Summary
Metafase å anaphase overgang utløses gjennom anaphase-fremme kompleks (APC / C)-avhengig ubiquitinering og påfølgende ødeleggelse av cyclin B. Her har vi etablert et system som etter puls-chase merking, tillater overvåking cyclin B proteolyse i hele cellepopulasjoner og forenkler påvisning av forstyrrelse fra mitotiske sjekkpunkt.
Abstract
Jevn fordeling av kromosomene mellom de to dattercellene ved celledeling er en forutsetning for å garantere genetisk stabilitet 1. Unøyaktigheter under kromosom separasjon er et kjennetegn på malignitet og assosiert med progressiv sykdom 2-4. Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) er en mitotisk overvåking mekanisme som holder tilbake cellene ved metafase til hver enkelt kromosom har etablert en stabil bipolar vedlegg til mitotisk spindel en. SAC utøver sin funksjon ved forstyrrelser med aktiverende APC / C subenhet Cdc20 å blokkere proteolyse av securin og cyclin B og dermed kromosom separasjon og mitotisk exit. Feil montering av kromosomer hindrer stanse SAC signalering og forårsaker fortsatt hemming av APC / C Cdc20 til problemet er løst, for å unngå kromosom missegregation, Aneuploidy og ondartede vekster en.
De fleste studier som er adressert til jegnfluence av feil kromosomal feste på APC / C-avhengige proteolyse tok fordel av spindel avbrudd med depolymerizing eller microtubule-stabiliserende medikamenter for å forstyrre kromosomal vedlegg til mikrotubuli. Siden forstyrrelser microtubule kinetikk kan påvirke transport og lokalisering av kritiske regulatorer, disse prosedyrene bære en risiko for å indusere kunstige effekter 5.
Å studere hvordan SAC forstyrrer APC / C-avhengige proteolyse av cyclin B under mitose i uaffisert cellepopulasjoner, etablerte vi en histone H2-GFP-basert system som tillot samtidig overvåking av metafase justering av mitotiske kromosomer og proteolyse av cyclin B 6 .
Å skildre proteolytiske profiler genererte vi et kimært cyclin B reporter molekyl med en C-terminal SNAP moiety 6 (figur 1). I en selv-merking omsetningen er den SNAP-moiety stand til å danne kovalente bindinger medalkylguanine-bærere (SNAP substrat) 7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er lett tilgjengelig og har et bredt spekter av forskjellige fluorokromer. Kimære cyclin B-SNAP molekyler blir merket ved tilsetning av den membran-gjennomtrengelige SNAP substrat til vekstmediet 7 (figur 1). Etter merking reaksjonen synker cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaksjon-aktig måte og fluorescensintensiteter reflekterer nivåene av cyclin B degradering 6 (figur 1). Vårt system forenkler overvåking av mitotiske APC / C-avhengig proteolyse i et stort antall celler (eller flere cellepopulasjoner) i parallell. Dermed kan systemet være et verdifullt verktøy for å identifisere agenter / små molekyler som er i stand til å forstyrre proteolytisk aktivitet på metafase å anaphase overgang. Videre har som syntese av cyclin B under mitose nylig blitt foreslått som en viktig mechanism for å fremme en mitotisk blokk i mus og mennesker ved å holde cyclin B uttrykk nivåer stabil 9,10, aktivert dette systemet å analysere cyclin B proteolyse som en del av et balansert likevekt 6.
Protocol
1. Seeding av U2OS-baserte cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells 6) på mikroskop Chamber Slides
- Trypsinize subconfluent SNAP reporter celler som ble tillatt å vokse asynkront i loggen fase i minst 48 timer.
- Arbeide med 8 vel mikroskop kamre (konstant fordeling av celler).
For såing av cellene bort 8 brønnen mikroskop kamre på en konstant fordeling over hele overflaten av mikroskopet kammeret, sentrifuge 10.000 celler og resuspender i 350 pl fenol rød-fri normal vekst medium (supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin / streptomycin og natrium pyruvat). Overføre cellesuspensjon til mikroskopet kammeret (figur 2).
Arbeide med 8 vel mikroskop kamre (maks celletetthet i midten).
For såing av cellene ved en høyere tetthet i midten av mikroskopet Chambeh, last i kammeret med 300 pl fenol rød-fri normal vekstmedium. Legg 5.000 celler forsiktig til midten av mikroskopet kammeret (figur 2).
Arbeide med 96 godt spesielle optikk plater (konstant fordeling av celler).
For såing av cellene bort på 96 brønners plater ved en konstant fordeling over hele overflaten av brønnen, sentrifuger 5000 celler og resuspender i 300 pl fenol rød-fri normal vekstmedium. Overfør cellesuspensjonen til en 96-brønns plate. Avhengig av det totale antall celler som inneholder brønner kreves, juster cellenummer og det totale volumet av det suspensjonsmedium (Figur 2).
Arbeide med 96 godt spesielle optikk plater (maks celletetthet i midten).
For såing av cellene bort på 96 brønners plater, tilsett forsiktig 1500 celler i 15 pl fenol rød-fri normal vekst medium i en small dråpe til midten av hver brønn for å oppnå begrensning av cellevekst til midten av brønnen (figur 2).
- Tillat seeded celler til å vokse i minst 18 timer under standard celle dyrkningsbetingelser (37 ° C, 100% luftfuktighet og 5% CO 2).
2. Farging av Reporter Cells med SNAP Substrat
- 30 min før begynnelsen av fargingsreaksjonen prosedyren tillater aliquoter av fenolrødt-fri normal dyrkningsmedium å varme opp til 37 ° C.
- For enkel håndtering av SNAP substrat (i vårt tilfelle TMR Star) oppløse TMR Star i DMSO for å oppnå en konsentrasjon i stamløsningen av 400 uM, som kan lagres ved -20 ° C.
- Før farging, fortynne 0,5 ul TMR stjerne stamoppløsning i 200 ul fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C) for å oppnå en endelig konsentrasjon på merking 1 uM.
- Fjern normal vekst medium fra de asynkront voksende celler og inkuber i labeling medium for 25 min under standard kultur forhold.
- Fjern merking mellomstore og vask cellene fire ganger med fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C). Inkuber celler i 300 pl fenol rød-fri normal vekst medium (37 ° C) i 30 min. Før transport til mikroskopet erstatte mediet med fersk fenolrødt-fri normal vekst medium (37 ° C) for å fjerne resterende ubundet SNAP substrat.
- Transport celler til mikroskopet i en styrofoam boksen på en forvarmet (37 ° C) varme blokk for å minimere temperatursvingninger.
3. Måling av fluorescensintensitet
- To timer før analysen justere lufttemperaturen av klimaet kammeret til 37 ° C i tørr-modus for å bringe hele mikroskop med alle sine komponenter til ønsket temperatur. Forvarming før innstillingen luftfuktigheten er viktig for å unngå kondensasjon og påfølgende skade på mikroskopet.
- Juster luftfuktigheten to 60% og CO 2-5% før starten av analysen.
- Start Scan ^ R Acquisition programvare og definere standard innstillinger (se tabell 1).
- Definer posisjonene til brønnene som skal analyseres.
- Definer DT (kjøp syklus tid) og det absolutte antallet oppkjøp sykluser.
- Hvis analyse av et høyere antall brønner er ønskelig, velge maskinvare autofokus, ellers er det tilstrekkelig å bruke programvare autofokus alene.
- Start oppkjøp og tilsyn for de to første oppkjøp sykluser. Mikroskopet vil fokusere på histon H2-GFP signal, med senere kjøp av et første bilde i den kanalen før filteret endres og den tilsvarende TMR stjerne bildet tas (Figur 3). Dette gjentas deretter for alle posisjoner innenfor en brønn og for hver av brønnene for å bli undersøkt, før gjentatt på nytt neste syklus.
4. Analyse av Proteolytisk profiler usynge Scan ^ R
- Start Scan ^ R Analyseprogram og analysere bildene med cellekjerner, som visualisert etter histon H2-GFP, definert som hovedformål, ved hjelp av en terskel basert på signalintensitet og et vannskille algoritme for å bistå i separering nabocellene. En subobject bestående av en kjerne med cytoplasma bør opprettes for TMRstar analyse. (Viktige egenskaper hovedformål er X og Y posisjonene, tid og maksimal og gjennomsnittlig intensiteter av GFP til hovedformål og den totale intensiteten dividert område for TMRstar subobject.) Denne analysen kan ta flere timer på grunn av store data mengder.
- Endre til spore-modus for å visualisere subobject middelverdien TMR stjerne fluorescens intensitet over tid (celle spor), tilordnet de analyserte viktigste gjenstander (figur 4). Antall celler som skal undersøkes kan bli redusert ned etter gating på disse målingene varer minst 140 sykluser og med en høy maksimal intensitet av H2-GFP. Serpå større antall celler tillater en første representant og objektiv visning (figur 4).
- Velge en celle spor av interesse å visualisere histon H2-GFP og TMR stjerne fluorescens samtidig på enkelt celle-nivå (figur 5A).
- Bruke høyre museklikk på en celle av interesse og generere en eksportvare bildegalleri for illustrasjon av histone H2-GFP og cyclin B-SNAP TMR stjerne for hver enkelt tidspunkt.
- Bytt til befolkningen modus på Scan ^ R Analyse programvare og gate regionen hvor cellen av interesse er representert på X vs Y prikkplott (figur 5B).
- Påfør et nytt prikkplott vinduet til gated regionen og visualisere betyr TMR stjerne fluorescens intensitet over tid (Figur 5C).
- Eksportere data (tid og fluorescens intensitet) til Microsoft Excel for videre beregning.
5. Representant Resultater
Figure 5D og 5E skildre cyclin B kinetikk, representert ved en TMR stjerne fluorescensintensitet kurve, av en celle som fortsetter gjennom en vanlig mitose uten tegn på kromosomal feiljustering (figur 5E). Ved komprimering av cytoplasma etter kjernefysiske konvolutt sammenbrudd (NEBD, som indikert ved den røde trekanten), viser TMR stjerne fluorescensintensitet en brå økning inntil isomorf vinduet (lysere område i diagrammet) nås når cellen trer prometaphase 6. Fluorescensintensitet holder seg på et stabilt nivå så lenge cellen går gjennom profase og metafase og deretter begynner å falle raskt når alle kromosomene har etablert en stabil metafase plate (figur 5D og 5E). Denne nedgangen kommer før kromosom separasjon under anaphase (blå prikk på kurven). I slutten av mitose kromatin begynner å decondense (blå søyler) og cellen vedtar interfase morfologi mens fluorescensintensiteten kurven nærmer seg enplatå som er lavere enn platå før mitose (Figur 5D og 5E).
Autofokus innstillinger | Histone H2-GFP (hovedformål kjøp innstillinger) | Cyclin B-SNAP merket med TMR stjerne (Kjøp innstillinger) | Oppkjøp syklus tid repetisjoner |
Grov autofokus + / -39 mikrometer 24 lag Fin autofokus + / -5,4 Mikrometer 14 lag | GFP filter satt: Eksponeringstid: 100 msek Lysintensitet: 25% | TRITC filter satt: Eksponeringstid: 150 ms Lysintensitet: 33,3% | 2-5 min. |
GFP filter satt: Eksponeringstid: 12 ms Lysintensitet: 12,5% | Opptil 48 hr av fortsatt analyse (begrenset av redusert luftfuktighet på 60%) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B.
Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998). - Fletcher, D. A., Mullins, R. D.
Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010). - Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).