Summary
يوصف طريقة محددة وحساسة لاكتساب نظرة ثاقبة في التعبير عن مستضدات الشخصي glycosphingolipid في أجهزة المناعة والخلايا. الأسلوب يستفيد من قياس الطيف الكتلي ايون فخ السماح تدريجي تفتيت جزيئات glycosphingolipid التحليل البنيوي للمقارنة معايير مركبة كيميائيا.
Abstract
الشحميات السفنغولية السكرية (لGSL) تنتمي إلى فئة من الجزيئات الكبيرة الحيوية glycoconjugate، التي تحمل المعلومات الهيكلية للعمليات البيولوجية الهامة مثل التطور الجنيني، نقل الإشارة، والاعتراف المناعة مستقبلات 1-2. أنها تحتوي على السكر الأنصاف المعقدة في شكل أيزومرات، والأنصاف الدهون بما في ذلك مع وجود اختلافات الدهنية أسيل طول السلسلة، والتشبع، والهيدروكسيل. قد حد سواء الكربوهيدرات وسيراميد أجزاء تكون أساس الأهمية البيولوجية. على سبيل المثال، ثلاثي hexosylceramides تشمل globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) وisoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)، والتي لها الجماهير الجزيئية متطابقة ولكن الروابط السكر متميزة من الكربوهيدرات شاردة، مسؤولة عن الوظائف البيولوجية مختلفة تماما 3-4. وفي مثال آخر، فقد ثبت أن تعديل الجزء سيراميد ألفا galactosylceramide، ويجند ناهض قوية لinvariالنمل خلايا NKT، والتغيرات ملفاتهم الشخصية إفراز خلوى وظيفة في النماذج الحيوانية من السرطان وأمراض المناعة الذاتية 5. صعوبة في أداء التحليل البنيوي الايزومرات في أجهزة المناعة وخلايا بمثابة حاجز لتحديد العديد من الوظائف البيولوجية 6.
هنا، نقدم نسخة من تصور طريقة لتحليل بسيطة نسبيا وسريعة، وحساسة لمحات glycosphingolipid في الخلايا المناعية 7-9. ويستند هذا الأسلوب على التعديل واستخراج الكيميائية (permethylation، وانظر أدناه 5A الشكل، استبدال جميع الفئات OH من هيكسوز بواسطة ميو بعد رد فعل permethylation) من الشحميات السفنغولية السكرية 10-15، تليها التحليل اللاحق باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت من على متن الطائرة قياس الطيف الكتلي (MALDI-TOF/MS) ومطياف الكتلة ايون الفخ. هذه الطريقة تتطلب 50 مليون خلية المناعة لإجراء تحليل كامل. ويمكن الانتهاء من التجارب في غضون أسبوع. ويمكن تحديد الوفرة النسبية للالشحميات السفنغولية السكرية المختلفة بالمقارنة مع المعايير الصناعية. هذا الأسلوب لديه حساسية لقياس 1٪ iGb3 بين ايزومرات Gb3، عند 2 fmol من خليط iGb3/Gb3 موجود مجموع 9.
ويمكن استخدام مطياف الكتلة ايون فخ لتحليل ايزومرات. على سبيل المثال، لتحليل وجود globotriaosylceramide وisoglobtriaosylceramide في نفس العينة، يمكن للمرء استخدام تفتيت جزيئات glycosphingolipid هيكليا للتمييز بين الاثنين (انظر أدناه الشكل 5). وعلاوة على ذلك، الكيميائية تعديل الأنصاف السكر (من خلال رد فعل permethylation) يحسن من الكفاءة وتجزئة التأين للحساسية ونوعية أعلى، ويزيد من استقرار بقايا الحامض اللعابي. لا يمكن أن يؤديها التعديل الكيميائي للاستخراج والشحميات السفنغولية السكرية في غطاء محرك السيارة الكلاسيكية الكيميائية المعتمدة، ويمكن القيام بها في مطياف الكتلة الأساسية من قبلمرافق للصكوك أيون MS الفخ.
Protocol
1. مختبر مخاوف الأمان
- يجب أن يتم تخزين جميع المذيبات العضوية في مجالات محددة مع وضع العلامات واضحة. انظر التسميات لأنواع المصنوعات من طفايات الحريق المطلوبة.
- الكواشف المستخدمة هي عدة المسرطنة المحتملة، ويمكن أن يتسبب الاكتئاب النفسي. يجب التعامل مع هذه الكواشف الكيميائية في غطاء محرك السيارة مع التهوية (انظر الجدول الكواشف والمعدات الخاصة للحصول على تفاصيل).
- فمن المستحسن أن عند العمل مع المذيبات العضوية والخلايا، ومعدات الوقاية الشخصية مثل القفازات، معطف المختبر، وحماية العين استخدامها في جميع الأوقات.
2. استخراج الشحميات السفنغولية السكرية من خلايا سرطان الدم الجرذ
- متجر اللوكيميا خلايا الفئران RBL 8 (10٬000٬000-100٬000٬000) في 16x100 مم أنابيب زجاجية تحت ظروف -80 درجة C. يتم عد الخلايا قبل عدادة الكريات بعد تلطيخ الأزرق التريبان. يجب بقاء الخلايا يكون أعلى من 95٪.
- استخراج الدهون باستخدام sonicat واسعةأيون أربع مرات كل ساعة لمدة 1-2 مع المذيبات القطبية مختلطة. استخدام 6 مل من الميثانول كلوروفورم 1:1 (V / V) والمذيب الأول والأخير. ستة ملليلتر من الأيزوبروبانول: الهكسان: يمكن بعد H 2 O 55:25:20 (ت / ت / ت، وإزالة الجزء العلوي من مرحلة التطلع قبل الاستخدام) أن تستخدم المذيب الثانية والثالثة. ويتم إعداد هذا المذيب عن طريق خلط الأيزوبروبانول: الهكسان: H 2 O في نسبة 55:25:20، تهتز بقوة أنه، والسماح لمرحلة العليا تظهر، والتي سيتم إزالتها. الحفاظ على انخفاض المرحلة للاستخدام.
- اتبع صوتنة مع الطرد المركزي لبيليه المواد غير القابلة للذوبان. بركة supernatants. تجفيفها في Speedvac لمدة 4 ساعة. ويمكن استخدام تيار النيتروجين أو المبخر الدوار إذا Speedvac غير متوفر. استخدام مصيدة جيدة الباردة لعقد المذيبات العضوية تبخرت. سوف تلوث المذيبات العضوية إلى فراغ ضخ النفط إلى تدهور كفاءة مضخة فراغ.
- إجراء تحليل أولي باستخدام الأداء اللوني عالية رقيقة طبقة (HPTLC). لتحديد السكرية، إعداد أورسينول 0.2٪ في 50٪ محلول حمض الكبريتيك (100 ملغ في 50 مل) ومستوى سكر اللبن (40 ملغ في 100 مل محلول المخزون). إعداد في 30 ميكرولتر حجم رد الفعل سلسلة من التخفيفات لاستخدام منحنى القياسية (من 0 ز / L إلى 20 جم / لتر). إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة الميثانول لسلسلة التخفيف. حل كل عينة شحمي سكري في 200 ميكرولتر من الميثانول، يصوتن، واستخدام 20 ميكرولتر لقياس كمية شحمي سكري. في 1.5 مل أنابيب إيبندورف مع قبعات ثمل (Sarstedt، 72.692.005)، إضافة 0.4 مل من 0.2٪ في 50٪ أورسينول حل حامض الكبريتيك إلى كل عينة، مع سلسلة من سكر اللبن-H حلول O-الميثانول (2) الذي عمل لمنحنى القياسية . يغلي لمدة 5 دقائق في كتلة التدفئة في 100 ° C. قراءة الكثافة البصرية من رد فعل اللون في 440 نيوتن متر باستخدام صفيحة ميكروسكوبية قارئ TECAN شروق الشمس. لأداء HPTLC، استخدم الكلوروفورم: الميثانول: H 2 O 60:35:8 (V / V / V) والمذيب للتعامل مع الدهون محايدة كلوروفورم الميثانول 1:1 (V / V). استخدام الأيزوبروبانول: الهكسان: H 2 O 55:25:20 (V / V / V) كماالمذيب للدهون حمض (gangliosides). تم حل GSLs معزولة محايدة في الكلوروفورم 200 ميكرولتر المذيبات: 1:1 الميثانول (V / V) وتحميلها على السيليكا جل ميرك طبقة رقيقة اللوني لوحة من Microcaps دروموند. تم تشغيل لوحات في الكلوروفورم مذيب: الميثانول: H 2 O 60:35:8 (V / V / V) والمجففة. كانت تصور من الشحميات السفنغولية السكرية أورسينول-حامض الكبريتيك في 300 ° C.
- يمكن لفصل الدهون ومحايدة من الدهون الحمضية، جزء من الدهون ومحايدة والحمضية من أنيون تبادل اللوني على عمود صغير من Sephadex DEAE A-25 على استعداد [الراتنج DEAE A25 Sephadex عن طريق نقع Sephadex A-25 راتنج مسحوق في الكلوروفورم: الميثانول: H 2 O 30:60:8 (V / V / V) بين عشية وضحاها. نضح طاف حتى يتم كل الراتنج A25 Sephadex ما تبقى. إضافة كلوروفورم العذبة: الميثانول: H 2 O 30:60:8 (ت / ت / ت) لغسل الراتنج. كرر ثلاث مرات لإزالة بقايا سالبة الشحنة من] Sephadex الراتنج A25.
- حل، يصوتن (لمدة لا تزيد عن 10 دقيقة)، و resuspend والدهون من الخطوة 2.1 في الكلوروفورم: الميثانول: H 2 O 30:60:8 (V / V / V) عند الحاجة.
- إعداد صغيرة DEAE Sephadex A25 (CL نموذج) العمود باستخدام الصوف الزجاجي و9 "ماصة باستور. حزمة من الصوف الزجاجي بعناية بحيث مسحوق الراتنج لا يمر عبر العمود. إضافة DEAE Sephadex A25 (CL نموذج) الراتنج إلى" الرقبة "من 9" ماصة باستور دون السماح العمود الجاف. تأكد من أن كنت لا ترى أي الراتنج في شاطف. حلت H 2 O 30:60:8 (V / V / V): العينات الذائبة في الكلوروفورم: الميثانول. الكسر الدهون المحايدة هو تدفق من خلال الكسر.
- أزل الكسر الدهون الحمضية (منضمة إلى الراتنجات) مع 8 مل من خلات الصوديوم في الميثانول. تجفيف كل من الكسور محايدة والحمضية، desalt لهم غسيل الكلى، وتجفيفها بواسطة Speedvac وتحليلها بواسطة HPTLC.
الكسر الحمضية تحتوي gangliosides، والتي يمكن مدال للتفاعل الخطوة 3 مباشرة.الكسر محايدة يحتوي ليس فقط الشحميات السفنغولية السكرية محايدة، ولكن أيضا الدهون الفوسفاتية (فسفاتيديل وسفينغوميالين)، والتي يجب إزالتها عن طريق رد فعل أستلة.
في تجربتنا، وطريقة شريط غسيل الكلى، هو أكثر كفاءة وملاءمة من أنبوب الغسيل الكلوي أو عكس المرحلة اللوني العمود C18.
- الخطوة التالية هي إزالة الدهون الفوسفاتية من الشحميات السفنغولية السكرية محايدة من قبل أستلة ورد فعل peracetylation. تجفيف Sephadex DEAE A-25 من خلال تمريرة الكسر في Speedvac (مع تبريد) لمدة 4 ساعة. بعد عينات جافة، ووضعها مرة أخرى في Speedvac وجافة لمدة ساعة 4. تأكد من أن هذه العينات الجافة تماما، لأن أي المياه المتبقية سوف يمنع رد فعل peracetylation.
- Peracetylate العينات مع 1 مل من البيريدين و 0.5 مل من أنهيدريد الخل في الظلام في درجة حرارة الغرفة 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها. هذه الكمية من أنهيدريد الخليك وبيريدين هو الصحيح لمدة تصلإلى 200 ميكروغرام من الشحميات السفنغولية السكرية. يمكن أن يتم هذا التفاعل عند C ° 37، كما GSLs يكون أفضل الذوبان.
- تجفيف المواد peracetylated من Speedvac لمدة 3 ساعة، مع إضافة 1 مل من التولوين 3X (coevaporation) لضمان تبخر كاملة. إذا كانت العينات لا تزال غير جافة تماما، Speedvac حتى تجف.
- إعداد (سيغما الدريخ) Florisil العمود (30-60 شبكة، 10 × 80 مم) في ماصة باستور مع الصوف الزجاجي، وذلك باستخدام الخرز Florisil. وينبغي الخرز Florisil جفت تماما قبل الاستخدام، من الحضانة في فرن 110 C °. ملء الخرز في ماصة باستور حتى العنق، وتتوازن في 1،2-الهكسان-ثنائي كلورو إيثان 04:01 (ت / ت).
شطف من العمود Florisil سريع جدا. ويمكن أن تقلب السريع للمذيبات تؤدي إلى تجفيف العمود. وبالتالي يجب أن تكون مستعدة جميع مخاليط المذيبات قبل تشغيل العمود لأنه من غير الممكن وقف العمود أثناء شطف.
- تطبيق peracetylated عينة في 1 مل من الهكسان-1،2-ثنائي كلورو إيثان 04:01 (ت / ت)، وغسل العمود مع 6 مل من المذيب نفسه، تليها 10 مل من ثنائي كلور ميثان، 1،2. أزل GSLs peracetylated محايدة مع 6 مل من 1،2-ثنائي كلورو إيثان، الأسيتون 1:1 (V / V). هذه الخطوة يزيل الدهون الفوسفاتية peracetylated من الشحميات السفنغولية السكرية، وذلك لأن الشحميات السفنغولية السكرية peracetylated ربط العمود Florisil، في حين الفوسفورية peracetylated لا.
- تجفيف أجزاء من Speedvac لمدة 2 ساعة وdeacetylate مع 2 مل 0،5 ميثوكسيد الصوديوم M [سيغما الدريخ، 403067] في 2 مل من الميثانول لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تحييد الخليط مع 3 مل من حمض الخليك الميثانولى [حمض الخليك / الميثانول 15/85 ت / ت]، جاف من Speedvac، desalt من غسيل الكلى [ذوب المنتجات المجففة في 3 مل من الماء، وحقن في الشريحة-Lyzer-A راديو كاسيت غسيل الكلى، dialyze ضد الماء لمدة 24 ساعة. تغيير المياه مرتين على الأقل]. تجفيف GSLs مدال (في المحلول المائي) من خلال Speedvac حتى عينات جافة تماما.
3. تعديل الكيميائية (Permethylation) من الشحميات السفنغولية السكرية 13
- إدخال GSLs (1-20 ميكروغرام) إلى أنبوب زجاجي مع غطاء المسمار وبطانة تفلون، وثنائي ميثيل سلفوكسيد إضافة (150 ميكرولتر) دون استخدام الشروط الخاصة التجفيف أو خاملة الجو الغاز.
- إعداد مسحوق هيدروكسيد الصوديوم (40-60 ملغ) من جزيئات هيدروكسيد الصوديوم عن طريق طحن لهم في بمدافع الهاون الكيميائية مع مدقة. تأكد من تخزين المساحيق في بيئة جافة جدا ونكون حذرين للقيام طحن في غطاء محرك السيارة الكيميائية لتجنب تنفس مساحيق.
- إضافة بجوار مسحوق هيدروكسيد الصوديوم إلى محلول العينة مع ملعقة. [يمكن استخدامها أو VWR ميكروليتر 100 معايرة ماصة مرتبطة حقنة من خلال أنابيب المطاط] إضافة يود الميثان (80 ميكرولتر) مع حقنة 100 Halmilton ميكروليتر، ويهز الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- إخماد رد فعل مثيلة مع الماء (2 مل). استخراج المنتجات permethylated 3 مرات من قبلإضافة ثنائي كلورو ميثان (2 مل) [السكرية في مرحلة ثنائي كلورو ميثان، والذي هو أقل المرحلة، لذلك يمكن نقلها إلى المرحلة العليا أنبوب زجاجي جديدة، وثنائي كلورو ميثان المستخرج من جديد مع].
- غسل ثنائي كلورو ميثان مقتطفات مجتمعة مع الماء 3 مرات مل 2 [المرحلة العليا، والذي هو الماء، ومن ثم يمكن التخلص منها]. بعد غسل النهائي، ونقل العينات إلى أنبوب جديد، وتجفيف باستخدام Speedvac.
- ويمكن بعد ذلك أن العينات الذائبة في 100 حتي 200 ميكرولتر من الميثانول لESI-MS التحليل.
4. MALDI-TOF تحليل Gycosphingolipids Permethylated
- أداء MALDI-TOF-MS وMALDI-TOF/TOF-MS/MS التجارب على مطياف الكتلة TOF MALDI-TOF (النظم البيولوجية التطبيقية 4700، فوستر سيتي، كاليفورنيا). إعداد مصفوفة عن طريق خلط 50٪ من حجم 10 ملغ / مل حمض ديهيدروكسيبنزويتش (DHB) في الأسيتونيتريل وحجم 50٪ من حمض trifluoroacetic 0.1٪ (TFA) في الماء.
- يمكن رصدها المصفوفة DHB على targe MALDIر (1 ميكرولتر)، تليها ميكرولتر 1 (تحتوي على 100 نانوغرام GSLs) بقعة من العينة المذاب في الميثانول. تطبيق ببطء واتركه حتى يجف قبل التحليل.
5. أيون تحليل MS فخ الشحميات السفنغولية السكرية Permethylated
- تنفيذ مطياف الكتلة مطياف على أيون الخطي الشامل فخ (LTQ، ThermoScientific، سان خوسيه، كاليفورنيا) باستخدام مصدر nanoelectrospray، 0.30 معدل التدفق ميكرولتر / دقيقة في درجة حرارة 230 درجة مئوية الشعرية في وضع إيجابي مع أيون الطاقة الاصطدام 30-50٪. تعيين الطاقات الاصطدام لترك فرة الحد الأدنى المتبقي من أيون السلائف. كما كشف جميع أيونات الصوديوم adducts.
- تحديد iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) في خليط من Gb3 إسوي الضغط (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) والمعايير iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) بمقارنة أنماط مختلفة من أيونات MS المنتج 4 من أيون الجزيئية sodiated عبر جزء غليكان م / ض 667 و ديساكهارايد في مبنى الركاب رقم 1 - إيني أيون م / ض 445 (أيX → → 667 445 →، X يعني أيون الجزيئية في الكشف عن MS 1) من الذهب الخالص permethylated معايير (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) iGb3 عبر ESI-LIT-MS مع تلك Gb3 permethylated (Galα3Galβ4Glcβ1Cer).
Representative Results
ويرد مثال على تحليل MS MALDI من الشحميات السفنغولية السكرية من سرطان الدم خلية فأر RBL الخط (نوع المستضد خلية تقديم المستضدات الذي يطرح glycosphingolipid إلى خلايا NKT) في الشكل 3. يمكن تعيين الأيونات إلى الهياكل glycosphingolipid محددة (الشكل 3A). في الخلايا RBL يعامل من قبل NB-DGJ 16، الدواء الذي يمنع تركيب glycosphingolipid، لوحظ انخفاض كبير في جميع الشحميات السفنغولية السكرية (الشكل 3B). لا يمكن تمييزها أيزومرات الهيكلية. قدرة MS / MS من النظم البيولوجية التطبيقية 4700 يسمح تجزئة MS1 الأيونات إلى شظايا 2 مللي ثانية، مما يسمح ليتم إنشاء المعلومات الهيكلية محدودة. ومع ذلك، غالبا ما يكون التحليل MS2 غير كافية لتميز أيزومرات قليل السكاريد.
تحليل MS-ايون فخ الشحميات السفنغولية السكرية تمكن الدراسة من أيزومرات، مثل iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) وGb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) التي قد توجد مثل أيونات trihexosylceramide الكشف عن الشكل 3A في. للكشف عن مثل هذه الايزومرات، تم تحليل مستوى iGb3 وGb3 من جولات متعددة من تجزئة، حتى تم العثور على الاختلافات (الشكل 4A و 4B). في المثال المقدمة هنا يمكن (الشكل 5C) يجوز التمييز iGb3 وGb3 من خلال مقارنة لiGb3 القياسية وGb3.
الشكل 1. تم استخراج مخطط تدفق الإجراء استخراج glycosphingolipid، والتعديل الكيميائي للالشحميات السفنغولية السكرية (permethylation). الشحميات السفنغولية السكرية من الخلايا عن طريق المذيبات العضوية. لإزالة غير الشحميات السفنغولية السكرية، الدهون يمكن أن تكون peracetylated وdeacetylated. الثانية، ومعدل كيميائيا الشحميات السفنغولية السكرية من رد فعل permethylation، مما يحسن حساسية ونوعية detectio MSن. وأخيرا، تم تحديد ملامح glycosphingolipid باستخدام MALDI-TOF الطيف الكتلي وقياس الطيف الكتلي ايون الفخ.
الشكل 2. Glycosphingolipid الكمي من أورسينول أسلوب حامض الكبريتيك: التحديد الكمي لالشحميات السفنغولية السكرية باستخدام 0.2٪ في 50٪ أورسينول حل حامض الكبريتيك ومنحنى القياسية الجلوكوز.
الشكل 3. Glycosphingolipidomics من خلايا سرطان الدم الفئران A. الشامل MALDI الممثل الطيف؛ كل أيون يمثل بنية محددة glycosphingolipid، لا يمكن تمييزها أيزومرات الهيكلي B. NB-DGJ، وهو دواء الذي يمنع تركيب glycosphingolipid، ق.يقلل ignificantly جميع الشحميات السفنغولية السكرية التي تنتج في الخلايا RBL.
الشكل 4. جنبا إلى جنب الطيف الكتلي الايزومرات من الشحميات السفنغولية السكرية. مسارات التحلل A. المميزة لقياس الطيف إيجابية أيون وضع كتلة فخ GSLs permethylated 3 غيغابايت وحدات خفض الانبعاثات المعتمدة مجلس الحبوب العراقي حدات خفض الانبعاثات المعتمدة 3. بشكل واضح يفصل جيجابايت 3 و 3 من مجلس الحبوب العراقي أنماط تفككها. وترد الاختلافات في الربط في المنتج MS الأيونات 4 يتفق مع السلائف إسوي الضغط 445 م / ض. B. ويمكن قياس النتائج تظهر ممثل iGB3 في خليط من ايزومرات iGb3/Gb3. تشير نجوم التشخيص لأيونات iGb3 فقط. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 5. ايون فخ MS يسمح تحليل الايزومرات من الشحميات السفنغولية السكرية. A. القياسية iGb3 والفرق Gb3 عرض الملف الشخصي للتجزئة بعد 4 جولات من تجزئة في مطياف الكتلة ايون فخ LTQ. B. المميزة MS 4 الملف من الأيونات أو المستمدة من iGb3 Gb3 C.. Trihexosyleramides هي مزيج من iGb3 وأيزومرات Gb3 التي يمكن تحديدها من قبل MS ايون فخ الأسلوب (الشكل من قبل تشو دابنغ). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Discussion
وglycome، وهو مصطلح ابتدعه تشبيها له الجينوم وبروتيوم، ويشير إلى جميع الهياكل ساكاريد للكائن الحي. سوف نفهم تماما لمهام متعددة من ارتباط بالغليكوزيل تتطلب اتباع نهج متكامل بما في ذلك الدراسات الفنية والهيكلية غليكوميكس. معقدة على حد سواء وفقا لطبيعة غير مدفوعة قالب من الحيوي غليكان، وتعقد الناجمة عن ذلك وتنوع الهياكل غليكان، وإشراك المتكرر للهيكل الجزء اللاسكري في تحوير التفاعلات يجند مستقبلات غليكان على المستوى الجزيئي، وأهمية وظيفية وفرة من يغاندس منخفضة.
ومن المسلم به عموما أن قياس الطيف الكتلي (MS) هو وسيلة لا غنى عنها للدراسات غليكوميكس الهيكلية، وخاصة بالنسبة للتحديد وتوصيف يغاندس فرة منخفضة. لمراقبة glycans أو غليكوكونجوغاتيس عن الأنواع الجزيئية، ونحن غالبا ما تستخدم كفاءة عالية، انخفاض الطاقة التأين الأسلوب، ودعا التأين electrospray (ESI). لمزيد من ديت ailed توصيف هيكل غليكان، من الضروري لتحديد الأنواع الجزيئية الفردية وكسر glycans إلى أجزاء أصغر. ويتم ذلك عادة عن طريق الاصطدام الناجم عن التفكك، الذي ينطوي على تفعيل glycans من خلال اصطدام مع جزيئات غاز خامل. وزيادة الطاقة يدفع الكسر السندات، والتحليل المنهجي لالشظايا الناجمة يوفر معلومات حول التركيب الجزيئي للغليكان. في كثير من الأحيان، يمكن إنشاء "التوقيع" شظايا ويمكن تشخيصها عن السمات الخاصة الهيكلية غليكان. جنبا إلى جنب مع الكتلة الجزيئية، يمكن لهذه الشظايا تكون أحيانا كافية لتحديد glycans، ولكن في الماضي كان يتطلب المزيد من المعلومات لوصف الكامل لهم، خاصة إذا كان الهيكل هو الرواية. هذه الطرق تشمل تحليل السكر تكوين والغاز مطياف الكتلة اللوني تحليل الأسيتات alditol ميثليته جزئيا للتحليل الربط، ومحددة الهضم غليكوزيداز 17.
"jove_content"> كما تبين خلال العقد الماضي 18-19، جولات متعددة من تجزئة منخفضة الطاقة، والتي يمكن تنفيذها بفعالية في مطياف الكتلة ايون فخ (IT-MS)، ويحسن إلى حد كبير من المعلومات من تحليل العائد الشامل غليكان الطيفية . مع أربعة أو خمس جولات من تجزئة (والذي لا يمكن القيام به مع الصكوك MS أخرى)، فمن الممكن أن نميز glycans ايزوميريا التي تحتوي على مكونات السكر نفس مرتبة في الروابط السكر مختلفة، حتى عندما كانت هذه موجودة معا في خليط من المكونات مع نفس الكتلة الجزيئية (أيسوبار). لهذا التحليل، فإن glycans derivatized، لتحل محل جميع الفئات الهيدروكسيل الحرة مع مجموعات الميثيل باستخدام permethylation. بينما الاحالة الهيكلية للglycans هو ممكن دون permethylation، ويزيد من حساسية permethylation 17.
وتضافرت Levery تشو، كل من المزايا المحتملة للIT-MS منهجية، بما في ذلك الكشف عن stru ايزوميرياctures باستخدام أيونات التوقيع التشخيص، يمكن ملاحظتها فقط في 4 و MS MS الأطياف 5، لتحديد الكميات وحساسة للغاية من الشحميات السفنغولية السكرية الموجودة في شكل مخاليط متعددة إسوي الضغط 7-9. من الناحية النظرية، ونحن قد تكون قادرة على تحديد هيكل كل شحمي سكري القائمة، في انتظار توفر السكرية القياسية، والتي يمكن تصنيعه كيميائيا.
الخطوات الحاسمة لهذا التحليل هي معدل الاسترداد من GSLs من العينات البيولوجية. يمكن استرداد عادة 80 ميكروغرام من GSL من 100 مليون الخلايا السرطانية مثل RBL. لتوليد الأيونات الجزيئية كافية لجولات متعددة من تجزئة في الطيف الشامل ايون فخ، يطلب من لا يقل عن 10 ميكروجرام من GSLs الورم. سوف العائد المنخفض من خلال تنقية GSLs يؤدي إلى وفرة من الأيونات المنخفضة، التي لا يمكن أن تخضع لمزيد من التشرذم. نجاح التحليل يتوقف على مقدار GSLs التي يتم استردادها. اضرب عادة النهائي،يجب entration من GSLs permethylated يصل إلى 1 ملغ / مل، يذوب في الميثانول، قبل أن يتم تحليلها على مصدر نانو electrospray. الحد الأقصى لتحليل دقيق ن MS يعتمد على وفرة من أيون محددة في الملف الشخصي 1 MS. مطلوب نموذجية فرة ه أيون 7 لتحليل دقيق 5 مللي. يمكن أن يكون سبب انخفاض العائد من خلال تنقية GSLs من فقدان GSLs أثناء الخطوة peracetylation (الذي يزيل الدهون الفوسفاتية)، عندما يجب أن تكون ملزمة للGSLs لكل الأسيتيل إلى الراتنج Florisil العمود اللوني، وغسلها، ومزال في وقت لاحق. لضمان الربط لكل من الأسيتيل GSLs إلى هلام السيليكا، ينبغي إعادة تحميل عينات مرتين إلى العمود اللوني بعد تتدفق من خلال.
Disclosures
DZ هو مستشار لBIOTEX، هيوستن، TX، والمخترع المشاركة في براءات الاختراع المتعلقة بالتكنولوجيات المذكورة في هذه المقالة، التي أصدرت أو في التطبيق.
Acknowledgments
ويدعم DZ من مركز اندرسون للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة منح AI079232. ويدعم مركز إم دي أندرسون للسرطان في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح CA16672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 Dichlor–thane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12x75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
- Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide. J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).
- Zhou, D.
- Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).
- Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy. Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).
- Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).
- Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).
- Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).
- Hakomori, S. I. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).
- Ciucanu, I., Kerek, F. Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis. Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Levery, S. B., Hakomori, S. Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring. Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).
- Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes. J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).
- Ciucanu, I., Costello, C. E. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).
- Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library. Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).
