Summary
No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano epidermólise bolhosa adquirida (EBA)
Abstract
Fenómenos auto-imunes ocorrem em indivíduos saudáveis, mas, quando a auto-tolerância falhar, a resposta auto-imune pode resultar na patologia específica. De acordo com os postulados de Witebsky, um dos critérios para o diagnóstico de uma doença auto-imune, como seja a reprodução da doença em animais experimentais por uma transferência passiva de anticorpos. Para epidermólise bolhosa adquirida (EBA), uma doença órgão-específica protótipo auto-imune da pele e membranas mucosas, vários modelos experimentais foram recentemente estabelecida. No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano EBA 1. Full-blown doença generalizada é normalmente visto 5-6 dias após a primeira injecção e a extensão da doença está correlacionada com a dose administrada de a collagen VII-IgG específico. A lesão tecidual (a formação de bolhas) na EBA experimental é, dependendo do recrutamento e ativação de granulócitos por tecidos ligados auto-anticorpos 2, -4. Portanto, este modelo permite a dissecção da via dependente de granulócitos-inflamatório envolvido no dano de tecido auto-imune, como o modelo reproduz apenas a fase de células T independente da resposta auto-imune eferente. Além disso, o seu valor é sublinhado por uma série de estudos que demonstram o potencial de indução de blister de anticorpos in vivo e investiga o mecanismo da formação de bolhas na EBA 1,3, -6. Finalmente, o modelo vai facilitar grandemente o desenvolvimento de novas terapias anti-inflamatórios em doenças induzidas por auto-anticorpos. No geral, o modelo animal passiva transferência da EBA é um modelo de doença acessível e instrutivo e vai ajudar os pesquisadores a analisar não só a patogênese EBA, mas a resposta fundamental biológica e clinicamenteperguntas essenciais autoimunidade.
Protocol
1. Preparação de Anticorpo Pathogenic
Nota: A purificação e concentração dos anticorpos deve ser realizada no mesmo dia, na forma de anticorpos não são para ser armazenada em glicina 0,1 M pH 2,5-3 (tampão de eluição) durante a noite (ON).
A purificação por afinidade de IgG: usar 25 ml de soro de coelho imune:
- Descongelar o soro de coelho ON a 4 ° C, mistura-a 1:1 com tampão de corrida (1xPBS) e centrifugar a 1260 ela xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, um passo de filtração com papel de filtro pode ser incluída no processo, após a centrifugação do soro é gordurosa.
- Enquanto isso, lava-se a proteína G matriz cheia de coluna com 10 volumes de leito (volume do leito = volume da matriz) de 1xPBS (tampão de corrida).
- Aplicar o soro diluído e filtrou-se para a coluna e incuba-se 1 hora na plataforma de balanço à temperatura ambiente (RT).
- Recolher o flow-through (FT) num tubo de Flacon de 50 ml. Não descartá-lo até a concentraçãoe titulação da IgG purificada é conhecido.
- Lava-se a matriz com 5 volumes de leito de 1xPBS e, entretanto, se preparar tubos de 50 ml Falcon para recolher a fracção de IgG eluida. Pipetar 1 ml de tampão de neutralização de pH: Tris 1 M pH 10, em cada um dos tubos (caso contrário, a proporção de 01:20 de tampão TRIS em relação à quantidade de fluido a ser recolhido).
- Aplicar 100-150 ml de tampão de eluição: glicina 0,1 M pH 2,5-3 para a coluna e recolher 50 ml fracção (s). Virar o tubo 2-3x, medir o pH e adicionar tampão de neutralização até que tenha atingido o pH 7,2-7,4.
- Recolher gotas de fluido e IgG utilizando o tampão de eluição, como etalon medir a densidade óptica a 280 nm. Se a DO for <recolha de paragem 0,1.
- Regenerar a proteína da matriz G e armazená-la seguindo as instruções do fabricante.
Concentração por ultrafiltração Amicon com tubos:
- Lavar o Ultra Amicon (15 ml / 30 kDa) em tubos de ultraf iltração com 1xPBS por centrifugação 15-20 minem 3220 xg, a 4 ° C. Descarte o FT do Amicon.
- Encha as Amicons com 15 ml da fracção de IgG eluida e centrifugar durante 25-30 minutos a 3220 xg e 4 ° C, o tempo de centrifugação sempre depende do teor de proteína do eluato.
- Descarte FT e repetir ultrafiltração até que você tem nenhuma fração eluída esquerda.
- Lava-se a IgG concentrado extensivamente, por duas vezes, com 1xPBS 25-30 min por centrifugação.
- Recolher o "adesivo", a solução de anticorpo amarelado a partir do filtro Amicon, num volume final de 1.500-2.000 ul de 1xPBS.
- Concentração medida de preparação de IgG utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de diluição / 1,4 - Lavar e armazenar os Amicons seguindo as instruções do fabricante.
2. A injeção de colágeno VII IgG específica em camundongos
Antes de iniciar o procedimento real experimental, certifique-se de que o pró experimentalprotocolo é escrito e todos os materiais são preparados para o experimento.
- Prepare as folhas de dados para o placar doença, ELISA, imunofluorescência (IF) análise e mieloperoxidase (MPO) ensaio 4.
- Rotular os tubos de sangue e órgãos, cryomolds bem como histologia de processamento e incorporação de cassetes.
- As soluções de anticorpo deve ser preparado fresco ou descongelado a partir de stocks e caracterizado quanto à sua reactividade (título por microscopia de IF e / ou ELISA). A solução filtrada estéril anticorpo deve ser diluído em PBS, de forma que a dose necessária para a injecção varia entre 250-1000 ul. Certifique-se de que você tem IgG suficiente para realizar todo o experimento.
- Preparar fresco anticoagulante heparina de 20 U / ml e 8,7 mg / ml de cetamina / xilazina 1,3 mistura mg / ml para a anestesia. Quando sacrificar os ratos têm rotulado tubos com formaldeído 3,7% preparado.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos (bisturi, tesouras, ponta fina e Curvforcipes ed) e preparar seringas (seringas de insulina, 1 e 2 seringas ml), agulhas, câmera digital e cartão de memória extra.
Nota: Execute todos os procedimentos de cetamina / xilazina ou isoflurano ratos narcotizada isoflurano é a opção preferida para anestesia as verificações diárias de pele, como os ratos recuperar rapidamente.. No entanto, ao tirar fotos, 87 cetamina mg / kg e xilazina 13 mg / kg é geralmente administrado por via subcutânea. Para a eutanásia a dosagem de cetamina / xilazina é aumentada para 130 mg de cetamina / kg de xilazina e 20 mg / kg.
- Verifique os animais já marcados para a sua saúde da pele estado geral, e da aparência da pele, pesá-los e medir a sua espessura orelha (sempre manter a mesma orelha).
- Registre-se valores observados e mudanças na folha de avaliação clínico.
- Recolher 20-30 ul (2-3 gotas) de sangue a partir da veia da cauda de uma seringa contendo o mesmo volume de anticoagulante.
- Desinfectar a pele eda pele utilizando etanol a 80%.
- Injectar a solução de anticorpo por via subcutânea na parte de trás utilizando uma seringa de insulina. (Para certos sítios (por exemplo, as orelhas) apenas pequenos volumes (10-50 ul) são viáveis para ser injectada.)
As injeções devem ser repetidas a cada dois dias, quatro vezes. Balb / c e ratinhos C57BL6 de um peso corporal de aproximadamente 20 g de começar a desenvolver a doença de 3-4 dias após a primeira administração de 400-500 até 750 ug / g de peso corporal / injecção auto-anticorpos.
Ao terminar a experiência:
- Colocar os ratos sob narcose profunda por injecção de 130 mg / kg e 20 mg / kg de cetamina / xilazina por via subcutânea, desangrar los da veia cava posterior e cortar o coração.
- Coletar amostras de tecidos / órgãos como a pele: rabo, orelha, sangue e esôfago e colocá-los em tubos previamente identificados e PBS ou 3,7% de formaldeído preenchido.
Ao retornar para olaboratório:
- Centrifuga-se o sangue a 1200 xg, 10 min à temperatura ambiente para separar o plasma, transferir o plasma para tubos adequadamente etiquetados e armazená-los em conformidade.
- Incorporar o biópsia da pele em meio corte de óptima temperatura através cryomolds, devidamente etiqueta, e armazená-los a -80 ° C.
- Coloque as amostras de tecidos destinados a histologia nos moldes de incorporação rotulados e mantê-los em formol 3,7% até parafina.
3. Avaliação clínica de gravidade da doença
Ratos devem ser examinados diariamente para lesões de pele e mucosa e os resultados devem ser registradas utilizando formulários apropriados. Os critérios para a eutanásia precoce é lesões da pele que afectam mais do que 20% da superfície do corpo e uma perda de peso de 5-10% do peso corporal total, em três dias consecutivos, contados a doença para uma pontuação de 5 (Tabela 1).
- Posicione o mouse sobre sua barriga. Comece com a área da cabeça, ou seja, com o direitoorelha e verificar se há bolhas, erosões, crosta no interior, bem como sobre o lado exterior. Continuar da mesma maneira com a orelha esquerda.
- Olhos direito e esquerdo são controlados por sinais de eritema, alopecia, erosões e / ou crosta.
- Testa e área focinho são escovados através seguinte, continuando com a parte ventral do focinho, lábio e da mucosa da boca.
- Examine a perna dianteira direita a partir da pata, movendo-se para cima; mudar para a perna dianteira esquerda. Mesmo procedimento com as pernas traseiras direita e esquerda.
- Pincele com a pele no pescoço e nas costas com uma área de curvas pinça de ponta fina.
- Vire o mouse em sua parte traseira e verifique a parte ventral, bem como nos lados ventral dos membros da mesma forma que anteriormente.
- Verifique a cauda.
- Tire fotos de partes relevantes do corpo onde os ratos desenvolvem a doença. Atenção deve ser dada à qualidade e quantidade de fotos.
- Calcular as pontuações clínicos da doença.
4. Análise de amostras de pele e Plasma
- Preparar, armazenar e / ou processar todos os tecidos coletados de acordo com o plano.
- Corte cortes de tecidos congelados para se a detecção de anticorpos de coelho e rato componentes do sistema complemento.
- Analisar o teor de proteína e de enzima diferente (ensaio de MPO) de tecidos congelados e / ou extractos de órgãos.
- Secção do tecido embebido em parafina e coradas com H & E para visualizar a extensão do dano tecidual.
- Analisar o plasma por ELISA, imunotransferência.
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Representative Results
A transferência passiva de anticorpos específicos de antigénio resulta numa doença soprado em ratinhos, assemelhando-se a níveis clínicos, histológicos e imunopatológicas, a ABE humano. Bolhas, crostas, erosões e alopecia desenvolver nas orelhas, focinho, patas, pernas, costas e ao redor dos olhos dos camundongos. Os primeiros sinais clínicos da doença, muito provavelmente aparecer nas orelhas e / ou área de cabeça. Deposição de coelho específico IgG e complemento do mouse C3 é detectado pelo IF direta na junção dermo epidérmica em criosseções de pele perilesional. Em bolhas na pele lesional subepidérmicas e infiltrado inflamatório são vistos por histologia.
No entanto, se a injecção de colagénio VII patogénicos de anticorpos específicos é interrompida, a actividade da doença torna-se gradualmente mais baixa, e dentro de algumas semanas as lesões curam. No entanto, um certo grau de postinflammatory alopecia cicatricial pode persistir indefinidamente.
Characterizção do auto-antigénio recombinante (e de patogenicidade IgG)
Colagénio murino específico IgG liga-se na junção dérmico-epidérmica (Figura 2B). A especificidade é avaliado por imunotransferência (Figura 2C, pistas 3, 4 e 7).
Marcando a atividade da doença
A avaliação clínica da doença é baseado num sistema de pontuação foi desenvolvido (Tabela 1): 0, nenhuma lesão, 1, menos de 1% da superfície da pele, 2, 1-5% da superfície da pele, 3, 5 - 10% da superfície da pele, 4, 10-20% da superfície da pele é afectada. IgG contra murino colágeno VII induz lesões cutâneas, tais como eritema, alopecia, bolhas, erosões, crostas nas orelhas, olhos, focinho, membros e tronco de camundongos Balb / c (Figura 3).
Análise de tecido e ligada à circulação de colagénio anticorpos específicos
Deposição de coelho IgG e complemento do mouse C3 são detected em congelados, cortes de tecido perilesional (Figura 4D e E, respectivamente). As bolhas subepidérmicas e o infiltrado inflamatório são vistos em amostras histológicas (Figura 4F). Os anticorpos de coelho circulantes são analisados por ELISA (Figura 5). Tecidos congelados e / ou extractos de órgãos são analisados por meio de ensaios diferentes para o seu conteúdo de proteínas e de enzimas (ensaio de MPO).
Figura 1. Esquema geral da formação de vesículas in vivo induzida pela transferência passiva de colagénio VII anticorpos específicos. Coelhos foram imunizados com colagénio murino VII e IgG de coelho é purificado a partir do soro imune. Subsequentemente, os auto-anticorpos específicos são injectadas por via subcutânea em ratos após uma injecção / programação sangramento. Ratos estão sendo verificados para a condição de saúde geral e sinais da doença diariamente.
Figura 2. Caracterização de patogenicidade colagénio VII-IgG específico. Indirecta, se a análise de sal por partes de secções de pele de ratinho normais incubadas com soro pré-imune de coelho e com colagénio murino VII-imunes de coelho específicos resulta no soro em nenhuma deposição (A) e da deposição de anticorpos no epidérmica dérmica (B), respectivamente. Os anticorpos específicos reconhecem o antigénio (s) que foram criados contra quando immunoblot com um conjunto de sobreposição de fragmentos de colagénio murino recombinantes VII é realizada (C, pistas 3, 4 e 7).
Figura 3. Avaliação clínica de ratos. IgG murino de colágeno VII induz lesões cutâneas, tais como alopecia, bolhas, erosões, crostas nas orelhas, os olhos, focinho, limbs e tronco de camundongos Balb / c (AD). Camundongos injetados com anticorpos específicos chegar a uma pontuação de 4, enquanto os injetados com NRIgG ou Abs contra uma proteína indiferente teve uma pontuação de 0 (E). A pontuação clínica foi calculada como se segue: 0, nenhuma lesão, 1, menos de 1% da superfície da pele, 2, 1-5% da superfície da pele, 3, 5-10% da superfície da pele, 4, 10 - 20% da superfície da pele é afectada. Perda de peso de 5-10% do peso corporal total durante três dias consecutivos conta como um ponto extra na pontuação final.
Figura 4. Achados histo-e imunopatológicas em ratinhos injectados com colagénio VII-specific IgG Deposition. De IgG de coelho (D), e do complemento C3 de rato (E) é detectada por IF directo na junção dermo epidérmica em criocortes de pele perilesional, in vivo. Em bolhas na pele lesional subepidérmicas e inf inflamatóriailtrate é visto por histologia (F). Nenhuma deposição de IgG de coelho (A), de complemento C3 de rato (B), nem a formação de bolhas subepidérmicas visto nos controlos (C).
Figura 5. Níveis de imunoensaio de plasma de ratinhos injectados com colagénio VII-IgG específico. Plasmáticas circulantes de anticorpos de coelho foram medidos por ELISA.
Tabela 1. Pele bolhas folha de pontuação doença. Clique aqui para ver tabela maior .
Sistema de pontuação:
- 0, sem lesões;
- 1, menos de 1% da superfície da pele;
- 2, 1-5% da superfície da pele;
- 3%, 5-10 da su pelerface;
- 4, 10-20% da superfície da pele é afectada.
Dicas extras quando marcar:
- A perda de peso de 5-10% do peso total do corpo, durante três dias consecutivos, a contagem como um ponto extra na 17 pontuação final.
- Eritema nas orelhas, ao redor dos olhos nas patas são apenas os primeiros sinais de uma reação imunológica em curso, se não for combinado com bolhas ou alopecia não são quantificados, tomado apenas sob observação.
- Marcas na cauda poderia ser mordida ou marcas de luta, por isso, se eles estão presentes desde o início o seu agravamento pode não necessariamente ser devido à doença. Considere atentamente resistir a contá-los!
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Discussion
A transferência passiva de anticorpos em animais experimentais é uma abordagem importante para a demonstração da sua patogenicidade 7, -12. Os modelos animais obtidos por meio deste método, para além de ser a evidência indirecta para autoimunidade 13, permite a investigação da fase eferente do mecanismo patogénico. O modelo de transferência passiva de anticorpos induzida pela pele de granulócitos-dependente de bolhas Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), foi usada para dissecar os mecanismos de danos nos tecidos em dermatoses autoimunes. Ele surgiu, também, como uma doença modelo requintadamente instrutivo estudar fundamentais, biológica e clinicamente aspectos cruciais da mediada por anticorpos órgão-específicos doenças auto-imunes que vão muito além dos limites da auto-imunidade contra colágeno VII. Finalmente, este modelo pode ser usado para estudar os processos biológicos fundamentais e patofisiológicos, incluindo a biologia da membrana basal, a activação de granulócitos por imunocomplexos umd ativação do complemento.
Embora várias configurações experimentais, incluindo ex vivo e modelos animais, estão disponíveis para a doença da pele auto-imune EBA 14, de longe o mais adequado para o estudo das vias de granulócitos-dependentes inflamatórias é a transferência passiva de anticorpos em animais. Em contraste com o modelo ex vivo, em que os granulócitos são adicionadas às secções de pele previamente incubadas com os anticorpos 15, aqui a infiltração de leucócitos é espontaneamente reproduzido pelos ratinhos. Além disso, se optar por trabalhar com anticorpos específicos produzidos contra o antígeno em outros organismos, como o coelho e cabra, evitamos o problema da limitada disponibilidade de soros de pacientes e também temos uma melhor chance de se reproduzir ativação do complemento e recrutamento de granulócitos 16.
Para o sucesso da reprodução de granulócitos-dependente bolhas no modo de transferência passival de EBA, é importante ser capaz de marcar adequadamente os sinais da doença, a partir de eritema e edema com bolhas, erosões com crostas e alopécia. A avaliação dos ratinhos é um processo que necessita de ser previamente aprendida. A pontuação da doença tem de ser realizada pela mesma pessoa, ao longo da experiência e sempre secundado por um colaborador ou pessoa ajuda. O desenvolvimento e uso de um sistema de pontuação padronizado para cada doença experimental é da maior importância. A folha pontuação fechado deve dar ao leitor uma visão como dermatoses na pele são avaliados em camundongos.
Quando executado, como mostrado no vídeo, o modelo de auto-anticorpos induzida por vesiculação subepidérmica vai facilitar grandemente o posterior dissecação das vias dependentes de granulócitos-inflamatórios provocados por auto-anticorpos e que resultam em danos nos tecidos. O seu valor em pesquisa médica é suportado pela perspectiva promissora de desenvolvimento e teste de novo antigénio-sespecífico destinado T e de células B alvo terapias anti-inflamatórias. Finalmente, ele vai ajudar a responder fundamentais biológica e clinicamente questões essenciais auto-imunidade.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 e BIOS da Faculdade de Medicina da Universidade de Freiburg (para CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
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