Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Summary

Cardiac kerner isoleres via densitet sedimentation og immunolabeled med antistoffer mod pericentriolar materiale 1 (PCM-1) til at identificere og sortere cardiomyocyte kerner ved flowcytometri.

Abstract

Identifikation af cardiomyocyte kerner har været udfordrende i vævssnit, som de fleste strategier er baseret udelukkende på cytoplasmiske markørproteiner ^1. Sjældne begivenheder i hjertemyocytter såsom spredning og apoptose kræver en præcis identifikation af hjertets myocytter kerner til at analysere cellulære fornyelse i homøostase og i patologiske tilstande ^2. Her, tilvejebringer vi en fremgangsmåde til isolering cardiomyocyte kerner fra post mortem væv ved tæthed sedimentation og immunolabeling med antistoffer mod pericentriolar materiale 1 (PCM-1) og efterfølgende flowcytometri sortering. Denne strategi muliggør et højt gennemløb analyse og isolering med fordelen ved at arbejde lige så godt på frisk væv og frosset arkivmateriale. Dette gør det muligt at studere materialet allerede er indsamlet i biobanker. Denne teknik kan anvendes og testes i en lang række arter og er egnet til flere efterfølgende anvendelser, såsom carbon-14 datering ^3, celle-cyCle analyse ^4, visualisering af thymidinanaloger (f.eks BrdU og IDU) ^4, transkriptom og epigenetiske analyser.

Protocol

1. Isolering af Cardiac Kerner

1. Coat ultracentrifugerør (Beckman centrifugerør # 363664) med 10 ml 1% BSA / PBS coatingopløsning. Hætten rørene og lad dem rotere i 30 minutter i et rør rotator. Fjerne coatingopløsning og lade centrifugeglas lufttørre (et rør pr mus hjertet kræves til analyse af enkelte mus hjerter, skiftevis op til 5 mus hjerte eller 1 g af hjertevæv fra en anden art (fx menneske) kan behandles i et rør).
2. Alle følgende trin bør udføres på is. Dissekere den venstre ventrikel fra frisk eller lynfrosset mus hjerte med en skalpel. Bemærk, er denne protokol optimeret for muse hjertet, men kan også tilpasses til rotte-eller human hjerte. Alternativt anvende op til 1 g af hjertevæv fra en anden art.
3. Trim prøven i små båse med en skalpel.
4. Overfør vævsstykker i et 50 ml Falcon-rør fyldt med 15 ml lysisbuffer.
5. Homogeniserehjertevæv med en T-25 Ultra-Turrax probe homogenisator (IKA) ved 24 tusind rpm i 10 sek.
6. Fortynd homogenatet med lige volumen af ​​lysisbuffer til 30 ml.
7. Anvende et glas douncer (40 ml) til yderligere at homogenisere vævet og frie kernerne. Udføre otte slag med en stor frigang pistil.
8. Før rå kerner isolere gennem en 100 um og 70 um nylon mesh cellefilter (BD Biosciences), efter hinanden.
9. Vågeblus det rå kerner isolat i en afkølet centrifuge (4 ° C) ved 700 x g i 10 min.
10. Fjern supernatanten forsigtigt ved at vende rørene og tør indersiden af ​​røret med papirserviet. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre kerner pellet.
11. Opløse det rå kerner isolat i 5 ml saccharose-puffer ved pipettering af opløsningen flere gange op og ned. Tilsættes yderligere 25 ml sucrose-puffer til den opløste pellet.
12. Der tilsættes 10 ml frisk fremstillet saccharose buffer til den coatede ultracentrifugerør (se trin 1.1). </ Li>
13. Omhyggeligt overlejre den tilsatte 10 ml saccharose-puffer med den resuspenderede kerner pellet opløst i sucrose-puffer fra trin 1.9.
14. Balance centrifugeglassene før placere dem i en JS13.1 frit svingende rotor og placere rotoren i en høj hastighed centrifuge (Beckman Avanti S-25).
15. Spin kernerne prøven ved 13.000 x g ved 4 ° C i 60 min.
16. Når centrifugering er afsluttet, fjernes rørene forsigtigt fra rotoren og kassér supernatanten ved at vende rørene og tørrer det resterende snavs fra indersiden af ​​rørene med papirserviet.
17. Opløs kerner pelleten i 1 ml af kerner opbevaringsbuffer (NSB plus buffer). Bemærk: NSB plus indeholder 1,5 mM spermin som en DNA-stabilisator.
18. Fortsæt med trin 2,1, immunfarvning af cardiomyocyte kerner.

2. Immunfarvning for Flowcytometri

1. Forbered den negative kontrol for immunfarvning. Tag en portion på 20 gl ud af kerner prøve og endd 980 ul NSB plus buffer.
2. Tilsættes anti-pericentriolar materiale 1-antistof (kanin-anti-PCM-1, Atlas Antibodies) til kerner prøven i en fortynding på 1:500 til immunolabel cardiomyocyte kerner. Tilføje isotype antistof i samme fortynding af anti-PCM-1-antistof til den negative kontrol, fremstillet i trin 2.1.
3. Inkuber negativ kontrol og prøve røret ved 4 ° C natten over.
4. Vask negativ kontrol og prøve mindst en gang med NSB plus buffer (vågeblus rør i en afkølet centrifuge (4 ° C) ved 700 x g i 10 minutter. Supernatanten kasseres, og opløses kernerne pellet i 1 ml NSB plus buffer).
5. Tilsættes anti-kanin-fluorescerende sekundært antistof (FITC eller APC) til negativ kontrol-og prøveglas i en fortynding på 1:1000.
6. Inkuber negativ kontrol og prøverøret ved 4 ° C i 1 time.
7. Vask negativ kontrol og prøve mindst en gang med NSB plus buffer (vågeblus rør i en afkølet centrifuge (4 ° C) ved 700 x g i 10 minutter. Supernatanten kasseres, og opløses kernerne pellet i 1 ml NSB plus buffer).
8. Fortsæt med flowcytometrisk analyse og sortering.

3. Flowcytometri

1. Coat kerner opsamlingsrør (Falcon 15 ml) med 1% BSA / PBS-opløsning, før man begynder flowcytometri sortering som beskrevet i trin 1.1
2. Der filtreres, og den negative kontrol gennem en 30 um cellefilter og indlæses først den negative kontrol til flowcytometer (BD Tilgangen). Definerer første og anden port for at definere kerner og singletter (enkelt kerner), baseret på forward scatter (FSC), fremadrettet lysspredning impulsbredde (FS pulsbredde) og sidespredning (SSC) (fig. 2a og b). Tilsætning af en DNA-farve (DRAQ5 (1:500)) til prøven kan bidrage til at identificere kerner population oprindeligt.
3. Indlæse immunolabeled prøven og definerer den tredje gate at isolere cardiomyocyte kerner (PCM-1-positve) fra ikke-cardiomyocyte kerner (PCM-1-negativ). Start sortering(Fig. 2C og D).

Valgfrit: For at analysere nuklear DNA-indhold (ploidi) og til at udføre cellecyklusanalyse tilsættes en passende DNA-farvning mod kernerne (f.eks Hoechst 33342 eller DRAQ5) (fig. 2e).

4. Efter flowcytometri sortering placere kernerne på is og re-analyse for at bestemme sortering renhed (fig. 3a og b).
5. Spin ned sorteres kerner i opsamlingsrør ved 1500 xg i en afkølet centrifuge i 15 min.
6. Opløs kerner pelleten i en puffer i overensstemmelse med den nedstrøms ansøgning.

4. Repræsentative resultater

Kerner morfologi og integritet kan vurderes ved DNA pletter og visualiseret ved mikroskopi (fig. 1). Vellykket PCM-1 mærkning kan vurderes ved epifluorescens-mikroskopi og ved flow-cytometri (fig. 1 og fig. 2C og D). PCM-1-posive og negative populationer skal være godt adskilt fra hinanden (fig. 2C og D). I murin venstre ventrikel 30% af alle kerner bør være cardiomyocyte kerner (fig. 2d). Sortering renhed kan vurderes ved igen at analysere sorteret kerner (fig. 3a og b). Begge kerner populationer bør have en sortering renhed på over 95%.

Figur 1. PCM-1 identificerer cardiomyocyte kerner. Cardiac kerner (a) er farvet med antistoffer mod PCM-1 (b) og Nkx2.5 (c) i en voksen mus hjerte. (D) PCM-1-mærkede kerner er omgivet af cardiomyocyte cytoplasma (myosin-tung kæde (MHC)) og udtrykke transkriptionsfaktoren Nkx2.5, dokumenterer præcis identifikation af cardiomyocyte kerner ved PCM-1-farvning (omfattende stængerne 20 um og 10 um (d, indsat)). (E) Hjerte kerner isolater visualiserede med DNA-farve DRAQ5. (F og g) Cardiomyocyte kerner er mærket med antistoffer mod PCM-1 (Skalastang 10 um). Bemærk, at epinuclear farvningsmønster af PCM-1 myocytter kerner i vævssnittet og i isolerede kerner (pile).

Figur 2. Flowcytometrisk sortering af cardiomyocyte kerner. (A) Cardiac kerner identificeres ved Forward Scatter (FSC) og sidespredning (SSC). (B) En anden port identificerer én kerner af FSC og FS impulsbredde ^5. (C, d) Fluorescerende gating muliggør separation af cardiomyocyte kerner (PCM-1-positive) og ikke-cardiomyocyte (PCM-1-negative) kerner fra hjertevæv. (E) mus cardiomyocyte meste (> 80%) diploide (2n), kun en lille delmængde er tetraploid (4n) ^6. Bemærk, menneskelige cardiomyocytes indeholde en højere frekvens af polyploidi kerner (> 2n) ^7,8.

Discussion

Nøjagtig identifikation af cardiomyocyte kerner er afgørende for analysen af regenerative processer i myokardiet ^2,3. Konventionelle teknikker til isolering cardiomyocytter fra frisk væv er primært baseret på enzymatisk nedbrydning af ekstracellulære matrixproteiner, og efterfølgende oprensning af interstitielle celler ved centrifugering ved lav hastighed. Yderligere oprensning af levende cardiomyocytter fra embryoniske stamceller (ESC) kan udføres ved immunolabeling med overflademarkører såsom Sirpa ⁹ eller mitokondrier farvestoffer ^10, kan faste cardiomyocytter identificeres ved cytoplasmiske markører, såsom myosin-tung kæde (MHC) eller kerneproteiner, såsom GATA4 eller Nkx2.5. Imidlertid er ekspressionen af Nkx2.5 og GATA4 ikke begrænset til modne cardiomyocytter, men kan også påvises i progenitor celler under udvikling og efter hjerteinfarkt ^11,12. Genetiske strategier til identifikation cardiomyocytes viser den højeste specificitet, men cAnnot anvendes i store dyremodeller eller mennesker ^1. Begrænsningerne i de eksisterende strategier har ført til kontroversielle konklusioner afhængige af kvantificering af sjældne begivenheder, såsom spredning, apoptose og kimærisme ^1,13. Der er således behov for at etablere en korrekt strategi til at identificere og oprense modne differentierede cardiomyocyte kerner.

Her beskriver vi en oprensning teknik baseret på pericentriolar materiale 1 (PCM-1). Tidligere har vi styrket gyldigheden af vores kerner isolation ved at vise, at tre uafhængige nukleare markører, PCM-1, kardial troponin T og I, at identificere den samme cardiomyocyte befolkning. ^2,3 Den oprensede population viste en stor berigelse af cardiomyocyte specifikke genprodukter, som hjerte troponiner og myosin-tung kæde protein og transkriptionsfaktoren Nkx2.5 og GATA4 ^2,3.

Den nuværende protokol, er baseret på PCM-1, har været anvendt med succes feller analyse af humane og muse cardiomyocyte omsætning ^2,4 samt analyse af cardiomyocyte transkriptionelle profil ^{2. Fig.} Vi forventer, at den fremlagte strategi også kan tilpasses til isolering af cardiomyocytes fra andre arter. PCM-1, en ​​centrosome protein, re-lokaliserer til kernemembranen, hvor den akkumuleres og danner en uopløselig matrix kun i differentierede myocytter ^2,14 (Fig. 1). Flowcytometri tillader hurtig objektiv analyse af et stort antal celler, som er nødvendig for at kvantificere sjældne begivenheder i cardiomyocytter såsom apoptose og cellecyklus genindtræden ^15. Endvidere nukleotidanaloger (f.eks BrdU)-baserede proliferationsassays let kan påføres ved hjælp af vores præsenteret teknik ^4. Vor teknik har den fordel, at DNA-indholdet i en enkelt cardiomyocyte kerner (nuklear ploidi) kan analyseres multinucleare cardiomyocytter ^16,17, som giver vigtig informationat skelne mellem cardiomyocyte dobbeltarbejde og polyploidisation ^6-8. Imidlertid, på grund af karakteren af ​​vores strategi, en karakterisering af cardiomyocyte multinucleation ikke er mulig.

Yderligere anvendelser af den fremlagte metode er undersøgelser fokuserede på epigenetiske ændringer af kromatin, nukleoproteiner, protein-DNA/RNA interaktioner og på den nukleare transkriptomet ^18,19.

På grund af stabiliteten af ​​kerner i fryse-optøet væv, kan præsenteres kernerne isolation strategi også anvendes til frosne væv, hvilket gør det muligt at anvende arkiveret materiale fra biobanker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Lysis Buffer
Name of the reagent
0.32 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl2
5 mM magnesium acetate
2.0 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1 mM DTT
2. Sucrose buffer
Name of the reagent
2.1 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM magnesium acetate
1 mM DTT
3. Nuclei storage buffer (NSB plus)
Name of the reagent
0.44 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)
70 mM KCl
10 mM MgCl2
1.5 mM spermine
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle "L"	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR