फ्लो आधारित शोधन Published: September 21, 2012 doi: 10.3791/4197

DOI

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Serendipity Zapanta Rinonos^1,2, Jeremy Saks¹, Jonida Toska³, Chun-Lun Ni^1,2, Alan M. Tartakoff^1,2

¹Department of Pathology, Case Western Reserve University School of Medicine, ²Cell Biology Program, Case Western Reserve University School of Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

की युग्मनज को शुद्ध

Abstract

Zygotes कई जीवों के जीवन चक्र के अगुणित और द्विगुणित राज्यों में के बीच आवश्यक मध्यवर्ती, खमीर सहित (1 चित्रा) ¹ एस. cerevisiae अलग संभोग प्रकार (माता, MATalpha) की अगुणित कोशिकाओं के संलयन से परिणाम zygotes और इसी स्थिर diploids कि क्रमिक रूप में कई के रूप में 20 उनके strikingly असममित mitotic ² डिवीजनों का एक परिणाम के रूप में द्विगुणित संतान उत्पन्न करने के लिए जन्म दे. युग्मनज गठन की घटनाओं का एक जटिल अनुक्रम द्वारा करवाया जाता है: इस प्रक्रिया में, घुलनशील संभोग कारकों रिसेप्टर्स मातृपक्षी बाँध, रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेत हैं कि cascades सेल सेल संलयन में सेल चक्र और culminate की रुकावट की सुविधा को ट्रिगर. Zygotes पूर्वज या स्टेम सेल समारोह के लिए एक मॉडल माना जा सकता है.

हालांकि ज्यादा युग्मनज के गठन के बारे में सीखा है और हालांकि zygotes सामान्य signif सेल आणविक सवाल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैicance, लगभग सभी अध्ययन जिसमें zygotes अगुणित कोशिकाओं ^3-8 के बहुमत जनसंख्या के साथ intermixed संभोग मिश्रण के इस्तेमाल किया है. युग्मनज गठन के जैव रसायन और युग्मनज का सतत जीवन के कई पहलुओं इसलिए uninvestigated रहते हैं.

खमीर युग्मनज की शुद्धि की रिपोर्ट उनके अवसादन ⁹ गुणों पर आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन है, तथापि, यह अवसादन आधारित प्रक्रिया हमारे हाथ में लगभग 90% शुद्धता उपज नहीं था. इसके अलावा, यह नुकसान है कि कोशिकाओं hypertonic sorbitol को उजागर कर रहे है. इसलिए हम एक बहुमुखी शोधन प्रक्रिया को विकसित किया है. इस प्रयोजन के लिए अगुणित कोशिकाओं के जोड़े लाल या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त युग्मनज गठन, विभिन्न समय पर काटा, और जिसके परिणामस्वरूप zygotes एक प्रवाह cytometry आधारित छँटाई प्रोटोकॉल का उपयोग कर शुद्ध थे अनुमति सह incubated थे. इस तकनीक को पवित्रता और परिपक्वता का एक सुविधाजनक दृश्य मूल्यांकन प्रदान करता है. औसत पवित्रताअंश का लगभग 90% है. फसल के समय के अनुसार, परिपक्वता की डिग्री बदलती के zygotes बरामद किया जा सकता है. शुद्ध नमूने "omic" अध्ययन के लिए प्रारंभिक संतान की वसूली के लिए, और इस पूर्वज सेल के व्यवस्थित जांच के लिए प्रस्थान का एक सुविधाजनक बिंदु प्रदान करते हैं.

Protocol

1. अगुणित सेल विकास

1. एस आगे बढ़ें मानक ¹⁰ शर्तों के तहत cerevisiae S288C पृष्ठभूमि (BY4741) से कोशिकाओं.
2. दो विशिष्ट फ्लोरोसेंट ¹⁰ मार्करों के या तो व्यक्त haploids रूपांतरण. पसंद के मार्कर घुलनशील cytoplasm में व्यक्त GFP (pEG220, URA3/YIp, ¹¹ BglII साथ linearized) और एक एकल ribosomal प्रोटीन, RPL25, mCherry (pAJ1661, URA3/CEN ए जॉनसन से) के साथ जुड़े हुए हैं. हम है कि बराबर दो रंग शुद्धीकरण प्रोटोकॉल अन्य चमकीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन कि अगुणित पैतृक कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं का उपयोग कर सकता है उम्मीद है. वैकल्पिक रूप से, कोशिका दीवार फ्लोरोसेंट lectins साथ लेबल किया जा सकता है.
3. दिन पूर्ववर्ती युग्मनज शुद्धि पर, प्रत्येक कोशिका प्रकार के 5 मिलीलीटर संस्कृतियों टीका लगाना और उन्हें 23 पर रातोंरात मिलाते डिग्री सेल्सियस A600 तक पहुँचने के लिए से अधिक 1.0 नहीं के साथ विकसित कर सकते हैं. पूरा सिंथेटिक मध्यम में GFP (ATY4442) 2% (CSM ग्लूकोज) ग्लूकोज सहित transformants आगे बढ़ेंसिंथेटिक चयनात्मक ¹⁰ uracil कमी माध्यम में एन डी RPL25 mCherry transformants (ATY4552). कमरे के तापमान पर झटकों के साथ प्रत्येक कोशिका प्रकार के समानांतर संस्कृतियों रखें.

2. एक क्रॉस का आयोजन

1. 1.0 ताजा मध्यम में प्रत्येक नमूने के ऑप्टिकल घनत्व (A600) समायोजित करें. [1 ऑप्टिकल घनत्व यूनिट 3 ~ 10 x ⁷ / सेल एमएल]
2. दो संस्कृतियों, भंवर संक्षेप में 3 बार, एक 10 सेकंड के लिए अब भंवर द्वारा पीछा के बराबर मात्रा में मिलाएं.
3. CSM ग्लूकोज प्लेटें तैयार. प्लेटों के नियमित विकास के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान हैं और गिरने के बाद 45 मिनट और ¹⁰ अगर solidification सूख गया.
4. के रूप में कई के रूप में बीस CSM ग्लूकोज प्लेटों की सतह के किनारे से मिश्रण 1 सेमी की 40 मिलीलीटर की बूंदों बांटो. जब बूंदों 1 सतह पर लागू कर रहे हैं टाइमर शुरू करने के लिए उपाय समय बीत. एक बार तरल अवशोषित किया गया है (लगभग 30 मिनट), प्लेटों को कवर करने के लिए और उन्हें roo पर undisturbed छोड़मीटर तापमान.

3. फसल काटने वाले तैयारी

1. हार्वेस्ट नमूने 23 में 1.75-2.5 घंटा के बाद ° C बार बार धोने से 150 मिलीलीटर ठंड CSM ग्लूकोज का उपयोग कर, बर्फ पर प्लेटें रखने थाली से व्यक्ति सूख बूंदों. बार बार छोटी बूंद क्षेत्र वसूली को अधिकतम करने के लिए एक ही माध्यम के साथ 10-20 बार धो लो. बर्फ पर 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में ले लीजिए.
2. बर्फ पर एक फिशर FB120 sonicator (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) के साथ 60% आयाम नमूने 10x sonicate जांच.
3. एक चरण माइक्रोस्कोप में सत्यापित करें कि कुछ या कोई समुच्चय रहते. कोशिकाओं के 15-50% की उम्मीद कर रहे हैं इस बिंदु पर युग्मनज का गठन किया है.
4. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक और एहतियाती उपाय (समुच्चय व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के) के रूप में 10 मिनट के लिए बर्फ पर undisturbed कोशिकाओं की ट्यूब छोड़ दें.
5. मात्रा के सर्वोच्च 90% स्वस्थ और यह एक नायलॉन मेष (झरनी टोपी (352,235 रेफरी) के साथ BD फाल्कन Polypropylene ट्यूब) के माध्यम से फिल्टर. एक ठेठ प्रयोग, 10 ⁷ कोशिकाओं मेंएक थाली से बरामद यह CSM ग्लूकोज की 4 मिलीलीटर में पतला बिंदु पर थे.

4. फ्लो

1. तरह एक 100 माइक्रोन टिप के साथ सोनी iCyt परावर्तन मॉडल प्रवाह cytometer (अत्यधिक स्वचालित समानांतर तरह) HAPS1 का उपयोग कोशिकाओं. GFP उत्तेजना, नीले argon आयन, 488 एनएम पर 250 milliwatt लेजर का उपयोग करें. MCherry उत्तेजना के लिए, 561 एनएम पर 100 milliwatt लेजर का उपयोग करें. हालांकि हम अन्य मशीनों के साथ अनुभव नहीं है, हम उम्मीद करते हैं कि Becton Dickinson FACSAria, Becton डिक्सन बाढ़ या Beckman कल्टर MoFlo XDP ठीक हो सकता है जब सही लेज़रों के साथ सुसज्जित है.
2. बेस एक आगे बनाम वापस तितर बितर साजिश पर मानकों क्रम में व्यवहार्य कोशिकाओं पर फाटक छँटाई. 615 के एक उत्सर्जन साजिश स्थापित + / - 30 एनएम bandpass फिल्टर (mCherry) बनाम 525 + / - 25 एनएम bandpass फिल्टर (GFP) चार quadrants में घटनाओं विभाजित करने के लिए "लाल + ग्रीन -",, "लाल ग्रीन + +", "लाल - ग्रीन ", और" लाल हरे "+ (S2 चित्रा). एक मानक च रूप में nonfluorescent कोशिकाओं का उपयोग करेंया "रेड - ग्रीन 'वृत्त का चतुर्थ भाग के दृढ़ संकल्प.
3. 21.5 साई एक म्यान दबाव, 43,400 / बूँदें सेकंड के एक छोटी बूंद आवृत्ति, और 20.5 साई का एक नमूना दबाव के साथ क्रमबद्ध कोशिकाओं.
4. प्रारंभिक क्रमबद्ध करें ("वसूली मोड"): ठंडा Eppendorf ठंड CSM ग्लूकोज की 250 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में नमूने ले लीजिए. 10 एक प्रशीतित microfuge में शीर्ष गति (Tomy MRX-150, 15,000 rpm) तलछट सेकंड और प्रवाह समाधान (प्रवाह cytometry म्यान (1 मिमी EDTA के साथ पीबीएस) समाधान BioSure कैटलॉग 1027 सं) aspirate. 500 मिलीलीटर ठंड CSM ग्लूकोज में Resuspend.
5. दूसरी तरह ("पवित्रता मोड"): प्रारंभिक प्रकार के लिए तरह आचरण, "पवित्रता मोड" विकल्प का उपयोग करें. तलछट की कोशिकाओं को शुद्ध और 500 मिलीलीटर मिलीलीटर 1.0 CSM ग्लूकोज में छर्रों resuspend. 24 अच्छी तरह प्लेटें में 15 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर शेक चयापचय वसूली की अनुमति.

5. DeltaVision माइक्रोस्कोपी

1. Agarose पैड के रूप में निम्नानुसार तैयार: 1.5% agarose के एक निलंबन लाओ (UltrapureAgarose, Invitrogen, 15510-07 # CSM ग्लूकोज में) कैटलॉग एक फोड़ा, भंवर संक्षेप में, और फिर क्षैतिज मानक स्लाइड्स कांच की सतह agarose समाधान के 0.3 मिलीलीटर नमूने लागू करते हैं और उन्हें एक दूसरे स्लाइड के साथ एक बार में कवर (बिना दबाव लागू).
2. 10 मिनट के लिए ठंडा करने के बाद, धीरे यह क्षैतिज फिसलने से ऊपरी स्लाइड निकालने के लिए, देखभाल करने के लिए एक चिकनी सतह छोड़ और agarose परत परेशान नहीं. (जब ऊपरी स्लाइड हटा दिया गया है, कोशिकाओं के नमूने 1-2 मिनट के भीतर लागू किया जाना चाहिए जब ऊपरी स्लाइड हटाने के बिना कमरे के तापमान पर एक नम कक्ष में रखा, पैड के लिए भंडारित किया जा सकता है का उपयोग करने से पहले एक दिन के लिए.)
3. तलछट नमूने और agarose पैड पर गोली के 1 मिलीलीटर aliquots (सतह को छूने के बिना) जमा. तुरंत एक वर्ग नंबर 1 coverslip साथ नमूना कवर. दूर एक एकल धार razorblade के साथ अतिरिक्त agarose छाँटो. वेसिलीन के साथ तैयारी एक सिरिंज से तिरस्कृत सील.
4. छवि DeltaVision (एप्लाइड Precisio का उपयोगn) के ∞ / 0.17/FN26.5), binning बिना एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (ओलिंप UPlanApo 100x/1.40 के साथ.
5. Z-ढेर softWoRx 5.0.0 कार्यक्रम (Deconvolve http://www.api.com/softworx.asp ) और न्यूनतम की प्रक्रिया. उत्तरोत्तर z विमानों आम तौर पर 0.2-0.4 माइक्रोन अंतराल पर एकत्र किए गए थे.

6. प्रतिनिधि परिणाम

बदल अगुणित कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर: haploids में प्रतिदीप्ति स्तर चित्रा S1 में सचित्र है. इससे पहले कि पार, epifluorescent परीक्षा का प्रदर्शन किया है कि अनिवार्य रूप से सभी GFP transformants हरे थे और सभी mCherry transformants, हालांकि अक्सर fainter, लाल थे. सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया वास्तव में थे फ्लोरोसेंट, हम प्रतिभाशाली फ्लोरोसेंट संकेत के साथ subpopulation इस्तेमाल किया.

उपज: एकfter प्रारंभिक सॉर्ट, लाल + ग्रीन + नमूना (S2 चित्रा) आम तौर पर कोशिकाओं के इनपुट संख्या के 8-20% और अगुणित कोशिकाओं, शायद लगातार आसंजन सेल सेल के लिए कारण का एक अत्यधिक संख्या में शामिल हैं. चूंकि उच्च संवर्धन एक ही प्रकार के साथ नहीं हासिल की है, आंशिक रूप से शुद्ध नमूना जांच 60% पुनः छँटाई के द्वारा पीछा आयाम दो बार sonicated होना चाहिए. कोशिकाओं के 2 प्रकार के लिए अधीन (रिकवरी आम तौर पर 1-2 घंटे के बीच पिछले प्रकार, जबकि दूसरी तरह के केवल 15 मिनट की आवश्यकता होती है), लाल + ग्रीन + नमूने इनपुट कोशिकाओं के 23-52%.

अन्वीक्षण चरण: चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा से पता चला है कि अंतिम युग्मनज तैयारी की शुद्धता 21 तैयारियाँ (86% से 91% को लेकर) से अधिक लगभग 90% औसत. contaminants या तो हरी या लाल, haploids, haploids है कि एक दूसरे के साथ संपर्क में थे या जोड़ों चित्रा 3 थे. युग्मनज का प्रतिशत है कि tabulatesकोई कली, औसत दर्जे का (मेड) कलियों, पार्श्व (LAT) कलियों या टर्मिनल कलियों (टर्म), एक ही रंग की बनती haploids की संख्या ("2Same") या अलग रंग ("2Hap"), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत haploids ( पड़ना). जब कोशिकाओं को 1.75 घंटा के बाद काटा गया, 50% से अधिक थे unbudded और अन्य उपश्रेणियों की अपनी उपश्रेणियाँ (औसत दर्जे का, पार्श्व, या टर्मिनल कलियों के साथ) को समान रूप से प्रतिनिधित्व कर रहे थे. 2.5 घंटे बाद वहाँ (unbudded, औसत दर्जे का, पार्श्व या टर्मिनल कलियों के साथ) चार श्रेणियों में से प्रत्येक में लगभग समान युग्मनज की संख्या थे.

सूक्ष्म टिप्पणियों (4 चित्रा):

युग्मनज की संरचना के लिए शुद्धिकरण के दौरान अपरिवर्तित रहना होता है. पार की अवधि के अनुसार, जनसंख्या unbudded और अंकुरित युग्मनज के विभिन्न अनुपात था, जैसा कि ऊपर बताया. चूंकि दोनों हरे और लाल haploids फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता में काफी भिन्नता से पता चला है, कुछ zygotes मुख्य रूप से लाल थे, जबकि दूसरों को मुख्य रूप से हरे थे, रूप में comparin द्वारा मनाया जाता हैछ चित्रा 4 में संयुक्त छवियों को छवियों एकल रंग. यह भी ध्यान दें कि GFP (26kDa मेगावाट) नाभिक में प्रवेश करती है और तब भी जब नाभिक नाभिक नहीं जुड़े हुए हैं में पाया जा सकता है. Vacuoles काले गैर फ्लोरोसेंट क्षेत्रों के रूप में बाहर खड़े हो जाओ.

शुद्धि के अंत उत्पाद विकास के विभिन्न चरणों में एक विविध आबादी पैदावार. Zygotes आया नहीं है संलयन लेबल. टाइप बी zygotes unbudded हैं. प्रकार सी एक छोटी सी कली है. प्रकार एक बड़ा कली, और डी प्रकार ई zygotes कोशिका विभाजन में कोशिकाद्रव्य का दो भागों में अलग - अलग हो जाना से गुजरना के बारे में हैं. यह भी ध्यान दें कि पहले युग्मनज के कई अभी भी एक गैर फ्लोरोसेंट औसत दर्जे का विभाजन रेखा (*) प्रदर्शन और vacuolar "विरासत संरचना" (मैं) ¹² अक्सर कली में युग्मनज विस्तार से देखा जा सकता है कि. कुछ मामलों में, हरी झंडी साथी में लाल संकेत है कि एक बहुत बड़ी हद पुनः वितरित किया गया है. यह स्थानांतरण की देरी है कि polysomes की विशेषता (Tartakoff, तैयारी में) है को दर्शाता है.

6 zygotes, जो कई immunoblots के लिए पर्याप्त है ठीक है, chemiluminescent पता लगाने प्रक्रियाओं का उपयोग. Phenol के क्लोरोफॉर्म अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग हम कोशिकाओं के इस संख्या से शाही सेना के लगभग 1.5 मिलीग्राम निकालने.

चूंकि शुद्ध zygotes आगे के विश्लेषण से पहले ठंडा किया गया है, हम 23 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम विकास में ऊष्मायन की सलाह देते हैं.

चित्रा 1. युग्मनज के गठन के कालक्रम haploids और diploids के बीच एक मध्यवर्ती के रूप में zygotes. इस चित्र haploids शास्त्रीय (shmooing) सक्रियण, उनके संलयन, और प्रारंभिक कली के गठन से पता चलता है. कलियों या तो औसत दर्जे का (एम), पार्श्व (एल) या टर्मिनल (टी) हो सकता है.

चित्रा 2. युग्मनज शुद्धि प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध ग्लूकोज के साथ पूरा मध्यम में अगर प्लेटों की सतह पर ऊष्मायन के बाद, सेल मिश्रण धोने से बरामद किया गया था और फिर "वसूली मोड" में एक प्रारंभिक तरह "पवित्रता मोड में एक दूसरे प्रकार के द्वारा पीछा करने के लिए किए. " पीले रंग का प्रतीक है कि दोनों mCherry और GFP संकेतों युग्मनज में दिखाई दे रहे थे.

चित्रा 3. Fractions शुद्ध. संभोग मिश्रण में युग्मनज की किस्मों 1.75 या 2.5 अपेक्षाकृत जल्दी बनाम अपेक्षाकृत अधिक परिपक्व युग्मनज में समृद्ध fractions ठीक घंटा के बाद काटा गया. आठ स्वतंत्र प्रयोगों, अलग रंगों द्वारा नामित, हर समय बिंदु के लिए प्रदर्शन किया गया. रेखांकन युग्मनज के रिश्तेदार संख्या से संकेत मिलता है कि हाकली गठन के spatially अलग पैटर्न ve. ऊष्मायन का संक्षिप्त अवधि को देखते हुए (कमरे के तापमान पर कम से कम 2.5 घंटा) सभी मनाया कलियों प्रारंभिक युग्मज नवोदित घटनाओं रहे हैं.

चित्रा 4. समृद्ध fractions का DeltaVision एक विशिष्ट क्षेत्र परीक्षा DeltaVision माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी. चित्र या तो दोनों लाल और हरे रंग या एकल रंग दिखा. लाल polysomal (Rpl25p mCherry) लेबल और साइटोसोलिक GFP करने के लिए हरी से मेल खाती है. नोट vacuoles कलियों (v), (ख), (एन) नाभिक, vacuolar "विरासत संरचना" (i), और विभाजन (*) जो माता पिता अलग होता है: युग्मनज के उच्च संवर्धन, और नामित subcellular सुविधाओं अपेक्षाकृत जल्दी युग्मनज में डोमेन. उनके चर समग्र रंग haploids कि में जुड़े हुए के रिश्तेदार तीव्रता को दर्शाता है. जिन मामलों में दो माता पिता के डोमेन को बनाए रखने मेंएक अलग रंग, मार्कर (cytoplasmic GFP, mCherry टैग polysomes) के संतुलन अधूरा था. प्रगति में समय चूक के अध्ययनों से पता चलता है कि पहले polysomes घुलनशील GFP redistributes. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक महापुरूष

चित्रा S1. अगुणित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति दूर छोड़ दिया: mCherry टैग polysomes कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए हरी झंडी का पता लगाने के लिए जांच की गई. आयताकार खिड़की नकारात्मक कोशिकाओं से बचने के लिए स्थापित किया गया था. मध्य ग्राफ: साइटोसोलिक GFP व्यक्त कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया अलग उज्ज्वल सकारात्मक के प्रमुख जनसंख्या दिखा. अभी तक सही: mCherry टैग polysomes व्यक्त कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. आयत (दूर बाईं तरफ के समान) प्रतिभाशाली कोशिकाओं शामिल हैं और सभी की अनुमति देता हैनकारात्मक से परहेज किया. पदनाम "R2" संकेत आयत के भीतर बरामद कोशिकाओं के प्रतिशत को इंगित करता है.

S2 चित्रा. सेल 1 और 2 छँटाई में वितरण ये दो रंग भूखंडों. ऊपरी सही वृत्त का चतुर्थ भाग (R5) में ग्रीन + लाल + कोशिकाओं के अनुपात से संकेत मिलता है. यह अनुपात 2 प्रकार में 52% करने के लिए बढ़ जाती है. क्षैतिज अक्ष: हरी झंडी. उर्ध्वाधर धुरी: लाल संकेत.

Discussion

शुद्ध युग्मनज की उपलब्धता के transcriptomics, प्रोटिओमिक्स और lipidomics, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्र की जांच सहित जैव रासायनिक अध्ययन की सुविधा चाहिए जिसके द्वारा युग्मनज सेल चक्र पुनः प्रवेश, कोशिका दीवार remodeling, नवोदित और विरासत विशेषताओं, आदि वैकल्पिक रूप से गुजरना, युग्मनज शुरू उत्पन्न किया जा सकता है एक या दोनों माता पिता में विशेषता उत्परिवर्तन ले उपभेदों के साथ. इसके अलावा, शुद्ध zygotes अगुणित या द्विगुणित कोशिकाओं के रूप में, 15% ग्लिसरॉल युक्त मध्यम में जमे हुए किया जा सकता है और बाद में आवर्तक नवोदित के पहलुओं पर नजर रखने के thawed.

प्रारंभिक अन्य फ्लोरोसेंट सूक्ष्म प्रयोजनों के लिए उपयुक्त मार्कर (उदाहरण के टैग histones या mitochondrial प्रोटीन) का उपयोग करते हुए प्रयोगों युग्मनज के विश्वसनीय वसूली नहीं की अनुमति दी है, लेकिन यह संभावना है कि तुलनीय शुद्धि अगुणित कोशिकाओं जिसका सेल दीवार के साथ शुरू प्राप्त किया जा सकता है लाल करने के लिए मिलकर किया गया है या हरी fluorophores. हम से परहेज हैuch प्रक्रियाओं के बाद से वे अतिरिक्त तनाव लागू और युग्मनज गठन के प्रारंभिक दौर को प्रभावित कर सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11)	E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry	A. Johnston
Fisher FB120 sonicator	Fisher Scientific
Polypropylene tube with strainer cap	BD Falcon	Ref 352235
Refrigerated microfuge	Tomy	MRX-150
Flow cytometry sheath solution	Biosure	1027
iCyt Reflection Model Flow Cytometer	Sony
DeltaVision deconvolution microscope	Applied Precision
Upright epifluorescence microscope	Leica
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-07
CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco)	10