胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。
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サマリー
要約
開発神経堤（NC）に由来神経前駆細胞は、腸と下部尿路のような内臓器官に自律神経節を形成する神経管から移行します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのようなメソッドを使用して、離散的集団のその分離は困難であるので、開発時には、成熟した組織の両方でこれらの細胞は、しばしば広く組織全体に分散されています。ただし、これらのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のようなニューロン特異的遺伝子の調節領域で駆動蛍光レポーターの発現によって直接可視化することができる。我々は可能なTHの高収率+腸解離と蛍光活性化セルソーティング（FACS）に基づいて、下の尿生殖路（LUT）を含む、胎児マウスの内臓組織から神経前駆細胞用に最適化する方法を説明します。
TH遺伝子は、カテコールアミンの生産のための律速酵素をコードしている。腸神経前駆細胞は、TH DURを表現し始める胎児の腸1とTHでの移行をることも大人の骨盤神経節ニューロンの2-4のサブセットに存在しています。この系統の最初の外観と、これらのLUTの他の側面のニューロン、およびその分離の分布が記載されていない。 THを発現する神経前駆細胞は、導入遺伝子コンストラクトのTg（TH-EGFP）DJ76Gsat/Mmnc 1を持つマウスにおけるEGFPの発現により容易に可視化することができる。我々は0.5 DPCとプラグ検出の朝を指定して、15.5日後に性交（DPC）で開発LUTにTHの分布+細胞を記録するために胎児のマウスでこの遺伝子の発現をイメージングし、観察された合体における神経前駆細胞のサブセット骨盤神経節急行EGFP。
LUT TH +神経前駆細胞を単離するために、我々は当初、胎児マウスの小腸2月6日から、神経堤幹細胞を精製するために使用された方法を最適化されています。依拠NC-から派生した集団を単離する前に努力フローサイトメトリー用細胞懸濁液を得るためのコラゲナーゼとトリプシンのカクテルで消化。私たちの手にこれらの方法は、比較的低い生存率LUTから細胞懸濁液を生成した。胎児のLUT組織における神経前駆細胞の既に低い発生率を考えると、我々は、最終的な解離の細胞生存率が増加されるような解離方法を最適化するために設定してください。我々は、私たちは下流の分析のために十分な神経前駆細胞のその後の収率で一貫してより大きな生存率（全細胞の> 70％）を達成することができ、低圧力での並べ替え、その穏やかなACCUMAXで解離（革新的なセルテクノロジーズ株式会社）、マニュアルフィルタリング、およびフローを決定した。我々が記述する方法が広く、胎児または成体マウス組織のいずれかからニューロン集団の様々な分離に適用することができます。
プロトコル
1。メディアの準備（組織培養フード内で行ったすべてのステップ）
- 次の手順を組み合わせる：44 mlのL-15培地、0.5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、0.5ミリリットルが100 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.5ミリリットル1M HEPES、5 mlの組織培養グレードの水。追加する前に徹底的にBSAとP / Sを混在させるようにしてください。このボリュームは、最大の解離のための5つの異なる組織の種類に適切でなければなりません。このメディアは、組織の酵素的解離後に使用するために焼入れ溶液を調製するには、手順3.4で使用されます。
- フィルターメディア0.22μmのポリエーテルスルホン（PES）フィルタけど。
- 組織培養グレードの水を使用して、10倍株から緩衝生理食塩水（PBS）1Xハンクス平衡塩溶液（HBSS）と1Xリン酸塩を準備します。 0.22μmのPESフィルターを通してろ過する。これらの試薬の大ボリュームは前もって準備し、4℃で保存し、必要に応じて組織培養フードの小さいボリュームを分注することができます。
- 1X HBSS、（使用して複数の15 mlコニカルチューブを埋める氷の上で、サブ解剖を計画し、組織の数）を保持するチューブを等しくなるように管の数。
2。解剖
- 制度の動物のケアに応じてタイミング妊娠中のマウスを安....
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ディスカッション
蛍光レポーターを発現するマウスレポーター線は、マウス遺伝学コミュニティ1,8,9の複数の努力を通じて、広く利用可能になっています。結果として、ここで示した解離法が広く、胎児または成体組織のいずれかから神経伝達物質や受容体の発現パターンに基づいて、離散的なニューロンのサブタイプの分離に適用することができます。我々は、蛍光遺伝子レポーターの発現に基づいてこの方法を最適化しているが、それはまた、生細胞の免疫標識法3-5,10で標識された細胞表面の受容体を発現する試料に適用することができます。
私たちの手では、解離の手順を生き残った細胞の割合に影響を与えるいくつかの要因を観察した。これらは、フローサイトメトリー、フィルタリング中およびフローソーターの両方で細胞懸濁液の穏やかなハンドリングと同様に、dissocで使用されている酵素の種類によって胎児組織の最初の解剖からの細胞の分離に経過時間が含まれていiation。迅速な解剖/解離と細胞選別時に穏やかな条件の使用（17psi、100ミクロンのノズル、3000イベント/秒）の恩恵を受けて腸とLUT前駆.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
著者らは、イラストで芸術支援のためヴァンダービルト大学医療センターとメリッサA. Musserでフローサイトメトリーの共有リソースでサポートするために細胞解離の方法とケビン·ウェラー、デビッド·フラハティとブルターニュマトロックの提案のためにキャサリン·アルフォードに感謝します。我々は、博士に感謝します。神経前駆細胞の分離を実装する上でのアドバイスジャックモッシャーとショーンモリソン。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースは、ヴァンダービルト·イングラムがんセンター（P30 CA68485）とヴァンダービルト消化器病研究センター（P30 DK058404）によってサポートされています。この作品は、健康補助DK064251、DK086594、とDK070219の米国国立研究所からの資金によって支えられている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬名 | ベンダー | カタログ番号 | コメント |
| アキュマックス | シグマ（MFR：革新的なセルテクノロジーズ） | A7089-100ML | 1mlのアリコートで凍結保管してください |
| DNアーゼI | シグマ | D-4527 | 保存されている-20℃で凍結1xHBSSのC 5 mg / mlと、 （1:5をクエンチ、クエンチで使用） |
| 10×PBSのpHを7.4 | ギブコ | 70011-044 | その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ |
| 10X HBSS W / OのCaやMg | ギブコ | 14185-052 | その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ |
| リーボビッツのL-15培地 | ギブコ | 21083027 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン100X | ギブコ | 15140-133 | -20℃でアリコートを格納 |
| BSA | シグマ | A3912-100G | -20°C、水中では100 mg / mlになるように分注し、保管する |
| 0.85％NaClでのBiowhittaker 1MのHEPES | ロンザ | 17-737E | |
| 38μmのNITEXナイロンメッシュメンブレン | Sefarアメリカ | 3-38/22 | 〜3センチの正方形にカット。 UVは、組織培養フード内で殺菌するために一晩処理します。 |
| 7-AAD | インビトロジェン | A1310 | 1 mg / mlの |
| TRIZOL LS | インビトロジェン | 10296-028 | |
| 5 mlのポリスチレンチューブ | ファルコン | 352058 | |
| 15 mlコニカルチューブ | コーニング | 430790 | |
| 細かい解剖鉗子 | ファイン科学·インスツルメンツ | 11251から30 | デュモン＃5 Forcep、Dumoxel、標準的なチップ0.1x0.06mm |
| 解剖スプーン | ファイン科学·インスツルメンツ | 10370から18 |
参考文献
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospectiv....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.
The authors middle initials were omitted from the publication of An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice.
