Summary
軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。
Abstract
機械的傷害や変形性関節症などの疾患による劣化によって破損時の関節軟骨は、限られた修復能力に苦しんでいる。この欠点を改善するために、いくつかの医療介入が開発されている。そのような方法の一つは、組織工学軟骨損傷した領域を再浮上することですが、設計された組織は、典型的には、長期的な存続可能性に疑問を投げかけ、ネイティブ軟骨の生化学的特性と耐久性を欠いている。これは、注入材料を保護するために、周囲の組織に頼らず、小焦点欠陥の修理に軟骨組織工学の応用を制限します。開発組織の特性を改善するために、機械的な刺激は、軟骨細胞外マトリックスの合成と同様に設計された組織の結果として得られる機械的特性を向上させるために利用される一般的な手法です。機械的な刺激は、組織への力は、生体内で経験したものと類似の構築に適用されます。この機械的な環境は、部分的には、天然組織1,2の開発と保守を調節していることを前提としている。軟骨組織工学における機械的刺激の最も一般的に適用されたフォームは1Hz 1,3の周波数で約5〜20％の生理的な歪みにおける動的圧縮です。いくつかの研究では、動的圧縮の影響を調査して、それが最終的に開発された4月8日組織の機能的特性に影響を与える、軟骨細胞代謝と生合成にプラスの効果を有することが示されています。本稿では、機械的に、動的圧縮下で軟骨細胞 - アガロースハイドロゲル構造体を刺激し、生化学的および放射性同位体のアッセイを通じて生合成の変化を分析するための方法を示す。また、この方法は容易に機械的刺激の結果として細胞応答におけるどんな潜在的に誘発された変化を評価するために変更することができます。
Protocol
1。プライマリ関節軟骨細胞の単離
動物の関節の関節面から収穫10月15日全層軟骨スライス（ローカルabbatoirから得られた骨格成熟した牛の中手·指関節など ）。
- 37℃で2時間、ハムF-12（w / v）の中の0.5％プロテアーゼ20mlの100mmペトリ皿とインキュベート℃の場所軟骨スライスハムF-12培地で3回リンスした後、0.15％コラゲナーゼ20mlで37℃で一晩インキュベートハムF-12培地（℃）
- きれいな皿に200メッシュのスクリーンフィルタを介して細胞懸濁液をろ過する。ハムF-12 5mlでフィルターを洗って皿に追加します。 50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。ハムF-12 10mlのペトリ皿を洗い、コニカルチューブに追加します。
- 室温で6から8分間600から800 rcfでチューブを遠心分離します。
- 目を動かさないように確保し、上清を吸引し電子細胞ペレットとハムF-12培地40mlに再懸濁する。
- 6月8日分の600から800 rcfでチューブを遠心分離します。
- 合計3回の手順1.4と1.5を2回以上繰り返します。前に三回目の遠心分離に、攪拌を介してペレットを再懸濁し、細胞をカウントするための500μlのアリコートを得る。
- 血球計および倒立光学顕微鏡とトリパンブルー排除法9を使用して生細胞数を数えます。
- 上清を吸引除去し、所望の播種密度（カプセル化後の10×10 6細胞/ mlの最終濃度のために、例えば 20×10 6細胞/ ml）を倍増させるハムF-12培地の体積でペレットを再懸濁する。
2。軟骨細胞 - アガロースハイドロゲルのカプセル
- ヒート0.8グラムオートクレーブ滅菌タイプVIIアガロース溶解°Cまで、120に設定したホットプレート上に滅菌1X PBS（pH7.4）を20mlのインチ一度溶解し、℃より高い温度として60に熱を下げるウィルlは、細胞の生存に影響を与えます。
- 50 mlコニカルチューブでは、徹底的にアガロース（最終2％アガロースヒドロゲルのための例えば、4％アガロース懸濁液）の二重所望の濃度で細胞懸濁液の等量を混ぜる。彼らは細胞の生存に影響を与え、疲労寿命を構築することができるような大きな気泡の生成を避ける。
- 大きな気泡の生成を回避しながら、直径60mmのペトリ皿に注意深くアリコート軟骨細胞 - アガロース混合物10mlを、。
- ゲル化するまで室温で30分間放置する。
- 必要に応じて4ミリメートル生検パンチを使用して（通常は20から30）は、多くの軟骨アガロースハイドロゲルをサンプルとして取得します。
- マイクロメーターを用いて代表的なサンプルの物理的な大きさ（直径と高さ）を測定し、記録します。構造物の高さが約5 mmでなければなりません、試料高さの分散が2％以上であった領域から得られたすべてのサンプルを破棄します。
- 新鮮な60ミリメートルペトリ皿とサプリメントにサンプルを転送完全培地10ミリリットル（20mMのHEPES、100μg/ mlのアスコルビン酸、および2倍の抗生物質/抗真菌剤とハムF-12培地中で、例えば 20％のウシ胎児血清）を持つ。
3。軟骨アガロースゲルの機械的刺激と放射性
- 圧縮リグの金属部品をオートクレーブ。 70％エタノール（一晩）と紫外線（少なくとも15分間）でプラスチック部品を使用して滅菌する。
- 24穴培養プレートのウェル内に、転倒鉗子を使用して、場所12滅菌したプラスチック製リテーニングリング（コンストラクト径より大きい内径を持つ）（ただし、n = 6、検体およびコントロール）から構造物を維持する。
- ピンセットを用いて、慎重に止め輪の各1を確保し、ペトリ皿から24ウェルプレートに軟骨細胞 - アガロースヒドロゲルを転送します。
- 完全培地を400μl（20mMのHEPESとハムF-12培地中、例えば 20％のFBS、100μg/ mlのアスコルビン酸を移し、各サンプルウェルに）抗生物質/抗真菌剤の2倍。
- 滅菌した圧縮リグ（ 図1）を構築し、止めネジでプラテンを固定します。 24ウェル培養プレートに圧縮リグを取り付けます。
- プラテンハイドロゲルコンタクト（ゼロひずみ状態）を確立するためにセットスクリューを解放し、再固定します。
- マッハ1微小機械試験システムに組み立て圧縮リグをロードします。セットネジで位置決めピンとロックを介して垂直ステージへの安全なリグ。間隔治具を外します。
- 周波数（ 例えば 1 Hz）と持続時間またはサイクル数（60分などの時間間隔まで）、所望の振幅（サンプルの元の高さに基づいて、 例えば、10％のひずみ振幅）で動的圧縮荷重を適用します。
- 機械的な刺激が完了すると、間隔治具を交換する位置決めピン止めねじを緩め、マッハ1マイクロメカニカル試験システムから圧縮リグや培養プレートを取り外します。 放射性標識細胞のヒドロゲル所望の同位体（軟骨細胞特有のコラーゲン合成および[35 S] -硫黄プロテオグリカン合成のためのもの [3 H] -プロリンタンパク質標識）の5μCiのあるメディアを補完することにより構造物。
- 37℃で24時間、放射性標識された構造物をインキュベート℃、5％CO 2で10。
- 放射性標識されたハイドロゲルの構築物を収穫し、法人格のない任意の同位体を除去するために1X PBS（pH7.4）中で3回すすいでください。パパイン（20 mM酢酸アンモニウム、40μg/ mlの、65℃で1mMのethyldiaminetetraacetic酸および2mMジチオスレイトール℃で72時間の場合）を使用してダイジェストのサンプル。
- ピコグリーン色素アッセイ11とで設立された同位体の活動、12,13直後パパイン消化を数え、β-液体シンチレーションによって、DNA含量に正規化を用いてDNAコンテンツに関するアッセイダイジェスト。
注：放射性物質の購入·処分（廃棄物の同位体とアイテム接触放射性物質になってきたかもしれない）（および/または政府）の政策や放射性物質の安全な取り扱いと廃棄のための手順、関連制度に従わなければなりません。
4。代表的な結果
ウシ関節軟骨細胞-アガロースハイドロゲル構造体（10×10 6細胞/ mlカプセル化された細胞を2％アガロース）を機械的に20から60分（または1200〜3,600サイクルの1 Hzの周波数で10％の圧縮歪の振幅で刺激した）及び放射性同位元素の取り込みによってDNA含量および細胞外マトリックス合成についてアッセイした。 DNAや細胞外マトリックスの合成が用量依存的に影響を受けました。刺激の60分は、（ 図2）は効果を示さなかったのに対し、DNA量は、刺激の20〜30分と有意（p <0.01）の結果として重要な35％の減少を示した。軟骨特異的コラーゲンとプロテオグリカン合成（[3 H] -プロリンとによって決定されるそれぞれ[35 S] -硫黄混入は）観察可能な効果を示さない刺激の60分（ 図3）と、刺激の20〜30分と有意（p <0.01）に対応して約60％の大幅な増加を示した。
。軟骨アガロースコンストラクトを刺 激するための特注の動的圧縮リグの図1の回路図左 ：組み立て済みのリグ右 ：個々の構成要素を示す分解図。
図2：軟骨細胞-アガロースのDNA含量の変化は、機械的に20から60分（平均±SEM、N = 6/groupを意味する）は1Hzで10％の圧縮ひずみ振幅下で刺激ヒドロゲル。
図3：軟骨細胞-アガロースの細胞外マトリックス合成の変化は（コラーゲンおよびプロテオグリカン）機械的に20から60分（平均±SEM、N = 6/groupを意味する）は1Hzで10％の圧縮ひずみ振幅下で刺激ヒドロゲル。
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Discussion
細胞播種アガロースヒドロゲルへの制御された機械的刺激を加えるための記載された方法は、軟骨代謝に及ぼす動的圧縮力の影響への直接調査を行うことが可能。保持リングと一緒にカスタム·テスト·リグを使用することによって、サンプルの転倒の潜在的な問題を回避するための構成体の横方向の制約を提供した。セットのクルーによって保護死ん加重ローディングプラテンを使用することによって、サンプルの高さの潜在的な違いにもかかわらず、構造物との直接の接触を確実にします。刺激後の細胞の生合成を測定するために放射性同位元素標識法は、動的機械刺激の複数の用途に利用される単一のテスト·リグを考慮して、汚染の可能性を低減します。この方法は簡単に別の機械的負荷モード（ 例えばせん断1,4、緊張1,2）の効果を調べるために、または特定のメカノトランスダクション経路が責任を解明するために適合させることができます。
ove_content ">代表的な結果は、約35％の細胞死少量のコンストラクト細胞性15から17に影響を及ぼしていない機械的な刺激の長いアプリケーションで、動的な刺激の適用により発生する可能性があることを示した細胞外マトリックスの高分子の合成によって決定放射性同位体の取り込みは、動的圧縮までの期間依存性応答を示した20から30分の期間のための動的圧縮荷重のアプリケーションが課され、機械的な刺激に感度抑圧効果を引き出すために現れる長い期間で最大限の同化反応が生じた。セルラー脱感作を機械的にローディングは以前1,2,5,13指摘されていますが、この現象の時間依存性の性質の特徴付けに少し調査があった。この情報は、細胞外マトリックスの蓄積を最大化するために最適な刺激条件を決定するために使用することができ未定義を構築rは繰り返されるか、または長期的、機械的な刺激のアプリケーション。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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