).
  2. Accumax (अभिनव सेल टेक्नोलॉजीज, Inc) में ऊतक गोली Resuspend प्रकार के ऊतकों के पार संक्रमण से बचने के लिए प्रत्येक नमूना के बीच विंदुक युक्तियाँ बदलने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है. Accumax जोड़ा की राशि ऊतक की मात्रा बड़े या छोटे के लिए बढ़ाया जा सकता है. आम तौर पर 1 के लिए-5 भ्रूण आंत नमूने, Accumax के 1 मिलीग्राम है, लेकिन इस्तेमाल किया जा बड़ा ऊतक पूल के एक अधिक से अधिक मात्रा प्राप्त करने के लिए पृथक्करण की आवश्यकता होगी.
  3. 37 ° C 20-45 मिनट के लिए पानी स्नान ऊतक पृथक जा रहा (जैसे 13.5 आंत डीपीसी 20 मिनट, 15.5 डीपीसी आंत 35 मिनट) की अवस्था पर निर्भर करता है. में जगह ट्यूब आधे रास्ते हदबंदी समय हालांकि, मैन्युअल रूप से पानी स्नान (या किसी भी ठोस सतह) के पक्ष के खिलाफ ट्यूब दस्तक और ट्यूब "से flicking" (के रूप में एक नीचे एक पुराने ढंग का पारा थर्मामीटर हिला होगा) ऊतक को तोड़ने. हदबंदी समय के अंत में प्रक्रिया कई बार नीचे हिला दोहराने के लिए आगे नमूना अलग कर देना. और अधिक नाजुक नमूने के लिए, नीचे शेक की तेजस्विता को कम करने और के बजाय 3.5 चरण विंदुक विचूर्णन के दौरान उपयोग करने के लिए पृथक्करण का एक उचित स्तर को प्राप्त करने. डीपीसी 14.5 और 15.5 डीपीसी LUT के लिए ठेठ हदबंदी बार 35 और 45 मिनट, क्रमशः रहे हैं.
  4. जबकि ऊतक Accumax में incubating है, ताकि शमनlutions, कहा और 01:05 बुझाना बुझाना. बुझाना 6 मिलीग्राम एल -15 मीडिया के लिए 45 μl 5 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं जोड़कर किया जाता है. बुझाना 01:05 30 मिलीलीटर एल -15 मीडिया के लिए 45 μl 5 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं जोड़कर किया जाता है.
  5. हदबंदी के अंत में, बर्फ पर 15 मिलीलीटर ट्यूबों चाल और तुरंत प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिलीग्राम बुझाना जोड़ें. प्रत्येक नमूना महीन चुर्ण बनाना ऊपर और नीचे जब तक ऊतक लगभग पूरी तरह से अलग (चित्रा 2) है. वहाँ अभी भी समाधान में ऊतक वर्तमान के कुछ छोटे विखंडू होगा. एक पूरी तरह से समरूप नमूना हासिल करने न तो आसानी से प्राप्त किया है और न ही वांछनीय है के रूप में यह गरीब सेल व्यवहार्यता में परिणाम कर सकते हैं.
  6. बर्फ पर नमूना प्रोटोकॉल के शेष के लिए जितना संभव हो रखें. जब की pipetting बुझाना या 01:05 बुझाना करने के लिए नमूने के पार संक्रमण से बचने के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग सुनिश्चित करें.

4. सेल सस्पेंशन छनन

  1. संदंश है कि 70% इथेनॉल में भिगो दिया गया है का उपयोग करना है, पर 38 माइक्रोन नायलॉन जाल झिल्ली के 3 वर्ग सेमी (Sefar अमेरिका) जगहएक नया 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के मुँह. संकीर्ण बोर युक्तियों का उपयोग झिल्ली के केंद्र में pipetting द्वारा जाल के माध्यम से फिल्टर कोशिकाओं. यदि झिल्ली संतृप्त, जबकि फ़िल्टरिंग हो जाता है, इसे हटाने, सूखी एक kimwipe साथ ट्यूब के मुंह, और नायलॉन जाल का एक नया टुकड़ा का उपयोग करने के लिए सेल निलंबन की शेष फिल्टर. एक बार सभी कक्षों को फ़िल्टर किया गया है, 1 मिलीग्राम का उपयोग 01:05 बुझाना करने के लिए बाहर ट्यूब कुल्ला और किसी भी शेष कोशिकाओं को फिल्टर.
  2. जब फ़िल्टरिंग पूरा हो गया है, या जब एक भरा झिल्ली जगह, संदंश का उपयोग करने के लिए जाल के पक्ष रोल और ट्यूब के शीर्ष भर में झिल्ली साफ करने के लिए कक्षों की किसी भी फांसी बूंदों को हटाने.
  3. गोली centrifugation द्वारा 210rcf पर सेल निलंबन, 4 ° C 5 मिनट के लिए. 1 मिलीलीटर बुझाना 01:05 सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली महाप्राण (व्यंजन).
  4. 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में नायलॉन जाल के माध्यम से फिल्टर सेल निलंबन. 1 मिलीग्राम के साथ बाहर धोने 15 मिलीलीटर ट्यूब के किसी भी शेष कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए 1:05 और फिल्टर बुझा लेते हैं.

5. FACS के लिए नमूने की तैयारी

छंटाई के लिए और मुआवजा नियंत्रण के लिए एक ही ऊतक का उपयोग अगर, 1/10 वें 1/20 वें नमूना मात्रा का एक नया 5 मिलीलीटर polystyrene मुआवजा नियंत्रण के लिए उपयोग ट्यूब हस्तांतरण. दो भागों में जंगली प्रकार के ऊतक नमूना फूट डालो. एक भाग जंगली प्रकार (केवल WT) अस्थिर हो जाएगा, जबकि दूसरी छमाही 7 Aminoactinomycin डी (7 AAD, एक फ्लोरोसेंट रहते हैं एक "व्यवहार्यता दाग" के रूप में प्रयोग किया जाता कोशिकाओं से बाहर intercalator) होगा यह जोड़ा (केवल 7 AAD ). ये व्यक्तिगत नियंत्रण के प्रवाह सॉर्टर पर असतत fluorophores के उत्सर्जन के बीच किसी भी वर्णक्रमीय ओवरलैप के मुआवजे के लिए अनुमति की जरूरत है. उदाहरण के लिए, EGFP की तरह एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए, आवश्यक नियंत्रण में शामिल होगा: केवल EGFP, अस्थिर WT कोशिकाओं, और केवल 7 AAD (चित्रा 3) के साथ दाग ट्यूब.
  • सभी 5 मिलीग्राम में बुझाना 01:05 अपकेंद्रित्र और 210rcf में, 4 डिग्री सेल्सियस के साथ 5 मिनट के लिए सेल निलंबन युक्त ट्यूबों भरें. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन), तरल के लगभग 200 μl छोड़नेट्यूब में.
  • बुझाना 01:05 में 1:1000 7 AAD पतला. 7 AAD ही मुआवजा और नियंत्रण करने के लिए हल किया जा नमूने 7 AAD धुंधला कमजोर पड़ने जोड़ें. केवल EGFP या WT केवल मुआवजा नियंत्रण करने के लिए 7 AAD जोड़ नहीं है. की मात्रा करने के लिए शुरू सामग्री और सेल गोली का आकार प्राप्त की राशि के आधार पर अलग अलग होंगे जोड़ा जा 7 AAD. एक बार 7 AAD उपयुक्त ट्यूबों में जोड़ा गया है, नमूने हल किया जा करने के लिए तैयार हैं.
    ऊतक नमूना पूल आकार मात्रा ट्यूब * जोड़ा जा 7 AAD
    15.5 डीपीसी आंत 1-5 200 μl
    15.5 डीपीसी LUT 1-5 150 μl

    तालिका 1. अलग ऊतक * प्रत्येक ट्यूब में अंतिम कुल राशि dissociates 7 AAD की राशि एक 50-100 μl से लेकर राशि से भिन्न के बाद से मीडिया की आकांक्षा है होगा एकलगभग प्रक्रिया n और गोली से बचने के लिए प्रदर्शन किया. अंतिम संस्करणों इतना नहीं मापा के रूप में समाधान में कोशिकाओं की हैंडलिंग कम करने के लिए कर रहे हैं.
  • संग्रह ट्यूब की तैयारी 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूबों के लिए 0.75 मिलीग्राम TRIzol LS-जोड़कर शाही सेना के अलगाव के लिए कोशिकाओं पर कब्जा.
  • यदि संग्रह के लिए इन विट्रो संस्कृति में कोशिकाओं के बजाय शाही सेना अलगाव, 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में आत्म नवीकरण मीडिया में सीधे तरह कोशिकाओं, fibronectin साथ लेपित और मीडिया के साथ भर के रूप में पहले वर्णित 2,6,7.

    • 6. फ्लो

    1. प्रवाह cytometer, मुआवजा का मूल्यांकन, नियंत्रण प्रत्येक नमूना के बीच फ्लश करने के लिए संक्रमण से बचने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है. मुआवजा नमूनों की प्रोफाइल का उपयोग करने के लिए छँटाई के लिए / voltages के फाटक सेट. नोट करें कि अगर वांछित ऊतक में सकारात्मक कोशिकाओं को सीमित संख्या में मौजूद हैं, एक अलग ऊतक प्रतिदीप्ति तीव्रता और सेल के आकार के रूप में लंबे समय के रूप में मुआवजा सेटिंग्स स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैके बीच नमूने तुलना कर रहे हैं.
    2. मुआवजा मापदंडों और फाटक मृत कोशिकाओं है कि 7 AAD डाई और अस्थिर नियंत्रण (चित्रा 4) के GFP प्रतिदीप्ति रिश्तेदार के उच्च तीव्रता प्रदर्शन कोशिकाओं को इकट्ठा से बचने के.
    3. प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में 25,000 ज़्यादा से ज़्यादा कोशिकाओं के आधार पर छाँटें. छंटनी एक विस्तृत बोर नोक और कम प्रवाह की दर से (उदाहरण के लिए, 17psi, 100 माइक्रोन नोक, ३००० घटनाओं / सेकंड) neuronal पूर्वपुस्र्ष व्यवहार्यता की रक्षा के साथ सबसे कम संभव दबाव में किया जाना चाहिए. के लिए प्रकार EGFP + कोशिकाओं को अलग करने के लिए हम बी.डी. बायोसाइंसेज FACSAriaII पर में हमारे isolations 488nm 20mW लेजर का उपयोग करने के लिए EGFP संवाददाता उत्तेजित करते हैं.
    4. यदि नमूने उच्च सेल सांद्रता होते हैं, यह सेल निलंबन आगे 1:1000 का उपयोग 7 - AAD उच्च कब्जा क्षमता प्राप्त जब छँटाई दाग को कमजोर करने की सलाह दी जाती है.
    5. भंवर कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब छँटाई के तुरंत बाद TRIzol - रास में कब्जा कर लिया.

    7. प्रतिनिधि परिणाम

    हदबंदी ऊतक के प्रवाह छँटाई के लिए एक सेल निलंबन का उत्पादन पर्याप्त enzymatic पाचन और से बचने के पाचन है कि कम सेल viabilities में परिणाम कर सकते हैं के बीच एक नाजुक संतुलन है. ऊतक हदबंदी के वांछित स्तर का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. उचित पचा ऊतक में पहले उप विच्छेदित अंगों के मैनुअल विचूर्णन टुकड़े अभी भी स्पष्ट रूप से स्पष्ट (चित्रा 2b, 2 एफ). ऊतकों है कि enzymatically बहुत लंबा समय या एंजाइम की बहुत अधिक एकाग्रता में एक अवधि के लिए इलाज कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप निलंबन ऊतक के किसी भी अवशिष्ट बड़े टुकड़े (चित्र 2 डी, 2) का अभाव है.

    उचित हदबंदी और मैन्युअल फ़िल्टरिंग प्रवाह cytometry कि आम तौर पर 90% से अधिक व्यवहार्य कोशिकाओं एक्ज़िबिट और EGFP अभिव्यक्ति के उच्च स्तर (चित्रा 4) को दिखाने के प्रकार प्रोफाइल उत्पादन. सेल इस विधि द्वारा प्राप्त आबादी अच्छा उदाहरण देकर स्पष्ट करनाव्यवहार्यता और gating के बाद या जीन की अभिव्यक्ति की संस्कृति विश्लेषण के लिए किया जा सकता है EGFP का कब्जा + neuronal progenitors के लिए कब्जा कर लिया.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 भ्रूण माउस LUT में TH-EGFP + neuronal progenitors के वितरण. पूरे माउंट 15.5 डीपीसी में मूत्रजननांगी पथ उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत औदरीयता देखी है, EGFP + TH-EGFP transgene प्रतिदीप्ति रोशनी (ख) के तहत पहचान की अभिव्यक्ति के द्वारा लेबल की कोशिकाओं के वितरण के लिए तुलना में (एक). TH-EGFP अभिव्यक्ति (क) के adrenals और medially स्थित सीलिएक ganglia (तटरक्षक) में मौजूद है. 15.5 डीपीसी TH-EGFP उप विच्छेदित मूत्राशय श्रोणि (स्नातकोत्तर) ganglia, मूत्राशय दीवार (bla) और मूत्रमार्ग (यू) में transgene अभिव्यक्ति से प्रतिदीप्ति प्रदर्शन के पार्श्व दृश्य (ग). (घ) पृष्ठीय ध्यान में रखते हुए EGFP + कोशिकाओं पूर्वकाल पृष्ठीय मूत्रमार्ग में स्पष्ट कर रहे हैं. अन्य लेबल: गुर्दे (कश्मीर), वृषण (टी), मूत्राशय (bla) और जननांग tubercle (जी.टी.).

    चित्रा 2 15 डीपीसी भ्रूण (क) LUT और आंत (ई) के Brightfield छवियों, क्रमशः, हदबंदी ऊष्मायन अवधि के माध्यम से आधे रास्ते, हदबंदी ऊष्मायन के अंत में imaged किया (ख च) पुस्तिका विघटन के बाद, विघटन (ग से पहले, छ), और एक नमूना है कि पीढ़ी से अलग (घ, ज) कर दिया गया है.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. योजनाबद्ध आरेख नियंत्रण मुआवजा कठोर FACS gating के मापदंडों को स्थापित करने की जरूरत दिखाता है.

    चित्रा 4
    चित्रा 4 प्रवाह प्रकार प्रोफाइल के प्रतिनिधि छवि 14.5 डीपीसी (क) और 15.5 डीपीसी (ख) में. काले जनसंख्या के आधार पर आगे और पक्ष बिखराव एकल कोशिकाओं कि मर चुके हैं शामिल है और लेबल द्वारा7 AAD प्रतिदीप्ति. ग्रे स्वेटर आगे और पक्ष बिखराव कि 7 AAD बाहर कर दिया और इस प्रकार व्यवहार्य पर आधारित कोशिकाओं की जनसंख्या शामिल है. ग्रीन gated जनसंख्या बॉक्सिंग GFP "" क्षेत्र ने संकेत दिया है और एकल कक्षों 7 AAD व्यवहार्य () बाहर कर दिया और EGFP प्रतिदीप्ति प्रदर्शन शामिल है.

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    Discussion

    माउस संवाददाता फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से व्यक्त लाइनों व्यापक रूप से उपलब्ध से murine आनुवंशिकी 1,8,9 समुदाय में कई प्रयासों के माध्यम से होते जा रहे हैं. एक परिणाम के रूप में पृथक्करण विधि यहाँ सचित्र को असतत neuronal या या तो भ्रूण या वयस्क ऊतकों से neurotransmitter रिसेप्टर अभिव्यक्ति पैटर्न पर आधारित उपप्रकारों में से अलगाव के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है. जब तक हम इस विधि एक फ्लोरोसेंट transgene रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के आधार पर अनुकूलित किया है, यह भी नमूने कोशिका की सतह रिसेप्टर्स जीवित कोशिका इम्युनो - लेबलिंग 3-5,10 तरीकों से लेबल को व्यक्त करने के लिए लागू किया जा सकता है.

    हमारे हाथ में हम कई कारकों है कि कोशिकाओं है कि पृथक्करण प्रक्रिया बच प्रतिशत प्रभावित मनाया. इन बीत भ्रूण ऊतक के प्रारंभिक विच्छेदन से कोशिकाओं का प्रवाह cytometry, दोनों को छानने के दौरान और प्रवाह सॉर्टर पर सेल निलंबन के कोमल से निपटने के रूप में अच्छी तरह के रूप एंजाइम dissoc में इस्तेमाल किया प्रकार से अलगाव समय शामिलiation. दोनों आंतों और LUT तेजी विच्छेदन / हदबंदी और सौम्य शर्तों के सेल छँटाई दौरान प्रयोग (17psi, 100 माइक्रोन नोक, 3000 घटनाओं / सेकंड) से लाभ progenitors के अस्तित्व. हमने पाया है कि प्रवाह सॉर्टर में अलगाव से पहले, साधन (मलबे और multiplets सहित सभी घटनाओं) द्वारा मनाया सामग्री की कुल जनसंख्या आम तौर पर या तो भ्रूण आंत या LUT से उत्पन्न सेल dissociates के लिए के बारे में 80% अस्तित्व का प्रदर्शन किया. मलबे और कोशिकाओं के clumps बाहर, आगे तितर बितर (FSC) और साइड बिखराव के लिए प्रारंभिक द्वार (एसएससी) कुल जनसंख्या लगाया गया. तो कुल जनसंख्या के आगे वोल्टेज स्पंद चौड़ाई और ऊंचाई FSC और एसएससी के माप के लिए दोहरी बाहर के लिए ज्यामिति gating के द्वारा एक "बेटी" जनसंख्या को परिष्कृत. इस परिष्कृत "बेटी" जनसंख्या के भीतर अलाभकारी कोशिकाओं कि 7 AAD + बाहर रखा गया है ताकि केवल व्यवहार्य फ्लोरोसेंट EGFP संवाददाता प्रदर्शन कोशिकाओं एकत्र किए गए थे. हम ने कहा कि न्यूरो के लिए अस्तित्व की आवृत्तिइस बेटी जनसंख्या में एनएएल progenitors अपेक्षाकृत कम था जब हदबंदी trypsin + Collagenase का एक मिश्रण है कि नियमित रूप से इस उद्देश्य (0.5% trypsin, Gibco, 10 मिलीग्राम / एमएल Collagenase चतुर्थ, वोर्थिन्ग्तों) के लिए कई मामलों में इस्तेमाल किया है 2,5 में प्रदर्शन किया था - 7. को LUT ऊतक आइसोलेट्स से neuronal progenitors जी के उच्च प्रतिशत प्राप्त करने के लिए, हम ऊतक की हदबंदी के लिए वैकल्पिक उपचार एंजाइम का परीक्षण करने के लिए प्रवाह छँटाई (तालिका 2) के लिए सेल निलंबन प्राप्त. Neuronal progenitors dispase में हदबंदी (5 मिलीग्राम / एमएल) एक कोमल पृथक्करण पद्धति है कि अक्सर तंत्रिका ट्यूब या अन्य तंत्रिका पूर्वज आबादी 11 के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है पर सुधार व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया. हालांकि, सबसे बड़ी व्यवहार्यता Accumax, protease, collagenolytic गतिविधि और अज्ञात अनुपात के DNase, (तालिका 2) के एक मालिकाना मिश्रण के साथ प्राप्त मनाया गया. Accumax में हदबंदी दोनों आंतों का neuronal progenitors और LUT neuronal जनसंपर्क के लिए सबसे अच्छा उत्तरजीविता झुकेंगेदो स्रोतों के बीच अस्तित्व में मामूली अंतर के साथ ogenitors. हमारे परिणाम बताते हैं कि उनकी संवेदनशीलता में हदबंदी शर्तों को अलग neuronal आबादी अलग हो सकता है. इस प्रकार, neuronal progenitors या परिपक्व न्यूरॉन्स को अलग करने की मांग जांचकर्ताओं हदबंदी की स्थितियों का मूल्यांकन करने के लिए उन है कि सबसे बड़ी सेल और अलग ऊतक स्रोतों के लिए जीवित रहने की उपज उत्पादन की पहचान करनी चाहिए. विधि का वर्णन हम परिधीय तंत्रिका तंत्र में इस तरह की प्रक्रियाओं के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है.

    हदबंदी समाधान में एनजाइम % जीवन रक्षा आंत्र एनपी % जीवन रक्षा LUT एनपी
    ट्रिप + Collag 29.5 + / - 8.2%, n = 11 46.2 + / - 8.6%, n = 4
    Dispase 35.1 + / - 9.8%, एन = 10 46.3 + / - 6.6%, n = 9
    Accumax 66.5 + / - 7.8%, n = 8 58.1 + / - 5.2%, एन = 10

    तालिका 2 अलग हदबंदी की स्थिति में neuronal progenitors (एनपी) की व्यवहार्यता.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgments

    लेखकों के फ्लो साझा संसाधन में समर्थन के लिए सेल हदबंदी तरीकों और केविन Weller, डेविड Flaherty और ब्रिटनी Matlock पर सुझाव के लिए कैथरीन Alford चित्र के साथ कलात्मक सहायता के लिए धन्यवाद Vanderbilt विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर और मेलिस्सा ए Musser में चाहते हैं. हम डीआरएस धन्यवाद. जैक Mosher और neuronal progenitors के अलगाव को लागू करने पर सलाह के लिए शॉन मॉरिसन. VMC फ्लो साझा संसाधन के Vanderbilt Ingram कैंसर (CA68485 p30) और Vanderbilt पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (DK058404 p30) के द्वारा समर्थित है. यह काम स्वास्थ्य DK064251 अनुदान, DK086594, और DK070219 अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accumax Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) A7089-100ML Store frozen in 1 ml aliquots
    DNase I Sigma D-4527 Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS,
    (Used in Quench, Quench 1:5)
    10X PBS pH 7.4 Gibco 70011-044 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
    10X HBSS w/o Ca or Mg Gibco 14185-052 Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
    Leibovitz's L-15 medium Gibco 21083027
    Penicillin /Streptomycin 100X Gibco 15140-133 Store aliquoted at -20 °C
    BSA Sigma A3912-100G Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
    Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza 17-737E
    38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane Sefar America 3-38/22 Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
    7-AAD Invitrogen A1310 1 mg/ml
    TRIzol LS Invitrogen 10296-028
    5 ml polystyrene tubes Falcon 352058
    15 ml conical tubes Corning 430790
    Fine Dissecting Forceps Fine Science Instruments 11251-30 Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
    Dissecting Spoon Fine Science Instruments 10370-18

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    तंत्रिका विज्ञान में 66 अंक चिकित्सा आण्विक जीवविज्ञान प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी neuronal progenitors tyrosine hydroxylase माउस विच्छेदन हदबंदी स्वायत innervation तंत्रिका शिखा

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice
    Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.

    The authors middle initials were omitted from the publication of An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice. The author's names have been updated to:

    Dennis P. Buehler, Carrie B. Wiese, S. B. Skelton, E. Michelle Southard-Smith

    from

    Dennis Buehler, Carrie Wiese, S. B. Skelton, Michelle Southard-Smith

    भ्रूण चूहे की आंत अंग से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) स्वायत तंत्रिका progenitors के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया
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    Buehler, D. P., Wiese, C. B.,… More

    Buehler, D. P., Wiese, C. B., Skelton, S. B., Southard-Smith, E. M. An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice. J. Vis. Exp. (66), e4188, doi:10.3791/4188 (2012).

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