Summary
למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.
Abstract
כחברה מתקדמת ומשאבים להיות נדיר, הוא הופך חשוב יותר ויותר לטפח טכנולוגיות חדשות הקרובות מהנדס הדור biomaterials עם תכונות ביצועים גבוהים. פיתוח של חומרים אלה מבניים חדשים חייבת להיות מהירה, יעילה וחסכונית, הכרוכה שיטות עיבוד מוצרים ידידותיים לסביבה בת קיימא. עכבישים לטוות רב של סוגי סיבים שונים עם תכונות מכניות שונות, מציע מקור עשיר של הנדסת חומרים הדור הבא של ביומימטיקה כי יריבות חומרים מעשה ידי אדם וטבעי ביותר. מאז אוסף של כמויות גדולות של משי עכביש טבעי אינו מעשי, ייצור משי סינתטי יש את היכולת לספק למדענים גישה אספקה בלתי מוגבלת של נושאים. לכן, אם תהליך ספינינג יכול להיות יעיל שלמות, סיבי עכביש מלאכותיים יש שימוש פוטנציאלי במגוון רחב של יישומים החל שריון הגוף, תפר כירורגיים, חבלים וכבלים, צמיגים, מחרוזות עבור כלי נגינה, וחומרים מרוכבים עבור טכנולוגיות תעופה וחלל. על מנת לקדם את תהליך ייצור משי סינתטי להניב סיבים המציגים שונות נמוכה תכונות החומר שלהם לטוות ספין, פיתחנו פרוטוקול רטוב ספינינג המשלבת ביטוי חלבונים רקומביננטיים עכביש המשי של טיהור, חיידקים וריכוז החלבונים , ואחריו שחול סיבים טיפול מכני שלאחר ספין. זהו ייצוג חזותי 1 החושף תהליך צעד אחר צעד להסתובב ולנתח סיבי משי מלאכותי בקנה מידה מעבדתי. הוא גם מספק פרטים כדי למזער הכנסת השונות בין סיבים שנטוו בין סמים ספינינג אותו. באופן קולקטיבי, שיטות אלה יניע את התהליך של ייצור המשי המלאכותי, המוביל סיבים באיכות גבוהה יותר כי יעלה משי עכביש טבעי.
Introduction
קורי עכביש בעל תכונות מכאניות יוצאות דופן, כי את מבצעת חומרים מעשה ידי אדם, ובהם פלדה גבוהה מתיחה, Kevlar ניילון. 1 עכבישים לטוות לפחות 6-7 סוגי סיבים שונים המציגים תכונות מכניות שונות, כל אחת מעוצבת עם כמויות משתנות של עוצמה הרחבה מתיחה כדי לבצע משימות ביולוגיים ספציפיים. 2 מדענים מחקר הם במהירות רודף את השימוש של משי עכביש כמו biomaterials הדור הבא בגלל תכונות מכאניות יוצאות דופן שלהם, biocompatibility שלהם, והטבע רעיל ירוק החומר שלהם. 3,4 בגלל קניבלית ו הטבע ארסית של Arachnids, קציר משי עכביש באמצעות חקלאות היא לא אסטרטגיה מעשית על מנת לעמוד בדרישות הנחוצות לייצור בקנה מידה תעשייתי. לכן, מדענים פנו לייצור חלבונים רקומביננטיים משי של האורגניזם המהונדס יחד עם במבחנה ספינינג של סיבים סינתטיים מse חלבונים מטוהרים. 5-8 Expression של באורך מלא חלבונים משי רקומביננטי עכביש כבר קשה מבחינה טכנית נתון את המאפיינים הפנימיות של רצפי גנים שלהם, אשר כוללים הטבע חוזר על עצמו ביותר שלהם ואת אורכי פיזיים (> 15 kb), GC-עשיר תוכן ו מוטה אלאנין ו גליצין השימוש קודון. 9-11 כדי תאריך, רוב Labs התמקדו להביע את צורות חתוכים של משי את החלבונים העיקריים ampullate MaSp1 או MaSp2 תוך שימוש רצפים cDNA חלקיים או גנים סינתטיים. 12-15 טוויה סינתטי עכביש בדי משי הוא תהליך מאתגר כי דורש מאסטריות ואת הידע ב דיסציפלינות מדעיות כמה, ו המורכבויות של תהליך ספינינג שלא היה חשף באופן מלא לציבור הרחב על ידי ייצוג וידאו. למעשה, רק קומץ של Labs על פני הגלובוס יש את המומחיות להביע את את cDNAs משי עכביש, לטהר את את החלבונים משי, ספין סיבים סינתטיים ולבצע המשתמש הודעה-ספין תיקו ולאחר מכן סוף סוף לבדוק על מאפיינים ביולוגי שלהם. 8,16,17 גישות שונות של סיבים סינתטיים ספינינג לא הקיפה ספינינג רטובה ויבשה כמו גם שיטות electrospinning 16,18,19 הליכי כל יש מטרה אחת משותפת -. פיתוח פרוטוקול שמייצר קורי עכביש סינתטי בעל תכונות מכאניות כי הנושאים טבעיים יריבות עבור בקנה מידה גדול תהליכי ייצור מסחריות.
כאן אנו מתארים את ההליך להפקת משי עכביש מלאכותיים בקנה מידה במעבדה באמצעות מתודולוגיה רטוב ספינינג. לעומת שיטות אחרות ספינינג, ספינינג רטובים הפיק את התוצאות העקביים ביותר לניתוח סיבים. אנחנו מתווה זה תחילת ההליך עם ביטוי של חלבונים משי רקומביננטי בחיידקים, ואחריו טיהור שלהם, ולאחר מכן לתאר את שלבי הכנת חלבון ספינינג, כולל מתודולוגיה שלאחר ספין תיקו ליישם סיבי "כפי הסתחרר" כי התשואות האשכולות עם חומר מאפיינים להתקרב איכות משי עכביש טבעי. שלנו methodology נועד מקרוב לחקות את התהליך הטבעי של ספינינג סיבי משי היא שואבת במידה רבה על המומחיות שלנו הארכיטקטורה והתפקוד של משי לייצור בלוטות מ-Orb ו-קלח אריגה עכבישים. 20-22 יתר על כן, אנו מגיעים למסקנה עם צורך השלבים הבאים כדי לקבוע את תכונות החומר של סיבים סינתטיים באמצעות tensometer להתוות ללחץ ומתח עקומות, המאפשרים לחוקרים לחשב את הכוח האולטימטיבי, זן האולטימטיבי, וקשיחות של סיבים. לבסוף, אך בעל ערך משמעותי, מנגנוני ספינינג, עקיפה, ציור יכול להיות בית נבנה באמצעות חלקים זמינים מסחרית, יותר מאשר רכישת ציוד מותאם אישית משוכלל ויקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מבט גרפי: ביומימטיקה תהליך ספינינג
ביומימטיקה של מסלול הייצור הטבעי קורי עכביש. בדרך לייצור משי סינתטי תמונה זו מראה בלוטת ampullate מ עגול זהב ויבר, Nephila clavipes, וכן את הרכיבים ששימשו לייצור משי טבעי (טקסט לבן). באזור הזנב מסנתז כמויות גדולות של חלבונים משי מועברים ampulla, אזור אחסון סמים ספינינג. זה סמים מרוכזת הנמתח דרך צינור מסתובב שם פתרון חווה חילופי יונים והתייבשות לפני שיחול סיבים. תהליכי biomimetic המשמשים במעבדה שלנו מסומנים על ידי טקסט אדום. ייצור רקומביננטי המשי מופק באמצעות חיידקים מהונדס, ואחריו טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה. לאחר מכן, חלבונים מטוהרים הוא קטןמקרינים את lyophilization לרכז את החומר. לבסוף, חלבון מחדש מומס HFIP ו extruded מ מחט מזרק לתוך אמבטיה isopropanol.
1. בנייה פלסמיד והכנה בקטריאלי תרבית תאים
- ביצוע PCR באמצעות משי את הרצוי עכביש קבוצות cDNA וספציפי פריימר. ג'ל לחלץ ולקשור cDNA הגברה לתוך ThioFusion פרוקריוטים וקטור ביטוי pBAD / Topo למשל (איור 1 א). וקטור זה יש תג N-מסוף thioredoxin כדי להקל על חלבון משי solubilization ו C-מסוף 6x התג שלו לטיהור חלבונים. להפוך את המוצרים קשירת לתוך ה המוסמכת קולי תאים.
- בחר המושבות המכילות וקטור שיבוט רקומביננטי ולהשתמש 1 המושבה לחסן 200 מ"ל של LB סטרילי השלימו עם ampicillin (איור 1 ב). זה לגדול בתרבות לילה הרוויה ידי ניעור בסל"ד 200 באינקובטור ההקפה ב 37 ° C.
- מערבבים 200 מ"ל של saturatעורך התרבות עם 800 מ"ל של LB תרבות חדשה. לגרום חלבון עכביש המשי ביטוי במשך 4 שעות על ידי הוספת arabinose 0.2% (w / v). הקפד לשמור על התרבות תחת הבחירה אנטיביוטי.
- גלולה התאים ב XG 16,000 במשך 10 דקות 4 ° C (איור 1 ג). לשם הפשטות, גלולה נפח כולו בתוך מכולה אחת. צעדים צנטריפוגה מרובים ייתכן שיהיה צורך בהתאם קיבולת נפח של צינורות צנטריפוגה. במידת הצורך, נפח לערות נוזלים אחרי ספינינג מחדש גלולה חומר נוסף כדי להבטיח את כל התא היא כדורית בתוך מכולה אחת. כדורי תא ניתן לאחסן ב -80 ° C עד הצורך.
- לפני סילוק בתקשורת תרבות בילו, להוסיף אקונומיקה או החיטוי לעקר.
2. תא תמוגה
- הוסף 20 מ"ל של חיץ 1x תמוגה ל 1 ל תא גלולה (איור 2 א). הקפד resuspend תא גלולה לחלוטין.
- הוסף ליזוזים ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל לקדם עוד יותר אתתא תמוגה. DNase ניתן גם להוסיף בשלב זה לעכל דנ"א כרומוזומלי כדי לעזור להפחית את הצמיגות של הפתרון. מניחים את המדגם על שייקר מסלולית בעדינות רוק עבור 20 דקות.
- Sonicate פתרון מקסימלי דקה 1.
- כדי להבהיר את הפתרון, צנטריפוגות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C (איור 2 ב).
3. טיהור חלבון: Ni-נ.ת. ע זיקה טור כרומטוגרפיה
- הסר את supernatant ולהעביר אותו טור נקי מ"ל 25 כרומטוגרפיה. ודא supernatant הוא לא צמיג וברור. אם הפתרון הוא צמיג ומעונן, להוסיף DNase או יותר sonicate ו / או מחדש גלולה supernatant (שלבים 2.3-2.4).
- הוסף 1 מ"ל של Ni-נ.ת. ע slurry (0.5 חרוזים מ"ל) לתוך הטור. לאבטח היטב את המכסה שסתום, ולאחר מכן להגדיר על נדנדה כדי לאזן במשך שעה 1 כדי לאפשר המחייב של 6x התג שלו כדי החרוזים Ni-נ.ת. ע (איור 3 א).
- הגדר את העמודה זקוף עללעמוד ולאפשר Ni-נ.ת. ע חרוזים להסתפק כ 2 דקות. שכבת כחול בהיר ניתן לראות בתחתית כאשר החרוזים הם התיישבו לחלוטין.
- להסיר את הכובע ולאפשר פתרון לזרום דרך שסתום. לאסוף את הפתרון לניתוח נוסף (איור 3 ב).
- הוסף 20 מ"ל של חיץ 1x הכביסה ולאפשר החרוזים להתיישב. פתח את שסתום ולאפשר פתרון לזרום. לאסוף את הפתרון הזה בארבעה 5 aliquots מ"ל לצורך ניתוח נוסף הערה: כרכים לשטוף נוספים שניתן להשתמש בהם כדי להפחית חלבונים מזהמים, אך קיימת אפשרות של ירידה בתשואה החלבון הסופי..
- הוסף 20 מ"ל של חיץ 1x elution ולאפשר שרף להתיישב. פתח את שסתום ולאפשר פתרון לזרום. לאסוף את הפתרון הזה בארבעה 5 aliquots מ"ל לצורך ניתוח נוסף. הערה: כרכים elution נוספים ניתן לאסוף מן שרף Ni-נ.ת. ע אם elution לא הושלם.
- דוגמאות ניתן לאחסן 4מעלות צלזיוס או -80 ° C עבור אחסון לטווח קצר או ארוך, בהתאמה.
- גודל fractionate דגימות באמצעות SDS-PAGE ניתוח. דמיינו את החלבונים עם כסף או Coomassie בריליאנט בלו R-250 (איור 3 ג). רק שברים טהורים יש להשתמש בשלבים הבאים. הערה: ניתוח כתם המערבי ניתן להשתמש כדי לוודא את זהותו של חלבונים מטוהרים.
4. דיאליזה Lyophilization
- Dialyze דגימות נגד בנפח לפחות 100x המדגם (שימוש במים deionized) עבור 2 ימים. לשנות את הפתרון המים כל 6 שעות להוציא את כל מלחים. הערה: גודל, משקל מולקולרי ניתוק של צינורות דיאליזה תלוי בגודל של חלבון רקומביננטי משי.
- שישה צינורות שוקל 1.5 מ"ל microfuge ריקים ולהקליט ההמונים שלהם. זה עשוי להיות שימושי חורים או חריצים קטנים על כמוסות של הצינורות לפני שקילה להקפאה ייבוש להקל lyophilization (איור 4 א).
- AFter דיאליזה, 1 מ"ל העברת דגימת dialyzed לתוך כל אחד 6 מראש שקל microfuge צינורות (איור 4B). פלאש להקפיא באמצעות חנקן נוזלי ולייבש את הדוגמאות למטה באמצעות מייבש הקפאה (איור 4C).
- יבש פעם, להעביר עוד 1 מ"ל של המדגם דיאליזה לתוך כל אחד מששת צינורות. חזור על הפעולה עד דיאליזה המדגם כולו כבר התייבש למטה צינורות microfuge.
- דגימות להקפיא יבשים ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחסון ארוך טווח.
5. ספינינג הכנת סמים
- לשקול כל אחד מן הצינורות microfuge המכילים אבקת חלבון מיובש. להפחית את המסה הראשונה של צינורות ריקים כדי לקבל חלבון הכולל מסה יבשה. הערה: בהתאם התשואה חלבון, ייתכן שיהיה צורך לטהר חומר נוסף לתהליך ספינינג.
- לחשב את נפח Hexafluoroisopropanol (HFIP) להוסיף צינור אחד לקבל 200 מ"ג / מ"ל ל 500 מ"ג / מ"ל, או 20% עד 50% במשקל לפי נפח. הוסף המתאימהאכלו כמות HFIP לתוך צינור אחד (איור 4D) הערה:. HFIP הוא תנודתי מאוד רעיל, פיפטה בזהירות מכסה את הצינור בהקדם האפשרי. HFIP יש לטפל מתחת למכסה המנוע בטיחות.
- Parafilm צינורות ומניחים על נדנדה כדי solubilize חלבון. מערבולת ו צנטריפוגות מדי פעם כדי להקל solubilization. פעולה זו עשויה להימשך עד 2 ימים.
6. מזרק הכנת ומכשירים ההתקנה
- טען לפחות 25 μL של סמים ספינינג solubilized לתוך המזרק. ודא שיש אגרגטים אין להציג מכיוון שהוא עלול להדביק את המזרק. הערה: מדגם זה צמיגה מאוד, ולכן דואגים כאשר pipetting.
- דחוף את סמים לקדמת המזרק במאונך, הסרת כל בועות האוויר (איור 5 א). הערה: בועות האוויר ליצור חוסר עקביות סיבים.
- נעל את המזרק למשאבה. תרים כוס 400 מ"ל מלא את isopropanol 95% כך את קצה המזרקרק לשבור את פני השטח של אלכוהול (5 ב איור).
- הגדר את משאבת מזרק עד 15 μL / דקה ולהתחיל את התוכנית. אפשר סיבים כפי סובב לשבת isopropanol במשך 20 דקות כדי לאזן באופן מלא. הערה: סיבים אלה עדיין יכול להיות בשימוש על ידי ניתוח MS / MS כדי לאשר את זהותו של החלבונים בתוך הסיבים.
7. לאחר ספין לצייר אוסף דוגמאות
- החל דו צדדית סרט על שני הצדדים של מסרק במכשיר עקיפה. מכשיר עקיפה נוצר הדבקה מתכת מסרקים את קליפר דיגיטלי (איור 6 א). חבר את המכשיר כדי שנחזור המנוע (איור 6 ב). אנו ממליצים וגוללה את האשכולות על 2 סל"ד. הערה: מהר יותר מכך שיעורי עקיפה בכמויות גדולות של שונות באיכות שחזור סיבים.
- באמצעות מלקחיים בעדינות לתפוס קצה אחד של סיבים ולאט לאט למשוך אותו החוצה של isopropanol, מצרף אותה לקצה של אחת הזרועות מסרק על סליל (איור. 6C). הצעדים הבאים שצריך לעשות בלי הפסקה כדי למנוע את הסיבים מהתייבשות.
- הפעל את המנוע בעדינות להנחות את הסיבים על הערה עקיפה המכשיר:. במהלך עקיפה, אל תאפשר סיבים להכפיל מעלה לערום אחד על השני.
- לאחר סיבים כולו נגללים, לנתק את סליל ממנוע וליישם דבק לקצה סיבי משי על כל סרט דו צדדי (איור בקר 6d). זה מהדק קורי עכביש על המכשיר. הערה: על ידי יישום דבק לקלטת דו צדדית לפני ציור פוסט ספין, הוא מונע סיבים כולו מן החלקה מאפשר סלקטיבית מתיחה הקטעים הפנימיים של הסיבים בתוך קליפר נשק.
- חבר את סליל על מנוע ליניארי (איור 7 א). רשום את אורך הראשונית של סיבי באמצעות קליפר שים לב שזה אורך פנימי של סיבים;. זה אינו כולל את אורך מודבק ועטף around סליל.
- מנמיכים את סליל לאמבטיה isopropanol 75%. אפשר הסיבים כדי לאזן במשך 10 דקות הערה: מייבש פתרונות אחרים ניתן להשתמש בתהליך ספינינג, כגון סולפט, מתנול אצטון אמוניום.
- קבע את המהירות מפעיל ליניארי ל 1.5 מ"מ / שניה. על בסיס אורך הראשוני, לחשב את האורך הסופי של יחס שלאחר ספין הרצוי תיקו. כמות נמתח ניתן לשלוט על מהירות או אורך, תלוי הגדרה. כך, למשל, עם אורך ראשונית של 15 מ"מ ו הרצויה לאחר ספין יחס תיקו של 3x, אורך הסופי צריך להיות 45 מ"מ. זה גם יכול להיות מחושב באופן להפעלת מפעיל ליניארי למשך 20 שניות בקצב של 1.5 מ"מ / שניה.
- לאחר הסיבוב הרצוי תיקו הודעה הושלמה, לאט להעלות את סליל מתוך isopropanol. אפשר טיפות של isopropanol להתייבש במשך דקה 1, ולאחר מכן לאסוף דגימות (איור 7 ב). דוגמאות צריך להיות מותקן על מסגרות כרטיסים או נייר לבדיקת פורתנוחות.
- אם עוד ספין הודעה יחסי לצייר הם רוצים, להוריד בחזרה סליל לאמבטיה isopropanol 75%. אפשר הסיבים כדי לאזן במשך 10 דקות ולאחר מכן להמשיך את היחס ההודעה הבאה ספין תיקו.
8. מתיחה בדיקה
- אפשר דגימות שנאספו כדי לאזן לסביבה מעבדה סטנדרטי במשך שעה לפחות לפני הבדיקה 1 מכני. לחות וטמפרטורה יש לציין כי הן עלולות להשפיע על תכונות מכניות של סיבים. לחות רגיל בתנאי טמפרטורה צריך להיות כ 40% ו - 25 ° C, בהתאמה.
- דבק את הקצוות של קרטון או נייר כסף כדי להבטיח את הסיבים על המסגרת. שימו לב לגודל הפתיחה של המסגרת. זהו אורך הראשונית של סיבים נבדק שלך. במסגרת הפתיחה 1 אינץ' (25.4 מ"מ) מוצג כאן (איור 8 א).
- באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה 100x ומעלה, לקחת מידות קוטר לאורך ציר האורך סיבים.לפחות 3 מדידות יש לרשום. ככל הגדלה בשימוש, לקחת את המידות יותר, טוב יותר את הדיוק.
- להבטיח את מסגרת מסגרת tensometer מכני טוען (איור 8 ב). חותכים את מסגרת משני הצדדים אז המתח הוא רק פועל באמצעות סיבים. טרה tensometer לאסוף את הנתונים. שיעור המתח הסטנדרטי של 2% לשנייה מומלץ.
- תוך שימוש בנתונים שנאספו הקוטר הממוצע, עקומת המתח מתח ניתן להתוות.
- סיבים שבור יכול להיות מותקן על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) בדל עבור ניתוחים מורפולוגיים נקודת מעבר מדידות קוטר. קטע סיבים הרחק מנקודת הפריצה ניתן להשתמש כדי להעריך ולבדוק את קוטר הראשונית נמדד על ידי מיקרוסקופ אור.
9. נציג תוצאות
משלב 3, שברים השונות יש לנתח ניתוח SDS-PAGE וחלבונים דמיינו את עם כסףאו Coomassie בריליאנט בלו R-250. מכמה Ni-נ.ת. ע תנאים סטנדרטיים עמודות, שברים elution עם טוהר> 90% ניתן להשיג (איור 9). חלבונים מזהמים קטנים ניתן להסיר עוד יותר על ידי דיאליזה נרחב. באמצעות 25 μL של סמים ספינינג ב -20% (W / V), לפחות 30 דגימות סיבים נפרדים ניתן לאסוף מן סיבים פצע מתמשך על סליל (מבוסס על ההנחה הראשונית של אורך 13 מ"מ משמש). המאפיינים המכניים ניתן לנתח על ידי בדיקות tensometer (איור 10). בהתאם חלבון רקומביננטי משי המשמש בתהליך ספינינג, לסובב את מקסימום יחסי הודעה לצייר יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי. באופן כללי, לפרסם ספין לצייר את יחסי 4.0x ניתן להשיג ללא כשל סיבים (איור 10). סיבים הסתובב, לפני או אחרי תיקו ספין הודעה, ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לדמיין ultrastructure (איור 11 א ', ב'). סיבים שנטוו יכול לשמש גם לבדיקה מכנית, הצגת תוצאותכי עם וריאציה נמוך בתוך ספין הודעה הקבוצה תיקו יחס המדגם (איור 10).
באיור 1. הביטוי של משי עכביש cDNA בחיידקים. א) וקטור Topo / Thio pBAD המכיל קורי עכביש cDNA העניין הופך א המוסמכת קולי תאים. ב) מושבת יחיד מחוסן לתוך 200 מ"ל של LB ו הרוויה גדל בן לילה. בעקבות חיסון, 800 מ"ל של LB טרי נוסף ותרבות מושרה לביטוי באמצעות arabinose. ג) עם סיום הגיוס, תרבות היא pelleted על ידי צנטריפוגה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 2. תמוגה של תאים חיידקיים לאחר אינדוקציה חלבון עכביש המשי. א) עשרים milliliהמאוחדות של 1x תמוגה חיץ DNase מתווסף תא גלולה והניח על שייקר מסלולית ו sonicated כדי lyse התאים. ב) lysate התא הסתובב בצנטריפוגה כדי לנקות את supernatant של פסולת הסלולר, supernatant נאסף. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 3. טיהור חלבונים עכביש המשי רקומביננטי באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. א) תא lysate supernatant ו Ni-נ.ת. ע חרוזים מוסיפים עמודת כרומטוגרפיה ו מודגרות שעה 1. ב) לאחר flowthrough נאסף, 20 מ"ל של חיץ כביסה 20 מ"ל של חיץ elution משמשים רצף נאספו שברים 5 מ"ל. ג) שברים השונים מנותחים על ידי SDS-PAGE, דגימות טהורות המכילים חלבון המטרה מועברים שקית דיאליזה dialyzed נגד מים די כדיהשלמת. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 4. הכנת חלבון קורי עכביש מטוהרים על רטוב ספינינג. א) המוצר dialyzed מועבר צינורות צנטריפוגות מראש שקל aliquots 1 מ"ל. ב) .1 aliquots מ"ל הם פלאש קפוא עם חנקן נוזלי. ג) הדגימות קפואים הם lyophilized ו מדגם דיאליזה יותר הוא הוסיף. ד) מסת יבשים מחושב HFIP מתווסף אבקה יבשה לייצר סמים ספינינג 20% (w / v). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 5. טעינת של סמים ספינינג לתוך המזרק זכוכית רטוב ספינינג. א) תוך כדי לחיצה syrinGE אנכית, סמים ספינינג נדחף לראש הטור את המזרק, הסרת בועות אוויר. ב) מזרק טעון מחובר משאבת מזרק והוריד לאמבטיה isopropanol 95% כך עצה רק לשבור את פני השטח של האמבטיה.
איור 6. עקיפה של משי של סיבים סינתטיים עכביש למכשיר מסוחרר מותאם אישית. א) המכשיר עקיפה בנוי מ קליפר דיגיטלית עם המצורף מתכת מסרקים. סרט דו צדדי מוחל על שני הצדדים של מסרק לצרף את הקצוות סיבים. ב) סליל מחובר המנוע במהירות נמוכה באמצעות קליפ תנין. ג) סיבים נמשך לאט אמבטיה אלכוהול כרוך סביב סליל. ד) דבק מוחל על קצה של כל פלח סיבים להחזיק אותם במקום. המוצגים הם שני סיבים שונים שנטוו בין חלבונים שונים.
איור 7. לאחר ספין לצייר של סיבים סינתטיים באמצעות מנגנון תוצרת בית. א) המכשיר עקיפה מחובר ההתקנה מפעיל ליניארי באמצעות קליפים תנין. ב) לאחר שלב ספין הודעה תיקו, סליל יוסר מן הרחצה. טיפות Isopropanol מותר להתאדות לפני אוסף סיבים.
איור 8. הרכבה של סיבי משי סינתטי על גבי כרטיסים ללימודי מכניים. א) סיבי הנאספים רכוב על מסגרות כרטיסים עם נתק 1 "x 1". הסיבים מוחזקים בתחילה במקום עם סרט דו צדדי, ואז נעץ עם דבק. ב) מסגרת קרטון קבוע על tensometer. הצדדים נחתכים אז כך המתח הוא רק פועל על פי הסיב.
איור 9. גודל חלוקה של מטוהרים רקומביננטי protei MaSp1n שברים באמצעות SDS-PAGE ניתוח ואחריו להדמיה עם כתמים כסף. סולם חלבון מתואר kDa. שתי דוגמאות לשטוף להראות שאינם ספציפיים קשירה של חרוזים, ואילו דגימות elution לחשוף את הצורך 6 אוספים על מנת להבטיח התאוששות החלבון הכולל.
איור 10. מתח מתח עקומות של סיבים סובב מ TuSp1 חלבונים רקומביננטיים. 8 צבעים להראות סיבים שהיו כפופים שונים ספין הודעה יחסי לצייר, החל 2.5x עד 6x. סיבים מראים וריאציה נמוך בקבוצת היחס שלהם, כמו ספין גידול הודעה תיקו יחס, כוח של סיבים מוגברת תוך הרחבה הוא ירד.
איור 11. סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של סיבים הסתחרר מן TuSp1 חלבונים רקומביננטיים. א) הגדלה 500X, חלקה החיצוניפני השטח ניתן לראות. ב) 5000X, ליבה צפופה הפנים ניתן להבחין בין הפסקה טבעית של סיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיבים סינתטיים הסתחרר מן המתודולוגיה זה הם מכנית על אותו סדר גודל לעומת סיבים טבעיים. על ידי הפחתת כמות טעויות אנוש על ידי mechanizing עקיפה ומסובב הודעה תהליכים לצייר, וריאציה ניסיוני בין דגימות נשלטים יותר פחותה בהרבה.
המתודולוגיה שלנו מציעה את הפוטנציאל לחקור את תכונות מכניות של סיבים אחרים כי הם הסתחררו מן החלבונים המקודדים רקומביננטי מן cDNAs של בני משפחה אחרים הגן עכביש. פוטנציאלית, זה יכול לקבוע את התפקיד המכאני של מודולים חלבונים שונים בתוך fibroin, או בין סוגים שונים fibroin. 23 זה גם מאפשר בדיקה של סיבי משי כמו מרוכבים, כמו יותר חלבון משי או מולקולות אחרות ניתן לשלב או להוסיף וסובב כמו תערובת חלבונים.
זו מתודולוגיה ספינינג הוא פלטפורמה מעבדות אחרות כדי להרחיב בקלות על, כמו אבאratuses ניתן לבנות באופן קליל. זה גם מאפשר התאמת הפרמטרים לאורך כל שלב כדי לייעל או להתאים אישית את העיצוב של סיבים ספציפיים עם תכונות מכניות ייחודיות. כפי הצורך biomaterials ירוקים עליות עתידיות, מתודולוגיה זו ניתן להתאים לייצר סיבים המשמשים ומגוון רחב של יישומי הדור הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NSF רוי מענקים MCB-0950372 ו DMR-1105310 תחת הכותרת "אפיון מולקולרית של שחור עכביש משי אלמנות התנהגות מכנית של משי עכביש דבק", בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
