Summary
腺病毒颗粒设计，含有非天然氨基酸类似物azidohomoalanine或叠氮糖
Abstract
病毒颗粒的修改已收到的关注显着，其影响的基因治疗，溶瘤应用和疫苗开发的巨大潜力。1,2,3修改病毒的表面，其中大多是遗传学的基础，当前的方法往往受到衰减生产病毒，传染性和细胞转导。4,5使用化学选择性的点击化学，我们已经开发出一个简单的替代方法回避这些问题，同时保持高度灵活和方便。1,2
本议定书的目标是展示使用bioorthogonal点击化学修改的5型腺病毒颗粒表面的成效。可用于同时治疗1或分析，2,6这两个步骤的过程，作为靶向分子，染料或其他分子的化学选择性结扎允许到蛋白质预先标记叠标签。这种方法的三个主要优点是：（1）代谢标记表明几乎没有病毒健身的影响，1,7（2）广泛的效应配体可以利用，（3）它是非常快速，可靠和易于访问。1,2,7
在此过程的第一步，腺病毒颗粒生产轴承要么azidohomoalanine（AHA，蛋氨酸的替代）或不自然的糖O型联的 N-azidoacetylglucosamine（ 邻 GlcNAz），它们都含有叠氮化物（氮3）功能组。净化后的叠改性病毒颗粒，包含：TAMRA荧光基炔探头结扎预标记的蛋白质或糖蛋白在化学选择性的方式。最后，进行SDS-PAGE分析证明到病毒衣壳蛋白探头成功结扎。阿哈纳入标记所有病毒衣壳蛋白（Hexon蛋白，聚氯和光纤），而O型 GlcNAz只标签纤维掺入结果。
在这个不断发展的领域，已成功开发出多个叠 - 炔结扎方法，但是只有两个我们已经找到了，是最方便的证明本 - 促进应变叠氮化物 - 炔环加成（SPAAC）和铜催化的叠炔环加成（CuAAC）在无氧气氛下。
Protocol
请参阅表1，准备在这个协议中引用的所有媒体，缓冲区和解决方案。
1。生产的AHA-标记的腺病毒
- 准备人类胚胎肾脏细胞11 100毫米组织培养皿（HEK 293）（ 见表1）在HEK 293细胞的生长介质保持在37°C，直到他们达到80 - 90％汇合。 （注：文化的汇合90％以上的感染，可能不会产生所需的病毒可能很难。）
- 松开的菜肴之一，首先消除的生长介质，5毫升的TD缓冲区冲洗一次，然后孵化一分钟1毫升的胰蛋白酶-EDTA（1×）的细胞的细胞。
- 加入9毫升的HEK 293细胞的生长介质，并使用血球计数仪，指望从这个菜收获HEK 293细胞的数量。使用这个数字来计算金额感染腺病毒5型（Ad5的），使用1 multiplicit感染Y（MOI），价值10 PFU /细胞。账户的事实，Ad5的正常，传染性指数（传染性微粒的粒子总数的比例）通常是1:20。
- 准备感染缓冲区10毫升。
- 慢慢地从其余十培养皿HEK293细胞生长培养基，然后用5毫升的TD缓冲区。加入1毫升感染的缓冲区，以每道菜在37°C孵育1小时。在此期间感染期间，轻轻摇动每个培养皿一边到另一边，每隔15分钟。
- 感染后在37°C，加入9毫升新鲜的HEK 293细胞生长培养基孵育18小时。
- 编制阿哈标签介质（或符合控制介质控制）100毫升。务必过滤0.2微米的无菌注射器过滤器前准备的标签媒体集中的股票解决方案。
- 仔细（以免洗去感染的细胞），取出后18 HR的HEK293细胞生长培养基第二洗每个培养皿中，用5毫升的TD缓冲区。
- 删除TD缓冲洗涤液，每个培养皿中加入10毫升的阿哈标签介质。蛋氨酸控制介质控制，应在这一步，而不是的阿哈标签介质。
- 标签介质在37°C为6小时的孵育感染的细胞。 ，随时标签可以在12 - 24小时后感染，但不应该是持续时间超过6小时的时间。此时间间隔已经确定，最大限度地与病毒结构蛋白翻译重叠，确保传染性不显着减少。7
- 小心地取下标签介质，以免破坏细胞。新鲜HEK293细胞生长培养基中加入10毫升，每道菜，另外18小时在37°C孵育细胞。受感染的细胞在这一步，以尽量减少损失，这是完全没有必要删除标签解决方案。 HEK293细胞的培养基中含有过量的M等将outcompete任何剩余阿哈。
- 继续加强净化3。
2。生产的叠氮糖标记的腺病毒
- 按照题为阿哈标记的腺病毒，包括步骤1.5生产过程。
- 准备100毫升的叠氮糖标签介质。
- 覆盖在37°C细胞10毫升新鲜叠氮糖标签介质和孵育44小时。
3。叠氮化物标记的腺病毒颗粒的分离纯化
- 从每个培养皿和锥形管转移到受感染的细胞取出媒体。在2000克离心10分钟，在4°C。取出上清液和悬浮颗粒在TD缓冲区（使用TD每10道菜的缓冲区8毫升）。
- 重复（3个或更多）冻融循环使用杜瓦瓶液氮和37℃水浴裂解感染细胞。在离心2000克10分钟在4°C，从上清中分离出来的细胞碎片。
- 准备先成超清晰的离心管中吸取2.5毫升1.25克/毫升的氯化铯溶液1 CsCl密度梯度离心管。接下来，使用其尖端定位在试管底部吸管慢慢加入2.0毫升1.4克/毫升的氯化铯溶液，小心不要打扰梯度界面。
- CsCl密度梯度管的顶部3.2从步骤上，吸取上清液，如果有必要附加的TD缓冲区，以填补管。摆动斗在125000克的转子为1小时15°在超高速离心Ç离心样品。
- 超速完成后，应该是在氯化铯的两个解决方案的界面作为一个厚厚的白色条纹可见病毒颗粒。做一个解决漏滴用无菌针管底部的小穿孔。
- 收集了厚厚的白色带，其中应包含标记Ad5的颗粒，羚牛Ğ照顾，以排除多余的氯化铯的解决方案。避免收集细胞蛋白，这将带病毒层以上。此外排除空病毒粒子衣壳形成了较轻的一层厚厚的白色病毒带略高于。
- 另外，执行对Ad5的粒子标记的最终净化。加入收集的分数从3.6步超离心管4毫升和1.35克/毫升的氯化铯溶液的填充管。离心125000克为18小时，于15°C，并收集在中间的步骤3.5和3.6所述的管形成厚厚的白色带。 （注意：如果病毒滴度低，一条白色带可能不可见第二离心后，将不可能恢复标记的病毒）。
- 对于存放过长时间的病毒粒子，所收集的病毒提取透析应进行对病毒的存储缓冲区。透析的病毒样本储存在-80°C
4。里使用应变促进叠氮炔环加成炔探头修饰的腺病毒颗粒gation（SPAAC）
- 到50μL病毒的存储缓冲区的Ad5的改性叠的解决方案，增加0.25μlSPAAC标签解决方案的。 （请参阅市售紧张炔商贩名单试剂表）。
- 允许应变推动的环加成反应，继续在室温下过夜。如果使用光敏感探头（ 如 ：TAMRA），包括反应容器用铝箔。
- 净化标记的病毒，根据步骤6。
5。结扎，炔探头在无氧大气中使用的铜（I）催化叠氮，炔环加成（CuAAC）修饰的腺病毒颗粒
- 地方7.2毫克的铜（I）溴化物（溴化亚铜）Eppendorf管中的粉末，用铝箔覆盖。
- 吸取1毫升DMSO成为第二个Eppendorf管。
- 准备标签的CuAAC溶液50μl的在第三个Eppendorf管中。用铝箔覆盖，如果炔探头是光敏感（ 如 ：TAMRA-炔）。
- 6小时3个Eppendorf管，不封顶，将在无氧手套袋。所有样品应保持里面的手套袋，直到完成的CuAAC反应。
- 准备加入1毫升的DMSO 7.2毫克溴化亚铜粉末，这两个已经按照步骤5.4无氧的溴化亚铜50×原液。
- 启动此溴化亚铜原液加入1μl移液器50μL的CuAAC标签解决方案，并已按照步骤5.4无氧CuAAC反应。使反应进行12小时内手套袋。
- 净化标记的病毒，根据步骤6。
6。标记病毒颗粒的纯化和贮存
- 净化标记的病毒样本，使用离心九月凝胶过滤自旋Çolumns平衡与病毒存储缓冲区，按照制造商的指引。
- 另外，可以进行净化透析对病毒的存储缓冲区。
- 应储存在-80°C标记的病毒颗粒
7。标记的腺病毒荧光凝胶扫描的SDS-PAGE
- 纯化标记病毒，煮沸10分钟至20μL加入20μLLaemmli样品缓冲液（2×）。样品离心30秒，以消除任何不溶性的沉淀。如果残余铜是目前净化后，沸腾的样品可以导致SDS-PAGE凝胶上蛋白的粗条纹，导致在可视化的困难。在这种情况下，放弃在此步骤中样品的沸点。
- 将凝胶电泳细胞的录像带，并添加运行缓冲。病毒的蛋白质样品，装入井所需的数量。使用一个加载前STAINED分子量标记。运行1小时凝胶在200五，用铝箔覆盖整个期间保持电泳细胞减少的漂白的荧光标签。
- 为最佳分辨率，并删除所有无荧光，允许运行跟踪染料的凝胶电泳。停止电泳和快速传输凝胶荧光凝胶扫描仪扫描凝胶在适当波长（574纳米）为：TAMRA荧光发射。
- 每个病毒颗粒结合的染料分子的数量可以通过测量荧光的几个标准：TAMRA浓度和样品比较，从步骤7.3量化。
8。代表结果
SDS-PAGE电泳和荧光凝胶扫描共轭：TAMRA-Ad5的观测结果如图3所示。虽然这些荧光的凝胶扫描进行样品作案通过CuAAC田间，结果应该是比较时探头通过SPAAC结扎。这些凝胶扫描表明，在阿哈三个Ad5的衣壳蛋白（Hexon蛋白，聚氯，纤维）的修改标签的结果，而糖的标签修改只有光纤衣壳蛋白。此外，增加在阿哈浓度的（4毫米与32毫米）的结果更大程度在阿哈成立的，但它也已显示，以减少传染性。前7结果表明，在4mm生产Ad5的阿哈，大约有5％的暴露蛋氨酸网站的是：TAMRA修饰，这个数字提高到10％时使用32毫米阿哈是。这相当于约280和510，分别为每Ad5的粒子，染料标记网站。糖标签1的分析表明，大约22 36 Ad5的糖基化位点是由叠氮糖占领，随后：TAMRA标记。
如果10个组织培养皿用于生产叠改性Ad5的描述在这个协议中，200 - 300μL的叠氮化改性病毒应获得3.6步骤中收集的白色带，以滴度约为1.5×10 12颗粒/毫升。此过程的一个共同困难是缺乏病毒带在此纯化步骤，这可以归因于病毒滴度低。这是一般是过高或过低合流，或洗去细胞的感染细胞的结果 - 成为从感染后板松动而在第1步 - 冲洗。
图1。协议概述。叠氮含AHA或GalNAz首次被纳入到腺病毒颗粒。结扎与炔的荧光探针，然后通过“点击”化学。最后，SDS-PAGE电泳用于证明结扎荧光探针。
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图2。炔探头结扎上叠（一）SPAAC，（二）CuAAC下，含氧及（c）含氧气氛中通过修改病毒。
图3。荧光标记叠，腺病毒5型后CuAAC：TAMRA-炔共轭（Ad5的）的SDS-PAGE扫描。 （一）AHA-Ad5的标记，使用两种浓度阿哈。标签似乎发生腺病毒Hexon，聚氯和光纤衣壳蛋白，与阿哈浓度增加增加标签的程度。 （二）AC 4 GalNAz-标记的腺病毒似乎只能在光纤衣壳蛋白标记。
| 解 | 准备 | 笔记 |
| AD5存储缓冲区 | 5毫米的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中含有0.5毫米50 mM氯化钠， 氯化镁 ，25％（V / V）甘油，0.05％（W / V）牛血清白蛋白（BSA）的 | 储存在-20°C |
| AD5感染缓冲区 | 2％（V / V）小牛血清，1×TC的解决方案，在存储缓冲区AD5（量确定使用MOI 10 PFU /细胞和传染性指数1:20）。使用TD缓冲区最终体积带来的解决方案 | Ad5的浓度可通过紫外吸收光谱测定。 |
| TC方案（200×） | 136毫米100毫米氯化钙 ，氯化镁2 | 保存于4°C间 |
| 运输署缓冲区 | 137 mM氯化钠，氯化钾5毫米，0.07毫米的Na 2 HPO 4，和25毫米的Tris-HCl，pH值7.5 | 保存于4°C间 |
| HEK293细胞生长培养基 | 辅以10％（V / V），小牛血清（BCS）的1％（V / V）笔链球菌杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基） | 保存于4°C间 |
| 半胱氨酸原液（100×） | DMEM培养基（-蛋氨酸/半胱氨酸）辅以200毫米L-半胱氨酸 | 准备新鲜和过滤0.2微米的无菌注射器过滤器在使用前。 |
| 阿哈原液（25×） | DMEM培养基（-蛋氨酸/半胱氨酸）辅以100毫米L-Azidohomoalanine | 准备新鲜和过滤0.2微米的无菌注射器过滤器在使用前。 |
| 阿哈标签介质 | DMEM培养基（-蛋氨酸/半胱氨酸），辅以10％BCS，阿哈储备溶液（1×），2毫米L-半胱氨酸 | 使用前准备好新鲜。 这相当于一个4毫米Concentration啊哈，虽然不同浓度可用于（见代表结果 ）。 |
| 气象原液（25×） | DMEM培养基（-蛋氨酸/半胱氨酸）辅以100毫米L-蛋氨酸 | 准备新鲜和过滤0.2微米的无菌注射器过滤器在使用前。 |
| 气象控制介质 | DMEM培养基（-蛋氨酸/半胱氨酸）辅以10％BCS的，符合储备溶液（1×），2毫米L-半胱氨酸 | 使用前准备好新鲜。 |
| AC 4 GalNAz，储备溶液（1000×） | 50毫米peracetylated的N - azidoacetylgalactosamine（AC 4 GalNAz）甲醇 | 保存于4°C。 AC 4 GalNAz是一个新陈代谢的前兆GlcNAz。 |
| 叠氮糖标签介质 | 100μLAC 4 GalNAz股票的解决方案，100毫升的HEK 293细胞生长培养基 | 允许甲醇蒸发之前加入HEK293细胞生长培养基。 |
| 氯化铯解决方案 | 氯化铯溶解在TD缓冲区： 1.25克/毫升（18.08克/ 50毫升H 2 O） 1.35克/毫升（25.60克/ 50毫升H 2 O） 1.40克/毫升（31.00克/ 50毫升H 2 O） | 密度梯度超速 |
| 病毒存储缓冲区 | 磷酸盐缓冲液（PBS），pH值7.2，含0.5毫米，0.9毫米氯化镁 ， 氯化钙 ，和10％（V / V）甘油 | 储存在-20°C |
| ：TAMRA-BCN（SPAAC）的标签解决方案 | 在DMSO：TAMRA-BCN的：
| 应变推动炔探头的 对于SDS-PAGE电泳，约10 12颗粒/毫升的病毒滴度建议 |
| ：TAMRA-炔（CuAAC）的标签解决方案 | 50μL叠改性Ad5的病毒存储缓冲区（Ad5的例确定为以上），1.5毫米batho菲罗啉磺酸钠（ 即 1.5×最终溴化亚铜浓度）：TAMRA-炔。 ：TAMRA-炔烃的摩尔浓度（米）的决定： çALK = 2×10 6×（N 重组腺病毒Ad5 / AVO） （在第5步准备，使反应混合物中包含100个病毒颗粒炔探头） | Tris缓冲被称为是一个有竞争力的铜和抑制配体8。 |
| Laemmli样品缓冲液（2×） | 125毫米的Tris-HCl（pH值6.8），4％（W / V）SDS，20％（V / V）甘油，10％（V / V）2 - 巯基乙醇，0.004％（W / V）溴酚蓝 | |
| 运行缓冲液 | 187毫米甘氨酸，3.5毫米，19毫米的Tris-HCl SDS H 2 O | 保存于4°C间 |
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Discussion
在化学选择性和bioorthogonal点击反应，包括叠氮化合物的的发展是一个发展迅速的研究领域，以及随后出现的这些反应越来越多的选择，从生物耦合应用。我们已经限制了该协议的范围包括在我们自己的实验室和所有试剂的商业可用性的方法，因为它们的用途选择只有两个。
在第一个这样的路线-应变促进叠-炔环加成（SPAAC） -炔载内cyclooctyne环（ 图2a）。这是最近开发的方法，可以在含氧气氛下进行，并没有需要铜催化剂。9,10直到最近，这种方法的缺点之一是这些紧张炔费力的合成和减少商业可用性与末端炔铜（I）催化叠氮，炔环加成（铜AAC）;然而，越来越多的这些探头库是目前市售（见试剂表）。由于这些原因，我们选择了SPAAC在本协议作为首选方法。
还介绍了这个协议是结扎叠修改通过无氧作为螯合剂（ 图2b）使用bathophenanthroline二磺酸二钠盐（BDA）的气氛在CuAAC腺病毒颗粒。这种方法是在BDA的催化剂，是市售廉价方便。此外，报告的收益率一般最高可用的方法，产生活性氧的溶液中（参见含氧CuAAC，低于）所产生的并发症是可以避免的。然而，铜催化剂（一）被称为是细胞毒性， 11和需要专门的设备来实现这个过程可能会阻止一些团体使用。然而，我们发现这种方法的有效和有益的腺病毒修改。
第三CuAAC有用的方法最近已制定下工作的含氧大气条件（ 图2c）8。这种方法享有相同的福利作为BDA的螯合的方法，但作为螯合剂使用，以适应不大气中的氧气氧化破坏，而不是THPTA基板上。这种方法的一个小缺点是商业可用性的THPTA目前缺乏的，虽然简单，这种螯合剂合成已报告8。虽然我们没有我们自己的系统上执行此结扎法，THPTA / CuAAC预计将产生媲美北京经济技术开发区/ CuAAC，添加含氧大气宽容的便利。
尽管故意周围市售材料开发的这个协议，我们仍然要承认的成本优势和增加合成的灵活性此处使用叠氮化物和炔探头。 azidohomoalanine可以准备在低至3天，并显着高于商业来源。6,12紧张炔筹备工作更加困难11，但提供更大的探头选择的自由。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢国家科学基金会拨款（CBET-0846259）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
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