Ett optimerat förfarande för fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) Isolering av autonom neural progenitorer från viscerala organ för Fetala Möss

Summary

En optimerad förfarande för att rena neurallist-härledda neuronala stamceller från foster musvävnader beskrivs. Detta förfarande drar fördel av expression från fluorescerande reportergrupper alleler för att isolera diskreta populationer av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS). Tekniken kan tillämpas för att isolera neuronala subpopulationer genom hela utvecklingen, eller från vävnader från vuxna.

Abstract

Under utveckling neurallisten (NC)-härledda neuronala progenitorceller migrera bort från det neurala röret för att bilda autonom ganglier i inre organ såsom tarmen och nedre urinvägarna. Både under utveckling och mogna vävnader dessa celler är ofta spridda över hela vävnader så att isolering av diskreta populationer med hjälp av metoder som laser capture mikro-dissektion är svårt. De kan emellertid direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande reportrar drivna från regulatoriska regioner av neuron-specifika gener såsom tyrosinhydroxylas (TH). Vi beskriver ett förfarande optimeras för höga utbyten av livskraftiga TH + neuronala progenitorceller från fetala mus viscerala vävnaderna, inklusive tarmen och nedre urogenitalområdet (LUT), baserat på dissociation och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS).

TH-genen kodar det hastighetsbegränsande enzymet för produktion av katekolaminer. Enteriska neuronala stamceller att börja uttrycka TH durning sin vandring i fosterställning tarmen ¹ och TH är också närvarande i en delmängd av vuxna bäcken ganglier neuroner ^2-4. Det första uppträdandet av denna härstamning och fördelningen av dessa neuroner i andra aspekter av LUT och deras isolering har inte beskrivits. Neuronala stamceller uttrycker TH kan lätt visualiseras genom uttryck av EGFP i möss som bär på transgenen konstruktionen Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Vi avbildas uttryck för denna transgen i foster möss för att dokumentera fördelningen av TH + celler i utvecklingsländerna LUT vid 15,5 dagar efter coitus (DPC), betecknar morgonen plug-avkänning som 0,5 DPC, och konstaterade att en delmängd av neuronala stamceller i koalescerande bäcken ganglierna express EGFP.

För att isolera LUT TH + neuronala stamceller, optimerad vi metoder som ursprungligen användes för att rena neurala celler crest stamceller från foster musen tarmen ^2-6. Tidigare försök att isolera NC-härledda populationer som åberopasdigerering med en cocktail av kollagenas och trypsin för att erhålla cellsuspensioner för flödescytometri. I våra händer dessa metoder som produceras cellsuspensioner från LUT med relativt låg lönsamhet. Med tanke på den redan låga förekomsten av neuronala stamceller i fostrets LUT vävnader, satte vi ut för att optimera dissociation metoder så att cellöverlevnad i finalen dissocierar skulle ökas. Vi bestämde att milda dissociation i Accumax (Innovativa Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, och flödet sortering vid låga tryck får oss att uppnå genomgående större överlevnad (> 70% av totala celler) med efterföljande avkastningen för neuronala stamceller tillräckliga för nedströms analys. Metoden beskriver vi kan i stort sett användas för att isolera en mängd olika neuronala populationer från antingen foster eller en vuxen murina vävnader.

Protocol

1. Beredning av Media (Alla steg sker i vävnadskultur huv)

1. Kombinera följande: 44 ml L-15 medium, 0,5 ml 100 X penicillin / streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml vävnadsodlingskvalitet Vatten. Var noga med att blanda BSA och P / S ordentligt innan du lägger. Denna volym bör vara tillräckligt för dissociation av upp till fem olika vävnader typer. Detta medium kommer att användas i steg 3,4 för att framställa Kyla lösningar för användning efter enzymatisk dissociation av vävnad.
2. Filtermedia fastän 0,22 fim polyetersulfon (PES) filter.
3. Framställ 1X Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och 1X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) från 10x Lagren med användning av vävnad vatten kultur grad. Filtrera genom 0,22 pm filter PES. Stora volymer av dessa reagens kan framställas i förväg och lagras vid 4 ° C, alikvoter mindre volymer i en vävnadskultur huv som behövs.
4. Fylla flera 15 ml koniska rör med 1 x HBSS, (antal rör lika antal vävnader du tänker på sub-dissekera) hålla rören på is.

2. Dissektion

1. Euthanize tidsinställd gravid mus i enlighet med institutionell djurvård och använda godkände protokoll och överföring livmodern i en 60 eller 100 mm petriskål med iskall 1X PBS.
2. Ta bort embryon från livmodern och euthanize genom halshuggning i iskall 1X PBS. Screen enskilt under fluorescens belysning, delas upp i positiva transgena och vild-typ (WT) icketransgena pooler. Håll embryon i iskallt 1X PBS hela dissektion.
3. Under ett dissektionsmikroskop, sub-dissekera det urogenitala området. Håll embryot på plats i frambenet nivå med fin pincett. Avlägsna inälvor från levern ned till den genitala tuberkel genom insättning pincett vid nivån för membranet sedan kraftigt dra de inre organen nedåt och bort från den dorsala kroppsväggen.
4. Ytterligare sub-dissekera vävnadintresse bort från den omgivande vävnaden (figur 1). Placera varje enskilt sub-dissekerat vävnadstyp till en 15 ml koniskt rör innehållande iskalla 1X HBSS. Pool varje vävnadstyp tillsammans enligt embryo fenotyp (dvs. alla GFP + prover av fostrets tarmen samlas i en enda 15 ml koniskt rör).
5. Parallellt dissekera jämförbara vävnader från vildtyp embryon att använda för ersättning kontroller vid flödescytometri.

3. Dissociation av Subdissected vävnader

1. Pelleten sub-dissekerad vävnad genom centrifugering vid 210 relativ centrifugalkraft (RCF), 4 ° C under 5 minuter. Efter centrifugering, aspirera bort så mycket HBSS som möjligt.
2. Resuspendera vävnaden pelleten i Accumax (Innovativa Cell Technologies, Inc), vara säker på att förändra pipettspetsar mellan varje prov för att undvika korskontaminering av vävnadstyper. Mängden av tillsatt Accumax kan skalas för större eller mindre mängder av vävnad. Typiskt för en-5 Fetal tarm prover, 1 ml av Accumax skulle kunna användas men större vävnad pooler kommer att kräva en större volym för att uppnå separation.
3. Placera rören i 37 ° C vattenbad under 20-45 min beroende på stadium av den vävnad som isoleras (t.ex. 13,5 DPC tarmen 20 min, 15,5 DPC tarmen 35 min). Halvvägs om dissociation tiden manuellt bryta upp vävnaden genom att slå röret mot sidan av vattenbadet (eller någon fast yta) och av "snärta" röret (som man skulle skaka ner en gammaldags kvicksilver termometer). I slutet av dissociation tiden upprepa skaka om förfarande flera gånger för att ytterligare separera provet. För mer ömtåliga prover, minska vigorousness av Shake ner och istället använda pipetten rivning under Steg 3,5 för att uppnå en lämplig nivå av dissociation. Typiska dissociation tider för 14,5 DPC och 15,5 DPC LUT är 35 och 45 min.
4. Medan vävnad inkubering i Accumax, fyll Släckning sålutions, benämnd Quench och Släck 1:5. Quench görs genom att tillsätta 45 | il 5 mg / ml DNas I till 6 ml L-media 15. Släcka 01:05 framställes genom tillsats av 45 | il 5 mg / ml DNas I till 30 ml L-media 15.
5. Vid slutet av dissociation, flytta 15 ml rör på is och omedelbart tillsätt 1 ml Quench till varje rör. Triturera varje prov upp och ner tills vävnaden är nästan fullständigt dissocierad (figur 2). Det kommer fortfarande att finnas små bitar av vävnad som finns i lösningen. Att uppnå en helt homogent prov är varken lätt att uppnå eller önskvärt eftersom det kan resultera i dålig cellviabilitet.
6. Håll prov på is så mycket som möjligt för resten av protokollet. Var noga med att använda en ny pipettspets vid pipettering upp Släck eller Släck 1:5 till att undvika korskontaminering av prover.

4. Filtrering Cell Suspension

1. Använd pincett som har dränkts i 70% etanol, placera en 3 cm kvadrat på 38 m nylonnät-membran (Sefar Amerika) övermunnen på en ny 15 ml koniskt rör. Filtrera celler genom maska ​​genom pipett till mitten av membranet med smala hål tips. Om membranet blir mättad, medan filtrering, ta bort den, torka mynningen av röret med en Kimwipe och använda en ny bit nylonnät för att filtrera resten av cellsuspensionen. När alla celler har filtrerats, använda 1 ml Släck 1:5 till skölja ur röret och filtrera eventuella kvarvarande celler.
2. Vid filtrering är klar, eller när du byter en igensatt membran, använder pincett att rulla upp sidor av maskan och torka membranet över toppen av röret för att avlägsna eventuella hängande droppar av celler.
3. Pelleten cellsuspension genom centrifugering vid 210rcf, 4 ° C under 5 minuter. Aspirera av supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml Quench 1:5.
4. Filtret cellsuspensionen genom nylonnät i 5 ml polystyrenrör. Skölj ur 15 ml rör med 1 ml Släck 1:5 och filter för att fånga upp eventuella kvarvarande celler.

5. Förberedelser Prover för FACS

Om du använder samma vävnad för sortering och för ersättning kontroller, överför ^{1/10: e} till ^{1/20: e} provet volymen till en ny 5 ml polystyrenrör att använda för ersättning kontroller. Dela upp vildtyp vävnadsprov i två portioner. En del kommer att ofärgade vildtyp (WT Endast) medan den andra hälften kommer att ha 7-Aminoactinomycin D (7-AAD en fluorescerande interkalator uteslutas från levande celler används som ett "viabilitet fläck") sattes till den (7-AAD endast ). Dessa individuella kontroller behövs för att möjliggöra ersättning för eventuella spektral överlappning mellan utsläpp av diskreta fluoroforer på flödet sorterare. Till exempel för en enda fluorescerande reporter som EGFP skulle nödvändiga kontroller inkluderar: EGFP endast ofärgade WT celler och ett rör färgas med 7-AAD bara (Figur 3).

Fylla alla 5 ml rör innehållande cellsuspensionen med kylning 1:5 och centrifugera vid 210rcf, 4 ° C under 5 minuter. Aspirera supernatanten, så att ca 200 | il av vätskani röret.

Späd 7-AAD 1:1000 i Quench 1:5. Lägg 7-AAD färgning spädning till 7-AAD enda ersättning kontroll och prover som ska sorteras. Lägg inte 7-AAD till EGFP enda eller WT enbart kontroller ersättning. Volym av 7-AAD som skall tillsättas kan variera beroende på mängden av utgångsmaterial och storlek erhålles av cellpelleten. Gång 7-AAD har lagts till lämpliga rör, prover är klara att sorteras.

Vävnad	Exempel på Pool storlek	Volym 7-AAD som skall sättas till röret *
15,5 DPC tarm	1-5	200 pl
15,5 DPC LUT	1-5	150 pl

Tabell 1. Mängd av 7-AAD till olika vävnadstyper dissocierar * Det slutliga totala beloppet i varje rör kommer att variera med ett belopp som sträcker sig från 50 till 100 ul sedan strävan media är enn ungefärliga processen och utföras för att undvika pelleten. Slutvolymer mäts inte i syfte att minimera hanteringen av celler i lösningen.

Framställ uppsamlingsrör för att fånga celler för RNA-isolering genom att tillsätta 0,75 ml av TRIzol-LS till 1,5 ml mikrocentrifugrör.

Om uppsamling av celler för odling in vitro, i stället för RNA-isolering, sortera celler direkt in i självförnyelse media i 6-brunnars vävnadsodlingsplattor, belagda med fibronektin och fylld med medium såsom tidigare beskrivits. ^2,6,7

6. Flödescytometri

1. På flödescytometer, utvärdera ersättningen kontrollerna det första att se till att säkerhetskopiera spola mellan varje prov för att undvika kontaminering. Använd profiler ersättning proven för att ställa spänningar / grindar för sortering. Observera att om positiva celler i den önskade vävnaden är närvarande i begränsande tal kan en distinkt vävnad användas för att fastställa ersättning inställningar så länge som den fluorescensintensitet och cellstorlekmellan proverna är jämförbara.
2. Ställ ersättning parametrar och grindar för att undvika döda celler som tar upp 7-AAD färg och samla upp celler som uppvisar hög intensitet av GFP-fluorescens jämfört med ofärgade kontroller (Figur 4).
3. Sortera maximalt 25000 celler i varje mikrocentrifugrör. Sortering skall utföras med lägsta möjliga tryck med ett brett hål munstycke och låg flödeshastighet (t.ex. 17psi, 100 m munstycke, 3000 evenemang per sekund) för att bevara neuronal stamceller livskraft. För sorterar för att isolera EGFP + celler vi utför våra isoleringar på en BD Biosciences FACSAriaII med hjälp av en 488 nm 20 mW laser för att excitera EGFP reporter.
4. Om prov innehåller höga cellkoncentrationer, är det lämpligt att späda cellsuspensionen ytterligare med 1:1000 7-AAD bets att uppnå högre capture effektivitet vid sortering.
5. Vortex varje rör av celler fångas i TRIzol-LS omedelbart efter sortering.

7. Representativa resultat

Vävnadsdissociering att producera en cellsuspensioner för flöde sortering är en känslig balans mellan tillräcklig enzymatisk nedbrytning och undvika över-matsmältningen som kan resultera i låg cell livsduglighet. Ett exempel på önskad nivå av vävnadsdissociering visas i figur 2. I lämpligt ned vävnaden innan manuella triturering bitar av sub-dissekerade organ är fortfarande tydligt (figur 2b, 2f). I vävnader som enzymatiskt har behandlats för en alltför lång tidsperiod eller vid en alltför hög koncentration av enzym, saknar den resulterande suspensionen eventuella kvarvarande stora bitar av vävnad (fig 2d, 2H).

Lämpligt dissociation och manuell filtrering producera sortera profiler vid flödescytometri som typiskt uppvisar större än 90% viabla celler och uppvisar höga nivåer av EGFP uttryck (figur 4). Cellpopulationer som erhållits genom denna metod illustrerar godlivskraft och kan fångas för senare odling eller analys av genuttryck med gating för infångning av EGFP + neuronala stamceller.

Figur 1. Fördelning av TH-EGFP + neuronala stamceller i fetal mus LUT. Hela montering urogenitalsystemet på 15,5 DPC visade ventralt i starkt fältbelysning (en) jämfört med fördelningen av EGFP + celler märkta med TH-EGFP transgenexpression identifierats under fluorescens belysning (b). TH-EGFP expression är närvarande i binjurar a) och medialt beläget celiaki ganglier (cg). Lateral (c) syn på 15,5 DPC TH-EGFP sub dissekerade-urinblåsan utställningar fluorescens från transgenexpression i bäckenet ganglier (PG), blåsväggen (bla) och urinröret (u). I dorsal vy (d) EGFP + celler är tydligt i den främre rygg urinröret. Övriga etiketter: njurar (k), testikel (t), urinblåsa (bla) och genitala knöl (GT).

Figur 2. Brightfield bilder av 15 DPC foster LUT (a) och tarm (e) respektive avbildas halva dissociation inkubationstid, i slutet av dissociation inkubering före avbrott (b, f), efter manuell störning (c, g), och i ett prov som har varit alltför dissocierade (d, H).

Figur 3. Skiss visar ersättning kontroller som behövs för att fastställa strikta FACS styrande parametrar.

Figur 4. Representativ bild av profiler flödeshastigheter sortera vid 14,5 DPC (a) och 15,5 DPC (b). Svarta populationen består av enskilda celler baserade på framåt-och sidospridning som är döda och märktes genom7-AAD fluorescens. Gray befolkningen består av singlet celler som bygger på framåt och sidospridning som inte 7-AAD och är därmed lönsamma. Grön grindad populationen indikeras av inramade "GFP +"-området och består av enskilda celler som har uteslutits 7-AAD (livsdugliga) och uppvisar EGFP-fluorescens.

Discussion

Mus reporter som uttrycker fluorescerande reportrar blir allmänt tillgänglig genom flera satsningar på murina genetik samhället ^1,8,9. Som ett resultat av dissociation metod som illustreras här kan tillämpas allmänt för isolering av diskreta neuronala subtyper baserade på neurotransmittor-eller receptor-mönster expressionsvektorer från antingen fetala eller vuxna vävnader. Även om vi har optimerat denna metod, enligt uttryck för en fluorescerande transgen reporter, kan det också tillämpas på prov som uttrycker receptorer på cellens yta märkta med levande cell immuno-märkning metoder ^3-5,10.

I våra händer har vi observerat flera faktorer som påverkat andelen celler som överlevde dissociation förfarandet. Dessa innefattar förflutna tiden från initial dissektion av fostervävnad till isolering av celler genom flödescytometri, skonsam hantering av cellsuspensioner både under filtrering och vid flödessorterare, såväl som det enzym som används i dissociation. Överlevnaden av både enterala och LUT stamfäder nytta av snabba dissektion / dissociation och användning av milda förhållanden under cellsortering (17psi, 100 mikron munstycke, 3000 evenemang per sekund). Vi fann att före isolering på flödet sorterare, den totala populationen av material observeras av instrumentet (alla händelser, inklusive skräp och multipletter) i allmänhet uppvisade ca 80% överlevnad för cell dissocierar genererade från antingen foster tarmen eller LUT. För att utesluta skräp och klumpar av celler (SSC) inledande portarna för Forward Scatter (FSC) och sidospridning infördes på denna totala befolkningen. Då den totala befolkningen ytterligare förfinas till en "dotter" befolkningen genom spänningspuls geometri gating i bredd och höjd mätning av FSC och SSC att utesluta dubletter. Inom denna raffinerade "dotter" befolkningen icke livsdugliga celler som är 7-AAD + exkluderades så att endast levande celler uppvisar den fluorescerande EGFP reporter samlades in. Vi observerade att frekvensen av överlevnad för neuronella progenitorer i denna dotter populationen är relativt låg vid dissociering utfördes i en blandning av trypsin + kollagenas som rutinmässigt används i många fall för detta ändamål (0,5% trypsin, Gibco; 10 mg / ml kollagenas IV, Worthington) ^{2,5 - 7.} För att få högre halter av överlevande neuronala stamceller från LUT vävnad isolat, testade vi alternativa enzym behandlingar för dissociation av vävnad för att härleda cellsuspensioner för flöde sortering (tabell 2). Neuronala stamceller uppvisade förbättrad lönsamheten efter dissociation i dispas (5 mg / ml) en mild dissociation metod som ofta används för isolering av neurala rör eller andra neurala populationer stamceller ^11. Däremot påpekade största livskraft erhölls med Accumax, en patentskyddad blandning av proteas, kollagenolytisk aktivitet och DNas av okända proportioner, (tabell 2). Dissociation i Accumax gav bästa överlevnad för både enterala neuronala progenitorceller och LUT neuronal progenitors med små skillnader i överlevnad mellan de två källorna. Våra resultat tyder på att distinkta neuronala populationer kan vara olika i deras känslighet för dissociationsbetingelser. Därför bör utredare som vill isolera neuronala stamceller eller mogna nervceller bedöma dissociationsbetingelser att identifiera de som producerar den största cellen överlevnad och avkastning för olika vävnad källor. Den metod som vi beskriver tjänar som en startpunkt för sådana förfaranden i det perifera nervsystemet.

Enzym i dissociationslösning	% Överlevnad Enterisk NP	% Överlevnad LUT NP
Tryp + Collag	29,5 + / - 8,2%, n = 11	46,2 + / - 8,6%, n = 4
Dispas	35,1 + / - 9,8%, n = 10	46,3 + / - 6,6%, n = 9
Accumax	66,5 + / - 7,8%, n = 8	58,1 + / - 5,2%, n = 10

Tabell 2. Viabilitet av neuronala progenitorceller (NP) i olika dissociationsbetingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18