En optimeret Fremgangsmåde til fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) Isolering af autonome Neurale stamceller fra indre organer af føtale Mus

Summary

En optimeret fremgangsmåde til oprensning af crista neuralis-afledte neuronale stamceller fra føtale musevæv er beskrevet. Denne fremgangsmåde drager fordel af ekspression fra fluorescerende reportermolekyler alleler at isolere diskrete populationer af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Teknikken kan anvendes til at isolere neuronale underpopulationer hele udviklingen og fra voksne væv.

Abstract

Under udviklingen crista neuralis (NC)-afledte neuronale progenitorceller migrere væk fra neuralrøret til dannelse autonom ganglier i indre organer såsom tarmen og nedre urinveje. Både under udvikling og i modne væv disse celler er ofte meget spredt over hele væv, så isolation af diskrete populationer ved hjælp af metoder som laser capture mikro-dissektion er vanskelig. De kan imidlertid være umiddelbart visualiseres ved ekspression af fluorescerende reportere drevet fra regulatoriske regioner af neuron-specifikke gener, såsom tyrosinhydroxylase (TH). Beskriver vi en fremgangsmåde optimeret til høje udbytter af levedygtige TH + neuronale progenitorceller fra føtale mus viscerale væv, herunder tarm og nedre urogenital kanal (LUT), baseret på dissociation og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS).

Th-genet koder det hastighedsbegrænsende enzym til fremstilling af catecholaminer. Enteriske neuronale forfædre begynde at udtrykke TH durheder deres migration i fosterets tarmen ¹ og TH er også til stede i en delmængde af voksne bækken ganglier neuroner ^2-4. Den første forekomst af denne slægt, og fordelingen af ​​disse neuroner i andre aspekter af LUT og deres isolation er ikke blevet beskrevet. Neuronale progenitorceller, der udtrykker TH kan let visualiseres ved ekspression af EGFP i mus, der bærer den transgene konstruktion Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Vi afbildet ekspression af dette transgenet i føtale mus for at dokumentere fordelingen af ​​TH +-celler i udviklingen LUT på 15,5 dage efter coitus (DPC), designeret morgenen proppen detektion 0,5 DPC, og observeret, at et undersæt af neuronale progenitorceller i sammenflydningsmidlet bækken ganglier udtrykker EGFP.

At isolere LUT TH + neuronale stamceller vi optimeret metoder, der oprindeligt blev anvendt til at oprense crista neuralis stamceller fra føtale mus tarmen ^2-6. Tidligere bestræbelser på at isolere NC-afledte befolkninger påberåbtefordøjelse med en cocktail af collagenase og trypsin til opnåelse cellesuspensioner til flowcytometri. I vore hænder disse metoder er produceret cellesuspensioner fra LUT med relativt lav levedygtighed. I betragtning af den allerede lave forekomst af neuronale stamfædre i føtale LUT væv, begiver vi os ud for at optimere dissociationshastigheder metoder, således at celle overlevelse i de sidste dissocieres ville blive øget. Vi fastslået, at blid dissociation i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.), manuel filtrering, og flow sortering ved lave tryk tillod os at opnå en ensartet større overlevelse (> 70% af den samlede celler) med efterfølgende udbytter på neurale stamceller er tilstrækkeligt til nedstrøms analyse. Fremgangsmåden beskriver vi kan bredt anvendes til at isolere forskellige neuronale populationer fra enten føtale eller væv fra voksne mus.

Protocol

1. Fremstillinq af medier (Alle trin udføres i vævskultur hætte)

1. Kombinere følgende: 44 ml L-15 medium, 0,5 ml 100X penicillin / streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml vævskulturkvalitet vand. Sørg for at blande BSA og P / S grundigt, før du tilføjer. Dette rumfang bør være tilstrækkelige til dissociation af op til fem forskellige væv typer. Dette medie vil blive anvendt i trin 3.4 til fremstilling quenching opløsninger til anvendelse efter enzymatisk dissociation af væv.
2. Filtrer Medier om end 0,22 um polyethersulfon (PES) filter.
3. Forberede 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) og 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) fra 10X Lagre anvendelse vævskulturkvalitet vand. Filtreres gennem 0,22 um PES filter. Store mængder af disse reagenser kan fremstilles i forvejen og opbevares ved 4 ° C, udportionering mindre mængde i en vævskultur hætte efter behov.
4. Fylde flere 15 ml koniske rør med 1X HBSS (Antallet af rør til lig med antallet af væv du har planer om sub-dissekere) at holde rørene på is.

2. Dissection

1. Afliv timet gravid mus i overensstemmelse med institutionel pasning af dyr og brug udvalget godkendte protokoller og overførsel livmoder i en 60 eller 100 mm petriskål indeholdende iskold 1X PBS.
2. Fjern embryoner fra livmoderen og aflive ved halshugning i iskoldt 1X PBS. Skærmen individuelt under fluorescens belysning, opdeling i positive transgene og vildtype (WT) non-transgene pools. Hold embryoner i iskoldt 1X PBS hele dissektion.
3. Under et dissektionsmikroskop,-sub dissekere urogenitalkanalen. Hold embryo på plads på det forben niveau med fine pincet. Fjerne indvolde fra leveren ned til genital tuberkel ved at indsætte en pincet på niveau med membranen derefter raskt trække de indre organer ned og væk fra den dorsale kropsvæggen.
4. Yderligere sub-dissekere vævinteresse væk fra omgivende væv (figur 1). Placere hver enkelt sub-dissekeret vævstype i en 15 ml konisk rør indeholdende iskolde 1X HBSS. Pool hver vævstype sammen i henhold til embryo fænotype (dvs. alle GFP + prøver af fostrets tarmen samles i en enkelt 15 ml konisk rør).
5. Parallelt hermed dissekere sammenlignelige væv fra vildtype-embryoner til brug for kompensation kontrollen ved flowcytometri.

3. Dissociation af Subdissected Væv

1. Pelleten sub-dissekerede væv ved centrifugering ved 210 relative centrifugalkraft (RCF), 4 ° C i 5 min. Efter centrifugering off aspireres så meget HBSS som muligt.
2. Resuspender vævspellet i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.), sørg for at ændre pipettespidser mellem hver prøve for at undgå krydskontaminering af vævstyper. Mængden af ​​Accumax tilsat kan skaleres til større eller mindre mængder af væv. Typisk til en-5 Føtale tarmen prøver, 1 ml Accumax ville blive anvendt, men større væv pools vil kræve en større mængde til at opnå dissociation.
3. Rørene anbringes i 37 ° C vandbad i 20-45 minutter, afhængigt stadium af væv, der isoleres (f.eks 13,5 dpc tarmen 20 min, 15,5 dpc tarmen 35 min). Halvvejs skønt dissociation tiden nedbryde manuelt op vævet ved at banke på glasset mod siden af ​​vandbadet (eller fast overflade) og "flicking" røret (som man ville ryste en gammeldags kviksølvtermometer). Ved afslutningen af ​​dissociation tid gentages ryste proceduren flere gange yderligere dissociere prøven. For mere skrøbelige prøver, reducere kraftfuldhed af rystelser ned og i stedet bruge pipetten trituration under Trin 3,5 til at nå et passende niveau af dissociation. Typiske dissociation tider for 14,5 dpc og 15,5 dpc LUT er 35 og 45 min.
4. Mens væv inkubation i Accumax, fyldes op Quenching sålutions, betegnes Quench og slukke 1:5. Dæmpningen er fremstillet ved tilsætning af 45 gl 5 mg / ml DNase I til 6 ml L-15 medie. Dæmpning 01:05 fremstilles ved tilsætning af 45 gl 5 mg / ml DNase I til 30 ml L-15 medie.
5. Ved slutningen af ​​dissociation, bevæger 15 ml rør på is og øjeblikkeligt tilsættes 1 ml Quench til hvert rør. Tritureres hver prøve op og ned, indtil vævet er næsten fuldstændig dissocieret (figur 2). Der vil stadig være nogle små stykker væv til stede i opløsningen. Opnåelse af en fuldstændig homogen prøve er hverken let opnåelige eller ønskelig, da det kan resultere i dårlig cellelevedygtighed.
6. Hold prøve på is så meget som muligt for resten af ​​protokollen. Sørg for at bruge en frisk pipettespids ved pipettering op Quench eller udslukke fra 1:5 til at undgå krydskontaminering af prøver.

4. Filtrering Cell Suspension

1. Ved hjælp af pincetter, der er blevet gennemvædet i 70% ethanol, anbringes en 3 cm kvadrat på 38 um nylonnet membran (Sefar USA) iMundingen af ​​en ny 15 ml konisk rør. Filterceller gennem maske ved pipettering i midten af ​​membranen ved hjælp af snævre boring spidser. Hvis membranen bliver mættet, mens filtrering, fjerne det, tør i munden af ​​røret med en Kimwipe, og bruge et nyt stykke nylonnet for at filtrere resten af ​​cellesuspension. Når alle celler er blevet filtreret, skal du bruge 1 ml Quench fra 1:5 til skylle røret og filtrere de resterende celler.
2. Ved filtrering er afsluttet, eller når udskiftning af en tilstoppet membran med pincet til at rulle op på siderne af masken og tørres membranen hen toppen af ​​røret for at fjerne eventuelle hængende dråber af celler.
3. Pelleten cellesuspension ved centrifugering ved 210rcf, 4 ° C i 5 min. Aspirer off supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml Quench 1:5.
4. Filteret cellesuspensionen gennem nylon mesh i 5 ml polystyrenrør. Skyl 15 ml reagensglas med 1 ml Quench 1:5 og filter til at fange eventuelle resterende celler.

5. Fremstilling af prøver til FACS

Hvis du bruger det samme væv til sortering og til kompensation kontrol, overføre 1/10 ^th til 1/20 ^th af prøven volumen til en ny 5 ml polystyrenrør til brug for kompensation kontrol. Opdele vildtype-vævsprøve i to portioner. En portion bliver ufarvede vildtype (WT Kun), mens den anden halvdel får 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, et fluorescerende interkalator udelukket fra levende celler, der anvendes som en "levedygtighed plet") blev tilsat til den (7-AAD kun ). Disse individuelle kontroller er nødvendige for at give mulighed for kompensation af nogen spektral overlapning mellem emission af diskrete fluoroforer på strømmen sorter. For eksempel, for en enkelt fluorescerende reporter som EGFP ville nødvendige kontrol omfatter: EGFP kun ufarvede WT celler, og et rør farvet med 7-AAD alene (figur 3).

Fylde alle 5 ml rør indeholdende cellesuspension med Quench 1:5 og centrifuge ved 210rcf, 4 ° C i 5 min. Aspirer supernatant, hvilket efterlader ca 200 ml flydendei røret.

Fortyndes 7-AAD 1:1000 i Quench 1:5. Tilsæt 7-AAD farvning fortynding til 7-AAD eneste kompensation, kontrol og prøver, der skal sorteres. Må ikke tilsættes 7-AAD til EGFP eneste eller WT eneste kompensation kontrol. Volumen af ​​7-AAD skal tilsættes, vil variere baseret på mængden af ​​udgangsmateriale og opnået størrelse cellepellet. Når først 7-AAD er tilsat passende rør, prøver er klar til at blive sorteret.

Tissue	Sample Pool størrelse	Bind 7-AAD skal tilsættes til røret *
15,5 DPC Tarmen	1-5	200 ul
15,5 DPC LUT	1-5	150 ul

Tabel 1. Mængde 7-AAD tilsat til forskellige væv dissocierer * Det endelige samlede i hvert rør, vil variere med en mængde i området fra 50 til 100 ul siden aspirering af medium er enn omtrentlige, og udføres for at undgå af pellet. Slutvolumener ikke måles for at minimere håndteringen af ​​celler i opløsningen.

Forberede opsamlingsrør for at fange celler til RNA-isolering ved tilsætning 0,75 ml TRIzol-LS til 1,5 ml mikrocentrifugerør.

Hvis opsamling af celler til in vitro dyrkning, snarere end RNA-isolering, sortere celler direkte ind selvfornyelse medier i 6-brønds vævskulturplader belagt med fibronectin og fyldt med medie som tidligere beskrevet. ^2,6,7

6. Flowcytometri

1. På flowcytometer, vurdere erstatningen kontroller først, og sørg for at ryggen skylle mellem hver prøve at undgå forurening. Brug profilerne af kompensation prøver at sætte spændinger / porte til sortering. Bemærk, at hvis positive celler i det ønskede væv er til stede i begrænsende tal, kan en særskilt væv anvendes til at etablere kompensation indstillinger så længe fluorescensintensitet og cellestørrelsemellem prøverne er sammenlignelige.
2. Indstillet kompensation parametre og porte for at undgå døde celler, der optager 7-AAD farvestof og opsamle cellerne udviser høj intensitet af GFP-fluorescens i forhold til ufarvede kontroller (figur 4).
3. Sortere maksimalt 25.000 celler i hver mikrocentrifugerør. Sortering skal udføres på det lavest mulige tryk med en bred boring dyse og lav strømningshastighed (fx 17psi, 100 um dyse, 3000 hændelser / sek) til at bevare neuronal progenitor levedygtighed. For mulige at isolere eGFP +-celler, vi udfører vores isoleringer på en BD Biosciences FACSAriaII ved hjælp af en 488 nm 20mW laser til at vække EGFP reporter.
4. Hvis prøverne indeholder høje cellekoncentrationer, er det tilrådeligt at fortynde cellesuspensionen yderligere hjælp 1:1000 7-AAD pletten for at opnå højere capture effektivitet ved sortering.
5. Vortex hvert rør af celler indfanges i TRIzol-LS umiddelbart efter sortering.

7. Repræsentative resultater

Væv dissociation til at producere et cellesuspensioner til flow sortering er en delikat balance mellem tilstrækkelig enzymatisk fordøjelse og undgå over-fordøjelsen, der kan resultere i lav celle levedygtighed. Et eksempel på det ønskede niveau af væv dissociation er vist i figur 2. Under passende fordøjede væv før manuelle triturering stykker sub-dissekerede organer stadig tydeligt (figur 2b, 2f). I væv, der er enzymatisk behandlet for lang tid, eller ved for høj en koncentration af enzym, mangler den resulterende suspension eventuelle overskydende store stykker af væv (figur 2d, 2H).

Passende dissociation og manuel filtrering producere sortere profiler ved flowcytometri som typisk udviser større end 90% levedygtige celler og udviser høje niveauer af EGFP ekspression (figur 4). Cellepopulationer opnået ved denne metode viser godlevedygtighed og kan blive fanget for efterfølgende kultur eller analyse af genekspression ved gating for indfangning af EGFP + neuronale stamceller.

Figur 1. Fordeling af TH-EGFP + neuronale progenitorceller i føtal mus LUT. Hele-mount urogenitalkanalen på 15,5 dpc set ventralt i stærk feltbelysning (a) i forhold til fordelingen af ​​eGFP +-celler mærket med TH-EGFP transgenekspression identificeret under fluorescens belysning (b). TH-EGFP ekspression er til stede i binyrer (a) og medialt placeret ganglia celiaca (CG). Lateral (c) afbildning af 15,5 dpc TH-EGFP sub-dissekerede blære udviser fluorescens fra transgen ekspression i bækken ganglier (PG), blærevæggen (bla) og urethra (u). I dorsale visning (d) eGFP +-celler er tydelig i den forreste dorsale urinrøret. Andre etiketter: nyrer (k), testikler (t), blære (bla) og genital tuberkelbakterier (BT).

Figur 2. Brightfield billeder af 15 dpc foster LUT (a) og tarm (e) henholdsvis afbildes halvvejs gennem dissociation inkubationsperiode ved afslutningen af dissociationen inkubation før afbrydelse (b, f), efter manuel forstyrrelser (c, g), og i en prøve, der er overdrevent dissocieret (d, H).

Figur 3. Diagram illustrerer kompensation styrer nødvendig for at fastlægge strenge FACS gating parametre.

Figur 4. Repræsentativt billede af flow sortere profiler på 14,5 dpc (a) og 15,5 dpc (b). Sort population består af enkelte celler baseret på frem-og sidespredning som er døde og mærket ved7-AAD fluorescens. Gray population består af singlet celler baseret på frem-og sidespredning som har udelukket 7-AAD og således levedygtige. Grøn gated population er angivet ved kasser "GFP +"-området og består af enkelte celler, der er udelukket 7-AAD (levedygtig) og udviser EGFP fluorescens.

Discussion

Mus reporter linjer udtrykker fluorescerende reportere bliver bredt tilgængelige via flere bestræbelser i murine genetik samfund ^1,8,9. Som et resultat dissociationen fremgangsmåden illustreret her, kan bredt anvendes til isolering af diskrete neuronale undertyper baseret på neurotransmitter-eller receptor ekspressionsmønstre fra enten føtale eller voksen væv. Mens vi har optimeret denne metode baseret på ekspression af en fluorescerende transgen reporter, kan den også anvendes på prøver, der udtrykker celleoverflade-receptorer mærket med levende celle immuno-mærkningsmetoder ^3-5,10.

I vores hænder observerede vi en række faktorer, der påvirker den procentdel af celler, der overlevede dissociation procedure. Disse indbefatter forløbet tid fra den indledende dissektion af føtalt væv til isolering af celler ved flow-cytometri, skånsom håndtering af cellesuspensioner både under filtrerings-og strømmen sorteringsenheden, såvel som det enzym type, der anvendes i dissociation. Overlevelse både enteriske og LUT progenitorer omfattet af hurtige dissektion / dissociation og anvendelse af milde betingelser under cellesortering (17psi, 100 micron dyse, 3000 hændelser / sek). Vi fandt, at forud for isolation på strømmen sorteringsanlæg, den samlede population af materiale observeret af instrumentet (alle arrangementer, herunder affald og multipletter) generelt udstillet omkring 80% overlevelse for celle distancerer genereret fra enten føtal tarmen eller LUT. For at udelukke debris og klumper af celler, de første porte for Forward Scatter (FSC) og sidespredning (SSC) blev pålagt denne samlede population. Så samlede befolkning yderligere raffineres for at en "datter" befolkning ved spændingspuls geometri gating for bredde og højde måling af FSC og SSC at udelukke dubletter. Inden for denne raffineret "datter" population ikke-levedygtige celler, som er 7-AAD + blev udelukket, således at kun levedygtige celler, der udviser den fluorescerende EGFP reporter blev opsamlet. Vi observerede, at frekvensen af ​​overlevelse for neuronale progenitorer i denne datter population var relativt lavt, når dissociation blev udført i en blanding af trypsin + collagenase, der rutinemæssigt anvendes i mange tilfælde til dette formål (0,5% trypsin, Gibco, 10 mg / ml collagenase IV, Worthington) ^{2,5 - 7.} Til opnåelse af højere procentdele af overlevende neuronale stamceller fra LUT væv isolater, testede vi alternative enzymbehandlinger for dissociation af væv for at udlede celleopslæmninger for strømning sortering (tabel 2). Neuronale progenitorceller udviste forbedret levedygtighed efter dissociation i dispase (5 mg / ml) en blid dissociation metode, der ofte anvendes til isolering af neurale rør eller andre neurale progenitorpopulationer ^11. Imidlertid den største levedygtighed observeret blev opnået med Accumax, en navnebeskyttet blanding af protease collagenolytisk aktivitet og DNase ukendte proportioner (tabel 2). Dissociation i Accumax gav bedste overlevelse for både enteriske neuronale progenitorer og LUT neuronal progenitors med beskedne forskelle i overlevelse mellem de to kilder. Vore resultater antyder, at forskellige neuronale populationer kan variere i deres følsomhed overfor dissociation betingelser. Derfor skal efterforskerne søger at isolere neuronale stamfædre eller modne neuroner vurdere dissociationshastigheder forhold til at identificere dem, der producerer den største celle overlevelse og udbytte for forskellige vævskilder. Fremgangsmåden beskriver vi tjener som udgangspunkt for sådanne procedurer i det perifere nervesystem.

Enzym i dissociation opløsning	% Overlevelse enteriske NP	% Overlevelse LUT NP
Tryp + Collag	29,5 + / - 8,2%, n = 11	46,2 + / - 8,6%, n = 4
Dispase	35,1 + / - 9,8%, n = 10	46,3 + / - 6,6%, n = 9
Accumax	66,5 + / - 7,8%, n = 8	58,1 + / - 5,2%, n = 10

Tabel 2 nedenfor. Levedygtighed neuronale progenitorceller (NP) i forskellige dissociations betingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18