Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

Summary

Een geoptimaliseerde procedure om neurale lijst afgeleide neuronale voorlopercellen uit foetaal weefsel muis te zuiveren wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van expressie van fluorescerende reporter allelen van discrete populaties isoleren door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS). De techniek kan worden toegepast neuronale subpopulaties isoleren door ontwikkeling of volwassen weefsels.

Abstract

Tijdens de ontwikkeling neurale lijst (NC)-afgeleide neurale voorlopercellen weg te migreren van de neurale buis op autonome ganglia vormen in viscerale organen zoals de darm en de lagere urinewegen. Zowel tijdens de ontwikkeling als in volwassen weefsels deze cellen worden vaak op grote schaal verspreid over weefsels, zodat isolatie van discrete populaties met behulp van methoden zoals laser capture micro-dissectie moeilijk is. Ze kunnen echter direct worden gevisualiseerd door de expressie van fluorescerende verslaggevers aangedreven door regulerende gebieden van neuron-specifieke genen, zoals Tyrosine hydroxylase (TH). Wij beschrijven een werkwijze geoptimaliseerd voor een hoog rendement van levensvatbare TH + neuronale voorlopers van foetale muis inwendige weefsels inclusief darm en lagere urogenitale (LUT), gebaseerd op dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).

De Th-gen codeert voor het snelheidsbepalende enzym voor de productie van catecholamines. Enteric neuronale voorlopercellen beginnen TH tijdens drukkenIng hun migratie in de foetale darm ¹ en TH is ook aanwezig in een subgroep van de volwassen bekken ganglia neuronen ^2-4. De eerste verschijning van deze lijn en de verdeling van deze neuronen in andere aspecten van de LUT, en hun isolement is niet beschreven. Neuronale voorouders uiten TH kan gemakkelijk worden gevisualiseerd door de expressie van EGFP in muizen die het transgen construct Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. We afgebeeld uitdrukking van dit transgen in foetale muizen om de verdeling van de TH + cellen te documenteren in de ontwikkelingslanden LUT op 15,5 dagen na de coïtus (DPC), de aanwijzing van de ochtend van plug detectie voor 0,5 dpc, en merkte op dat een subset van neuronale voorlopercellen in het samenvoegen bekken ganglia express EGFP.

Om LUT TH + neuronale voorlopercellen te isoleren, hebben we geoptimaliseerde methoden die in eerste instantie werden gebruikt om de neurale lijst stamcellen uit foetaal muis darm ^2-6 te zuiveren. Voorafgaand inspanningen om NC-afgeleide bevolking vertrouwd te isolerenknippen met een cocktail van collagenase en trypsine om celsuspensies te verkrijgen voor flowcytometrie. In onze handen deze methoden celsuspensies uit de LUT met relatief lage levensvatbaarheid. Gezien de al lage incidentie van neuronale voorlopercellen in foetale LUT weefsels, we wilden dissociatie methoden zodanig dat overleving van de cel in de laatste distantieert zou worden verhoogd optimaliseren. We hebben vastgesteld dat zachte dissociatie in Accumax (innovatieve Cell Technologies, Inc), handmatig filteren, sorteren en de stroom bij lage druk liet ons toe om steeds grotere overleving (> 70% van het totaal cellen) bereiken met latere opbrengst van de neuronale voorlopercellen voldoende voor downstream-analyse. De methode beschreven kunnen ruwweg worden toegepast om een ​​verscheidenheid van neuronale populaties isoleren van een foetus of volwassen muizen weefsels.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media (Alle stappen gedaan in weefselkweek kap)

1. Meng de volgende: 44 ml L-15 gemiddeld, 0,5 ml 100X penicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml runderserumalbumine (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml weefselkweek bestemde water. Zorg ervoor dat u goed te mengen BSA en P / S voor het toevoegen. Dit volume is geschikt voor de dissociatie van maximaal vijf verschillende weefsels types. Deze media worden gebruikt in stap 3,4 tot afkoeling van oplossingen voor te bereiden op het gebruik na enzymatische dissociatie van weefsel.
2. Filter Media maar 0,22 pm polyethersulfon (PES) filter.
3. Bereid Balanced Salt 1X Hank's Solution (HBSS) en 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vanaf 10 Voorraden met behulp van weefselkweek bestemde water. Filtreer door 0,22 pm PES filter. Grote hoeveelheden van deze reagentia kan van tevoren worden bereid en bewaard bij 4 ° C, aliquoting kleinere volumes in een weefselkweek kap als nodig is.
4. Vul meerdere 15 ml conische buizen met 1X HBSS (aantal buizen van het aantal weefsels u bij het sub-ontleden) houden buizen op ijs gelijk.

2. Ontleding

1. Euthanaseren getimed zwangere muis in overeenstemming met de institutionele zorg en het gebruik van dieren commissie goedgekeurde protocollen en overdracht baarmoeder in een 60 of 100 mm petrischaal met ijskoud 1X PBS.
2. Verwijder de embryo's van baarmoeder en euthanaseren door onthoofding in ijskoud 1X PBS. Scherm individueel onder fluorescentie verlichting, te verdelen in positieve transgene en wild-type (WT) niet-transgene zwembaden. Houd embryo's in ijskoud 1X PBS hele dissectie.
3. Onder een stereomicroscoop, sub-ontleden het urogenitale kanaal. Houd de embryo in plaats op de voorpoot niveau met een fijne pincet. Verwijder het ingewandenpakket uit de lever tot genitale tuberositas door invoeging tang op het niveau van het membraan dan hard trekken de organen naar beneden en de dorsale lichaamswand.
4. Verdere sub-ontleden het weefsel vanbelangstelling uit de buurt van het omringende weefsel (figuur 1). Leg elk afzonderlijk sub-ontleed weefseltype in een 15 ml conische buis met ijskoud 1X HBSS. Pool elk weefseltype samen op basis van embryo fenotype (dat wil zeggen alle GFP + monsters van foetale darm worden samengevoegd in een 15 ml conische buis).
5. Parallel hieraan ontleden vergelijkbaar weefsels van wild-type embryo's voor vergoeding controles te gebruiken op flowcytometrie.

3. Dissociatie van Subdissected Tissues

1. Pellet sub-doorsneden weefsel door centrifugatie bij 210 relatief centrifugaalkracht (RCF), 4 ° C gedurende 5 minuten. Na centrifugeren af ​​te zuigen zoveel mogelijk HBSS.
2. Resuspendeer het weefsel pellet in Accumax (innovatieve Cell Technologies, Inc), en zorg ervoor dat pipetpunten na elk monster te veranderen om versleping van weefsel soorten te voorkomen. De hoeveelheid toegevoegde Accumax kan worden aangepast voor grotere of kleinere hoeveelheden weefsel. Typisch voor een-5 Foetale darm monsters 1 ml Accumax worden gebruikt, maar grotere weefsel groepen zullen grotere volume dissociatie bereiken.
3. Place buizen in 37 ° C waterbad 20-45 min afhankelijk fase van het weefsel worden geïsoleerd (bijv. 13,5 dpc darm 20 min, 15,5 dpc darm 35 min). Halverwege hoewel de dissociatie tijd, handmatig breken het weefsel door kloppen de buis tegen de zijkant van het waterbad (of een stevige ondergrond) en door "vegen" de buis (als men zou schudden een ouderwetse kwik thermometer). Aan het einde van de dissociatie tijd herhaalt u de shake down procedure meerdere malen om verder te distantiëren van het monster. Voor meer kwetsbare monsters, vermindering van de vigorousness van de shake down en in plaats daarvan pipet trituratie gebruiken tijdens de Step 3,5 tot een passend niveau van dissociatie te bereiken. Typische dissociatie tijden voor 14,5 en 15,5 dpc dpc LUT zijn 35 en 45 min, respectievelijk.
4. Terwijl weefsel wordt incuberen in Accumax, make-up Quenching zolutions, genaamd Quench en Quench 1:5. Quench wordt bereid door 45 ul 5 mg / ml DNase I tot 6 ml L-15 media. Doof 01:05 wordt bereid door 45 ul 5 mg / ml DNase I 30 ml L-15 media.
5. Aan het einde van dissociatie, verplaatsen 15 ml buizen op ijs en onmiddellijk 1 ml Quench toe te voegen aan elke buis. Vermaal elk monster op en neer tot weefsel is bijna volledig gescheiden (figuur 2). Er blijft kleine stukken weefsel in de oplossing. Het bereiken van een volledig homogeen monster is niet eenvoudig haalbaar en niet wenselijk omdat het kan leiden tot een slechte levensvatbaarheid van de cellen.
6. Houd monster op ijs zoveel mogelijk voor de rest van het protocol. Zorg ervoor dat u een frisse pipetpunt gebruiken bij het pipetteren Quench of Quench 1:5 tot cross-contaminatie van monsters te voorkomen.

4. Filteren celsuspensie

1. Behulp van een tang die gedrenkt in 70% ethanol, plaatsen van 3 cm vierkant 38 urn nylon membraan (Sefar Amerika) viamond van een nieuwe 15 ml conische buis. Filter cellen door de maas pipetteren in het midden van membraan nauwe boring uiteinden. Als het membraan verzadigd tijdens het filteren, verwijderen, drogen de mond van de buis met een kimwipe, en gebruik een nieuw stuk van nylon mesh aan de rest van celsuspensie te filteren. Als alle cellen zijn gefilterd, gebruik dan 1 ml Quench 1:5 tot spoelen van de buis en de resterende cellen te filteren.
2. Bij het filteren is voltooid, of bij het vervangen van een verstopte membraan, een tang om de handen uit de zijkanten van het gaas en het membraan over de bovenkant van de buis vegen aan een opknoping druppels van cellen te verwijderen.
3. Pellet celsuspensie door centrifugatie bij 210rcf, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatans voorzichtig af en resuspendeer pellet in 1 ml Quench 1:5.
4. Filter celsuspensie door middel van nylon mesh in 5 ml polystyreen buizen. Spoel de 15 ml buis met 1 ml Quench 1:5 en filter om alle resterende cellen vast te leggen.

5. Voorbereiding van de monsters voor de FACS

Bij gebruik hetzelfde weefsel voor het sorteren en compensatie controles overdragen ^1/10 tot 1/20 ^e van het monstervolume een nieuw 5 ml polystyreenbuis gebruiken voor compensatie controles. Deel de wild-type weefsel in twee delen. Een deel wordt ongekleurd wild-type (WT slechts) terwijl de tweede helft zal 7-Aminoactinomycin D (7 AAD een fluorescentielamp intercalator buiten levende cellen als "levensvatbaarheid vlek") toegevoegd (7-AAD alleen ). Deze individuele controles zijn nodig om voor vergoeding van spectrale overlap tussen de uitstoot van discrete fluoroforen op de stroom sorter. Bijvoorbeeld, voor een fluorescerende reporter zoals EGFP, noodzakelijk bediening omvat: EGFP alleen ongekleurde WT cellen en een buis gekleurd met 7 AAD alleen (figuur 3).

Vul de 5 ml buizen met celsuspensie met Quench 1:5 en centrifugeer 210rcf, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig supernatant, waardoor ongeveer 200 pi vloeistofin de buis.

Verdunnen 7-AAD 1:1000 in Quench 1:5. Voeg 7-AAD vlekken te verdunnen tot 7-AAD alleen compensatieregeling, en monsters worden gesorteerd. Voeg geen 7-AAD om de EGFP alleen of WT enige vergoeding controles. Volume 7 AAD worden toegevoegd hangt af van de hoeveelheid uitgangsmateriaal en de grootte van celpellet verkregen. Als 7-AAD is toegevoegd aan de juiste buisjes, monsters zijn klaar om te worden gesorteerd.

Weefsel	Voorbeeld Pool Maat	Volume 7 AAD worden toegevoegd aan de buis *
15,5 dpc darm	1-5	200 pi
15,5 dpc LUT	1-5	150 ul

Tabel 1. Hoeveelheid 7 AAD toegevoegd om verschillende weefsels dissocieert * De uiteindelijke totale hoeveelheid in elke buis varieert met een bedrag gaande 50 tot 100 ul aangezien het wegzuigen van media is eenn benadering proces uitgevoerd om de pellets te voorkomen. Laatste delen zijn niet gemeten met gebruik van cellen in oplossing voorkomen.

Bereid collectie buizen aan cellen voor RNA-isolatie vast te leggen door het toevoegen van 0,75 ml TRIzol-LS tot 1,5 ml microcentrifugebuizen.

Als het vergaren van cellen in vitro in plaats RNA isolatie soort cellen direct in zelfvernieuwing media in 6 well kultuurplaten, bekleed met fibronectine en gevuld met media zoals hierboven beschreven. ^2,6,7

6. Flowcytometrie

1. Op de flowcytometer, de evaluatie van de vergoeding controles eerste, zorg ervoor om terug te spoelen na elk monster om besmetting te voorkomen. Gebruik de profielen van de vergoeding monsters spanningen / poorten voor het sorteren in te stellen. Merk op dat als positieve cellen in de gewenste weefsel aanwezig in het beperken aantallen een afzonderlijke weefsel kan de compensatie hier vast zolang de fluorescentie-intensiteit en celgroottetussen de monsters zijn vergelijkbaar.
2. Stel vergoeding parameters en hekken om de dode cellen die het nemen van 7-AAD kleurstof en het verzamelen van cellen vertonen een hoge intensiteit van de GFP-fluorescentie ten opzichte van ongekleurde controles (figuur 4) te voorkomen.
3. Sorteer maximaal 25.000 cellen in elk microcentrifugebuis. Het sorteren moet worden uitgevoerd tegen de laagst mogelijke druk met een brede boring mondstuk en een laag debiet (bijv. 17psi, 100 micrometer mondstuk, 3000 events / sec) tot neuronale voorlopercellen levensvatbaarheid te behouden. Voor de soorten aan EGFP + cellen te isoleren wij onze isolaties op een BD Biosciences FACSAriaII met behulp van een 488nm 20mW laser om de EGFP verslaggever te wekken.
4. Indien monsters bevatten hoge concentraties cel, is het raadzaam om de celsuspensie verder met behulp van 1:1000 7-AAD vlek tot een hogere efficiëntie te bereiken vastleggen bij het sorteren te verdunnen.
5. Vortex elke buis van cellen opgenomen in TRIzol, LS onmiddellijk na het sorteren.

7. Representatieve resultaten

Tissue dissociatie naar een cel suspensies voor flow sorteren produceren is een delicaat evenwicht tussen voldoende enzymatische vertering en het vermijden van over-verbranding die kan resulteren in een lage levensvatbaarheid van de cellen. Een voorbeeld van gewenste dissociatie weefsel wordt in figuur 2. In de juiste verteerd weefsel voor handmatige trituratie stukken van sub-ontleed organen zijn nog steeds duidelijk zichtbaar (Figuur 2b, 2f). In weefsels die enzymatisch behandeld gedurende een te lange tijd of een te hoge concentratie van enzym, de verkregen suspensie ontbreekt resten grote stukken weefsel (figuur 2d, 2H).

Geschikte dissociatie en handmatige filtreren produceren soort profielen bij flowcytometrie dat vertonen typisch meer dan 90% levensvatbare cellen vertonen hoge EGFP uitdrukking (figuur 4). Celpopulaties volgens deze methode verkregen illustreren goedlevensvatbaarheid en kunnen worden vastgelegd voor latere cultuur of de analyse van genexpressie door gating voor het vastleggen van EGFP + neuronale voorlopercellen.

Figuur 1. Verdeling van de TH-EGFP + neuronale voorlopercellen in foetale muis LUT. Whole-mount urogenitale kanaal op 15,5 dpc ventraal bekeken onder helderveld verlichting (a) in vergelijking met de distributie van EGFP + cellen gelabeld door TH-EGFP expressie van het transgen die in het kader fluorescentie verlichting (b). TH-EGFP expressie in bijnieren (a) en mediaal gelegen celiac kernen (cg). Lateral (c) visie van 15,5 dpc TH-EGFP sub-ontleed blaas tentoonstellingen fluorescentie van transgene expressie in het bekken ganglia (PG), de blaaswand (BLA) en urethra (u). In het dorsale weergave (d) EGFP + cellen zijn duidelijk in de anterieure dorsale plasbuis. Andere labels: nieren (k), testis (t), blaas (BLA) en genitale tuberkel (gt).

Figuur 2. Helderveld beelden van 15 dpc foetaal LUT (a) en darm (e) respectievelijk afgebeeld halverwege de dissociatie incubatieperiode aan het einde van de dissociatie incubatie bij onderbreking (b, f), na handmatig onderbreking (c, g) en in een monster dat is overdreven gedissocieerd (d, h).

Figuur 3. Schematische diagram illustreert vergoeding regelt die nodig zijn om strenge FACS gating parameters vast te stellen.

Figuur 4. Representatieve beeld van de stroming soort profielen op 14,5 dpc (a) en 15,5 dpc (b). Zwarte bevolking bestaat uit enkele cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing die dood en gelabeld door7-AAD fluorescentie. Gray bevolking bestaat uit singlet cellen op basis van voor-en zijwaartse verstrooiing die zijn uitgesloten 7-AAD en zijn dus levensvatbaar zijn. Green gated bevolking wordt aangegeven met boxed "GFP +"-gebied en bestaat uit enkele cellen die zijn uitgesloten 7-AAD (levensvatbare) en vertonen EGFP fluorescentie.

Discussion

Muis reporter lijnen uitdrukken TL-verslaggevers zijn steeds op grote schaal beschikbaar via diverse inspanningen in het muizen genetica gemeenschap ^1,8,9. Als gevolg van de dissociatie methode hier weergegeven kan breed worden toegepast voor het isoleren van discrete neuronale subtypes op neurotransmitters of receptor expressiepatronen van een foetaal of volwassen weefsels. Hoewel we deze methode geoptimaliseerd op basis van de expressie van een transgen fluorescerende reporter kan ook worden toegepast op monsters expressie celoppervlaktereceptoren gelabeld door levende cellen immuno-labeling methoden ^3-5,10.

In onze handen zagen we een aantal factoren dat het percentage van cellen die de dissociatie procedure overleefd beïnvloed. Deze omvatten tijd tussen de eerste sectie van foetaal weefsel isolatie van cellen door flowcytometrie verpompen van celsuspensies zowel tijdens het filteren en de stroom sorteerinrichting, en het enzym dat wordt gebruikt in dissociation. Het voortbestaan ​​van zowel gastro-intestinale en LUT voorouders profiteerde van een snelle dissectie / dissociatie en het gebruik van zachte omstandigheden tijdens celsortering (17psi, 100 micron mondstuk, 3000 events / sec). We vonden dat voorafgaand aan isolatie op de stroom sorter, over het algemeen de totale bevolking van materiaal waargenomen door het instrument (alle evenementen, zoals puin en meerling) ongeveer 80% overleving voor mobiele distantieert gegenereerd op basis van een foetale darm of LUT tentoongesteld. Om vuil en groepjes van cellen uit te sluiten, de eerste poorten voor voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) zijn opgelegd aan de totale bevolking. Dan is de totale bevolking is verder verfijnd om een ​​"dochter" bevolking door spanningspuls geometrie gating voor breedte en hoogte meten van FSC en SSC aan wambuizen uit te sluiten. Binnen deze verfijnde "dochter" bevolking niet-levensvatbare cellen die zijn 7-AAD + werden uitgesloten, zodat alleen levensvatbare cellen vertonen de tl-EGFP reporter werden verzameld. We zagen dat de frequentie van de overleving voor neurointerne voorlopers in de dochter populatie relatief laag in dissociatie werd uitgevoerd in een mengsel van trypsine + collagenase die routinematig wordt in vele gevallen voor dit doel (0,5% trypsine, Gibco, 10 mg / ml Collagenase IV, Worthington) ^{2,5 - 7.} Hogere percentages overlevende neuronale voorlopercellen uit LUT weefsel isolaten verkrijgen we getest alternatieve enzym behandelingen voor dissociatie van weefsel te leiden celsuspensies voor doorstroming sorteren (tabel 2). Neuronale voorouders tentoongesteld verbetering van de rentabiliteit bij de dissociatie in Dispase (5 mg / ml) een zachte dissociatie methode die vaak wordt gebruikt voor de isolatie van neurale buizen of andere neurale voorlopercellen populaties ^11. De grootste waargenomen levensvatbaarheid werd verkregen met Accumax, een melange van protease, collagenolytische activiteit en DNase onbekende verhouding (tabel 2). Dissociatie in Accumax leverde de beste overlevingskansen voor beide enterische neuronen voorlopers en LUT neuronale progenitors met een bescheiden verschillen in overleving tussen de twee bronnen. Onze resultaten suggereren dat verschillende neuronale populaties kunnen in hun gevoeligheid voor verschillen dissociatie omstandigheden. Daarom moet onderzoekers willen neuronale voorlopercellen of rijpe neuronen te isoleren evalueren dissociatie voorwaarden als die die de grootste cel overleving en de opbrengst voor de verschillende weefsels te produceren bronnen te identificeren. De methode beschreven dient als startpunt voor deze procedures in het perifere zenuwstelsel.

Enzym in dissociatie oplossing	% Survival Enteric NP	% Survival LUT NP
Tryp + Collag	29,5 + / - 8,2%, n = 11	46,2 + / - 8,6%, n = 4
Dispase	35,1 + / - 9,8%, n = 10	46,3 + / - 6,6%, n = 9
Accumax	66,5 + / - 7,8%, n = 8	58,1 + / - 5,2%, n = 10

Tabel 2. Levensvatbaarheid van neuronale voorlopers (NP) in verschillende dissociatie omstandigheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18