Summary
Una tecnica chiamata
Abstract
Pareti delle cellule vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenee che svolgono un ruolo importante nella fisiologia e sviluppo di impianti e di fornire le materie prime per le società umane (ad esempio, industria del legno, della carta, tessile e biocarburanti) 1,2. Tuttavia, la comprensione la biosintesi e la funzione di tali componenti rimane difficile.
Glicani parete cellulare sono chimicamente e conformazione diversa a causa della complessità dei loro elementi costitutivi, i residui di glicosil. Questi legami modulo in più posizioni e differiscono in struttura ad anello, configurazione isomerica anomerico, e in aggiunta, sono sostituiti con un array di non-zucchero residui. Glicano composizione varia in cella e / o tipi di tessuto o anche sottodomini di una singola cella parete 3. Inoltre, la composizione è anche modificato durante lo sviluppo 1, o in risposta a stimoli ambientali 4.
In excesso di 2.000 geni hanno pareti cellulari vegetali sono matrici complesse di glicani eterogenei stati previsti di essere coinvolti nella biosintesi della parete cellulare glicano e la modifica in Arabidopsis 5. Tuttavia, relativamente pochi dei geni biosintetici sono stati caratterizzati funzionalmente 4,5. Reverse approcci genetica sono difficili perché i geni sono spesso differenzialmente espressi, spesso a livelli bassi, tra i tipi di cellule 6. Inoltre, gli studi mutanti sono spesso ostacolati da ridondanza genica o meccanismi di compensazione per garantire un'adeguata funzione della parete cellulare è mantenuta 7. Così nuovi approcci sono necessari per caratterizzare rapidamente la vasta gamma di strutture glycan e per facilitare approcci di genomica funzionale per la biosintesi della parete cellulare comprensione e la modifica.
Gli anticorpi monoclonali (mAb) 8,9 sono emersi come un importante strumento per definire l'assetto glicano e la distribuzione negli impianti. Questi riconoscono distepitopi inct presenti all'interno di classi principali di glicani delle cellule delle piante da parete, comprese le pectine, xyloglucans, xylans, mannani, glucani e arabinogalactans. Recentemente il loro uso è stato esteso a grandi esperimenti di screening per determinare la quantità relativa di glicani in una vasta gamma di tipi di tessuto vegetale e contemporaneamente 9,10,11.
Qui vi presentiamo un microarray basato su metodo di screening glicano chiamato completa Microarray Profiling Polymer (CoMPP) (Figure 1 e 2) 10,11 che consente più campioni (100 sec) per essere schermati con una piattaforma microarray miniaturizzato con il reagente ridotta e volumi di campione. I segnali piatte su microarray può essere formalmente quantificato per dare semi-quantitativi i dati relativi verificarsi glicano epitopo. Questo approccio è adatto per tenere traccia delle modifiche glycan in sistemi biologici complessi 12 e fornendo una visione globale della composizione della parete cellulare in particolare quando prima conoscenza of questo non è disponibile.
Protocol
1. Raccolta e preparazione dei tessuti
- Raccogliere 100 mg di peso fresco tessuti vegetali (almeno 10 mg di peso secco) almeno in triplicato per ogni tessuto di interesse. I passaggi seguenti descrivono la preparazione di materiale della parete cellulare nei tessuti vegetali. Nel caso di tessuti di stoccaggio, un-wanted amido viene enzimaticamente rimosso prima di procedere con l'estrazione di polimeri della parete cellulare come descritto in precedenza 13.
- Omogeneizzare i campioni ad una polvere fine con azoto liquido utilizzando un Qiagen TissueLyser II, con 24 set di tubi adattatori e 3 millimetri perline carburo di tungsteno (30 Hz, 2 x 30 sec). In alternativa, se solo pochi campioni vengono elaborati, un mortaio e pestello viene utilizzato.
- Trasferire gli omogenati in 10 ml provette coniche di plastica.
- Preparare parete materiale cellulare lavando i omogenati in 10 ml di 80% v / v di etanolo a temperatura ambiente e vortexando energicamente per 2 minuti.
- Centrifugare i campioni a 3.500 xg ed eliminare il surnatante. Ripetere l'etanolo 70% lava almeno tre volte o finché il supernatante è chiara, particolarmente per tessuti contenenti clorofilla.
- Eseguire un lavaggio finale con il 100% di acetone e lasciare le palline contenenti residui di alcool insolubili (AIR) per asciugare durante la notte.
- Sieve i campioni AIR con a mm 0,4 2 maglie per ottenere una polvere fine, omogenea e di togliere più grande, mal particelle di terra che a volte rimangono nel omogeneizzato.
- Pesare 10 mg di campione di aria in microprovette, ognuna contenente 3 mm perle di vetro per facilitare la miscelazione dei campioni.
2. Estrazione di glicani parete cellulare
- Pectine, e polimeri associati pectine sono estratti dai campioni aggiungendo 500 pl di 50 mM CDTA (pH 7,5) per ogni campione.
- Brevemente vortex le provette per assicurare il solvente è in contatto con il campione e quindi miscelare con il TissueLyser per 3 ore a 8 Hz.
- Centrifugare i campioni a 12.000 xg, accuratamente rTogliete il surnatante e conservare a 4 ° C.
- Lavare pellet in 1 ml di acqua deionizzata per diluire e rimuovere qualsiasi residuo di solvente, vortex e centrifugare a 13.000 x g. Ripetere questo passo senza disturbare il pellet e rimuovere il liquido da tutte le provette prima di procedere alla fase successiva.
- Reticolanti glicani sono sequenzialmente estratte dal rimanente parete cellulare pellet con 500 ml di NaOH 4M con 0,1% w / v NaBH4, utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4 per l'estrazione CDTA. NaBH 4 viene aggiunto per ridurre l'aldeide (o cheto) gruppo alla fine ridurre i polisaccaridi ad un alcool impedendo così di base di polisaccaridi peeling.
- Dopo centrifugazione, supernatanti vengono nuovamente rimosso, conservato a 4 ° C, e il pellet lavato due volte in acqua deionizzata prima di procedere alla prossima estrazione.
- Come passaggio facoltativo, polimeri residui, quali cellulosa sono estratte con 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane con 0,78 M CdO), utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2,1-2,4. In alternativa, assoluta contenuto cellulosico in pellet rimanenti può essere determinato mediante saggi acetico / nitrico (vedi la discussione).
3. Stampa Microarrays
- Surnatanti centrifuga contenente estratto polimeri della parete cellulare a 13.000 xg per rimuovere particelle.
- Carico 50 pl di ciascun campione in un polipropilene 384 ben micropiastra utilizzando un pre-progettati layout personalizzato in cui sono disposti i campioni secondo il tipo di tessuto e del tipo di estrazione.
- Diluire il campione della parete cellulare di polimero in una serie di diluizione × 0, 5 e 25 in serie con acqua deionizzata.
- Parametri come altezza perno, la raccolta e il tempo di permanenza, e fasi di lavaggio sono impostati sul software controllo del micro-distributore.
- L'umidità della camera di stampa è controllata al 60% per evitare l'evaporazione del campione.
- Il lavoro di stampa viene avviato utilizzando LabNEXT Software e un programma che corrisponde al layout microarray.
- Il robot utilizza sugli canali capillari per stampare soluzioni del campione nella piastra 20 x 20 centimetri membrana di nitrocellulosa che è attaccata ad una piastra piana nella macchina. Ogni punto della matrice contiene 15 nl di soluzione ed è stampato in triplice copia.
- Microarrays identiche sono stampate una accanto all'altra sulla membrana e tagliate in singoli array dopo il processo di stampa.
- In ogni esperimento le matrici possono essere modificati per ospitare campioni più o meno, diluizioni o replicati.
4. Probing di Microarrays glicano
- Dopo la stampa, bloccare i singoli microarray in 5% w / v latte scremato in polvere sciolto in tampone fosfato (MPBS) a temperatura ambiente per 2 ore per ridurre il legame non specifico.
- Microarrays sonda con anticorpi monoclonali specifici per parete cellulare glicano epitopi per 2 ore in MPBS. La maggioranza dei antib monoclonaleodies contro glicani della parete cellulare sono disponibili in commercio da tre società; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Servizi Carbosource ( www.carbosource.net ) e PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- Comprendono un controllo negativo, un microarray incubate con MPBS e non solo anticorpo primario.
- Lavare le microarrays 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico.
- Misurare i microarrays con anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (HRP) in MPBS per 2 hr. La maggior parte di anticorpi monoclonali contro glicani della parete cellulare richiede anti-mouse o anti-topo anticorpi secondari.
- Ripetere le fasi di lavaggio per 3 volte con PBS per 5 minuti per rimuovere il legame non specifico.
- Sviluppare i microarray utilizzando cromogenico (3,3-diamminobenzidina) o chemiluminecent (luminol) substrati.
5. Quantificazione
- Dopo lo sviluppo, la scansione dei microarray individuali usando ad alta risoluzione (1.200 dpi) scanner desktop e salvare le immagini come negativi, file a 16 bit TIFF (Figura 3).
- Calcola l'intensità integrale di ogni macchia con Xplore Software Image Processing (LabNEXT) dotato di uno strumento di griglia automatico. L'intensità macchia integrale deriva dalla somma dei pixel nell'area circostante ogni punto della griglia.
- I dati della griglia per ogni microarray viene esportato come un file txt e può essere importato manualmente in un foglio di calcolo Excel per l'analisi. Uno strumento online ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) è stato sviluppato per tradurre automaticamente ed elaborare i dati di singoli file txt.
- L'intensità media integrale è posto in tutta la stampa si replica e le diluizioni per ottenere una 'macchia mediaintensità 'valore per ciascun campione (Figura 2). In alternativa, i segnali corrispondenti posto ad un solo valore di diluizione sull'array vengono utilizzati per quantificare la relativa abbondanza epitopo glicano per ogni campione.
- Le intensità relative dei posti medi tra diversi campioni sono presentati come una mappa termica (Figura 4) utilizzando la formattazione condizionale in strumenti heatmapper excel o online ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). I dati per ciascun tipo di anticorpo è corretta a 100 e un valore del 5% è imposto per rimuovere segnale di fondo e falsi positivi.
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Representative Results
La relativa abbondanza di glicani in sei tipi di tessuto (filamenti antera, polline, ovaie, petali, sepali e lo stigma) di Nicotiana alata fiori è stata determinata utilizzando CoMPP. La Figura 3A mostra un microarray rappresentante che è stato sondato con mAb specifico per JIM5 parzialmente (basso) methylesterified homogalacturonan (HG), un epitopo che si verifica su polisaccaridi pectiche 14. Il JIM5 epitopo viene rilevato in estratti CDTA di tutti i tessuti floreali è tuttavia più alta e più bassa nel polline nel tessuto dello stimma (Figura 3A e 4A). È interessante notare che l'epitopo JIM5 è rilevata anche negli estratti di polline di NaOH, ma non in altri tessuti (Figura 3A).
Informazioni quantitative sulla presenza di un glicano di interesse è ottenuto tramite una serie di polisaccaridi purificati come standard interni sul microarray (Figura 3B). Posto intensità integrale degli estratti di t diversi questioni sondato con mAb JIM5 corrisponde ai segnali loco derivati da una diluizione seriale di homogalacturonan (25% di grado di esterificazione di metile, DE). Nel tessuto ovarico, circa 157 ug di homogalacturonan contenente l'epitopo JIM5 era presente in ciascun campione, che rappresentano circa il 1,5% (in peso) dei residui totali parete cellulare (Figura 3C). Considerando che 625 mcg homogalacturonan contenente il JIM5 epitopo era presente nel tessuto polline, pari a circa il 6,25% (in peso) del residuo totale parete cellulare.
L'abbondanza relativa di 15 epitopi glycan sono riassunti come heatmap in Figura 4 in cui l'intensità di barre di colore è proporzionale all'intensità adjusted punto medio per ciascun campione. Una rappresentazione grafica di questi dati è anche illustrato nella figura 5 e permette di interpretare rapidamente differenze nella comparsa glicano epitopo tra i diversi tessuti floreali.
ONTENUTO "> I nostri risultati indicano che i singoli epitopi glicani sono unicamente distribuiti tra N. alata tessuti floreali. Ad esempio, l'epitopo LM13 (linearizzato (1-5)-α-L-arabinan 15) è più abbondante in filamenti antera e tessuti sepal rispetto ad altri tessuti (Figura 5D). Questo modello è in netto contrasto con quella più corta catena (1-5)-α-L-arabinan epitopi preferenzialmente rilevato da mAb LM6 (Figura 5E) 15. reticolazione glicani anche distinta modelli di occorrenza in N. fiori Alata. dell'epitopo LM10 (bassa sostituzione (1-4)-β-D-xilano) è abbondante nel tessuto stigma rispetto ad altri tessuti, ma è assente dal tessuto ovarico (Figura 5G). LM15 epitopi xyloglycan sono più alti in petali e filamenti antera rispetto ad altri tessuti (Figura 5H), mentre sono più alti in heteromannans filamenti antera (Figura 5J).Figura 1. Un diagramma di flusso semplificato che rappresenta i cinque passaggi chiave del Comprehensive Profiling Microarray Polymer (CoMPP).
Figura 2. Un'illustrazione dei passaggi chiave del Comprehensive Profiling Microarray Polymer (CoMPP). (A) tessuti vegetali vengono raccolti come tre repliche, omogeneizzato e lavato in 70% EtOH e acetone per rendere insolubili residui di alcool (AIR). (B) glicani parete cellulare sono in sequenza estratti da campioni di aria con 50 mM CDTA e 4 M di NaOH. (C) Estratte glicani parete cellulare vengono stampati su nitrocellulosa usando un robot microarray. Ogni campione è rappresentato in tre concentrazioni e come una serie di quattro replica stampates. (D) Gli array stampati sono sondati individualmente con anticorpi monoclonali diretti al cellulare glicani parete epitopi. (E) I segnali in loco vengono quantificati utilizzando microarray software di imaging, esportati come file txt e relativi valori di intensità media spot vengono automaticamente calcolate utilizzando una linea di elaborazione dati utensile.
Figura 3. Profili di glicani Nicotiana alata tessuti floreali. (A) Un microarray rappresentante sondato con anticorpo monoclonale (mAb) JIM5 specifico per homogalacturonan (in parte, methylesterification basso) è indicato come un negativo, a 16 bit file TIFF. (B) La quantità di polisaccaride contenente un epitopo glicano di interesse può essere quantificata mediante la stampa di una serie di norme polisaccaridi. (C) l'intensità pronti integrale del campione di interesse sondato da mAbJIM5 viene calcolato e abbinato ad una curva standard per valutare la quantità (pg) del polisaccaride contenente epitopo presente nel campione.
Figura 4. Profili di glicani Nicotiana alata tessuti floreali rappresentata come una mappa termica. L'intensità del colore è proporzionale al valore medio relativo identità spot (bar scala). Abbondanza relativa di 15 epitopi glycan rilevati da anticorpi monoclonali (elencate in alto) è stato analizzato per sei tipi di tessuto con estratti CDTA e NaOH (lato sinistro). Gli epitopi glycan si dividono in tre grandi classi di polisaccaridi, pectine, cross-linking glicani e proteine Arabinogalattano (AGPS). me, metil-esterificazione, DP, grado di polimerizzazione; mAb, anticorpi monoclonali; AGP, Arabinogalattano-proteina.
Figura 5. Profilatura Glycan di Nicotiana alata tessuti floreali rappresentate pittoricamente. AL rappresenta l'abbondanza relativa di 12 epitopi glycan rilevati da anticorpi monoclonali in tessuti di fiori diversi. La scala di intensità del colore barra è proporzionale al valore medio relativo identità posto derivi o da estratti CDTA o NaOH o una somma di entrambi. me, metil-esterificazione, DP, grado di polimerizzazione; mAb, anticorpi monoclonali;. AGP, Arabinogalattano-proteina Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
CoMPP è un metodo rapido e sensibile per la profilatura della composizione glicano di centinaia di piante derivate da campioni in una questione di giorni. Questo metodo integra le piattaforme di batteri o mammiferi già disponibili matrice glycan for high-throughput screening di interazioni di carboidrati composti da glicano proteine leganti, come lectine, recettori e anticorpi 16. Con una grande diversità di sonde disponibili per rilevare glicani parete cellulare, è possibile ottenere informazioni dettagliate su epitopi glicano appartenenti a tutte le principali classi di polisaccaridi in cellula vegetale parete 8,9. Tuttavia questi comprendono solo una piccola parte delle strutture glycan individuate 8,9, e in alcuni casi limitare la comprensibilità delle CoMPP. Tuttavia, questa capacità è stata recentemente estesa con l'uso di moduli di legame carboidrati (CBM) contro glicani vegetali 17, e anche contro epitopi caratterizzati da non-glicosil residues fenolici come 18 e 19 residui acetili che modificano residui glicosilici e svolgono un ruolo importante nella funzione glicano.
Sebbene CoMPP determina i livelli relativi di glicani attraverso una serie di campioni, è possibile quantificare i livelli di epitopo in estratti sequenziali confrontando il segnale di legame specifici in campioni a quella di standard conosciuti (Figura 3B e C). Nonostante i vantaggi di volumi di campione ridotti in un microarray piattaforma, la possibilità di quantificare con precisione le occorrenze glicano può essere ostacolato dalle differenze nella morfologia spot o la saturazione del segnale spot. Questi problemi (così come falsi positivi) sono evitati ottimizzare la quantità di materiale di parete cellulare del volume versi estraente, prima dell'analisi, e comprendente una serie di diluizioni e replicati come descritto qui e in mammiferi metodi matrice glicano 16. Inoltre, le differenze nella morfologia posto (causata dalla diffusione di campionia tassi diversi dal punto di contatto) può essere superato utilizzando senza contatto ink-jet tecnologia microarray 16.
CoMPP viene usato in combinazione con procedure stabilite per l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari 20. Esso può essere utilizzato anche in parallelo con gli attuali metodi biochimici, enzimatici e fisico per ottenere ulteriori informazioni glicano contenuto nei campioni di interesse. Per esempio, invece di estrarre polimeri cellulosici, acetico / saggi di acido nitrico 20 può essere usato per quantificare il contenuto di cellulosa (mg) dopo l'estrazione sequenziale di pectina e reticolanti glicani con CDTA e NaOH. Trattamento enzimatico dei microarrays glycan 21 possono anche rivelare ulteriori differenze nella distribuzione glicano epitopo tra campioni, o confermare la specificità delle strutture epitopi rilevati sul microarray. La determinazione della composizione glicano indipendenti da tecniche analitiche, quali quelle recentemente descritto Abbiamo dimostrato che glicani sono distribuiti in un organo o tessuto maniera specifica in N. alata fiori. Questa informazione può dare comprensione della funzione biologica di glicano epitopi o glicano sintetizzare o modificando enzimi presenti in questi tipi cellulari differenti. CoMPP ha precedentemente fornito informazioni alterazioni della parete cellulare che si verificano in relazione al tipo di piantare 22 durante lo sviluppo 23,24 o in risposta a mutazione 10,25. In sintesi, CoMPP è uno strumento prezioso per lo studio del ruolo diversificata di glicani e glycan geni di sintesi e la modifica nella parete cellulare vegetale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
IEM desidera ringraziare il Danish Research Council (FTP e FNU) per il finanziamento. ERL riconosce il sostegno di un DP ARC sovvenzione. AB riconosce il sostegno del Centro di Eccellenza in ARC Plant Cell sovvenzione Mura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
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