Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток

Published: October 11, 2012 doi: 10.3791/4254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Приведем простой протокол для визуализации регионов запрограммированной клеточной смерти (PCD) у эмбрионов мышей и дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеточных культур с использованием высоко растворимых красителей называют LysoTracker.

Protocol

1. LysoTracker Окрашивание эмбрионов мыши

  1. Создание эмбрионов мыши, поместив молодых (5-6 недель) женщин в мужских клетках студ. Монитор на следующий утрам для появления вагинального вилку о том, что спаривание произошло. Если женщина беременна, в полдень в этот день называют 0,5 DPC (дней после полового акта). Процедура, представленная здесь, идеально подходит для эмбрионов 7-13 DPC.
  2. На день эмбрионального развития интереса, усыпить женщин в соответствии с утвержденными протоколами и удалить матку. Снимите эмбрионы из децидуальной в 10 см чашки Петри с Хэнксом BSS (без фенола красного). Удалить экстра-эмбриональных мембран и сделать по крайней мере одно полоскание с Хэнксом BSS для удаления посторонних тканей и крови.
  3. Подготовка LysoTracker эмбрионов красящим раствором (5 мМ LysoTracker в Хэнкс BSS). Удобном объеме в течение 1-2 пометов в 5 мл. Аккуратно перемешайте, чтобы выплатить краситель равномерно.
  4. Добавить эмбрионов для окрашивания Solut эмбрионов LysoTrackerиона в микроцентрифужную пробирку или флакон и инкубировать при 37 ° С в течение 45 мин.
  5. Промыть очень осторожно в Хэнкс BSS в четыре раза, в 5 минутах каждого мытья.
  6. Исправить в 4% параформальдегид в течение ночи.
  7. Промыть раз в Хэнкс BSS, 10 мин, чтобы удалить исправление.
  8. Высушить с помощью метанола ряд (50%, 75%, 80%, 100%, 5 мин каждый шаг), чтобы устранить фон окрашивания. Это важно для достижения хорошего отношения сигнал-шум во время съемки.
  9. В этот момент вы можете хранить образцы эмбрионов на неопределенный срок в метаноле при -20 ° C, в защищенном от света.

Примечание: образец ткани может быть принято на любом этапе для генотипирования ДНК, однако, это может быть наиболее удобной, чтобы взять образец перед хранения, так что до этого шага все образцы, может быть пакетной обработке. Сбор образца ткани из хвоста, конечностей, головы или из каждого эмбриона и поставить все на отдельные трубы. Увлажняет образец ткани и подготовиться к genotyпинг.

2. LysoTracker Окрашивание Дифференцируя ES культур

  1. Подготовка эмбриоидные тела через подвесной 15 Метод выпадения со стартовой плотностью 500 клеток в 20 мкл капли.
  2. После 3 дней, передает эмбриоидных органов к приостановке культуры на 10 см не соблюдают чашках Петри (т.е. те, которые используются для бактериологического работы). Культура в течение 5 дней, изменение средств массовой информации каждые 2 дня.
  3. На 7-й день, передает эмбриоидных органов желатинизированный 8-а слайды камера (0,1% добавить желатин в камерах, подождите 5 минут, удалять и добавлять средства массовой информации). Передача 1-2 эмбриоидные тела в камере.
  4. Культура в течение 10 дней, меняя средства массовой информации каждый день. Будьте осторожны, чтобы поместить пипеткой на углу камеры слайда, чтобы не возмущать эмбриоидных тела прикрепления к поверхности стекла. Кроме того, при добавлении свежей информации также поместить пипеткой в ​​углу камеры и освободить средства массовой медленно.
  5. После 10 дней культомЮр, чтобы индуцировать апоптоз в качестве положительного контроля, лечить некоторые из скважин с 0,1 мМ и 1,0 мМ H 2 O 2 (добавить H 2 O 2 в свежей среде, перемешать, затем добавить к клеткам) в течение 60 мин. Промыть два раза с D-PBS и культуры в течение ночи в регулярном СМИ.
  6. Аккуратно аспирации существующих средств массовой информации и добавить LysoTracker сотовых красящим раствором (500 Нм LysoTracker (конечная концентрация) в средствах массовой информации, 300 мкл на камеру).
  7. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
  8. Промыть два раза с D-PBS 2 раза, 5 мин.
  9. Исправить в 4% параформальдегид в течение 15 мин при комнатной температуре.
  10. Промыть два раза с D-PBS, 5 мин.

3. Просмотр LysoTracker Витражи эмбрионов или ES культур

  1. Подготовка образцов клеток для микроскопии путем аспирации D-PBS, удаление камеры от слайда; сушки на воздухе в течение 5 мин, а затем добавляют водный монтаж среды (Vectashield с DAPI или аналогичный). Поместите фольги барьер в то время как dryinг снизить отбеливания флуорофора. Установите эмбрионов в глубокую депрессию, стеклянное блюдо или небольшой чашке Петри в Vectashield или аналогичный.
  2. Визуализация с рассечения или составной микроскоп оснащен родамина или Texas Red фильтр (LysoTracker RED DND-99, возбуждение / излучение: 577/590 нм). Окрашивание, как правило, довольно яркая так долго воздействия, как правило, не требуется.

4. Количественное результатов с использованием методов визуализации

  1. Возьмите цифровой фотографии ваших образцов в тех же условиях экспозиции в ручном режиме.
  2. Открытие изображений в Adobe Photoshop или аналогичной программой визуализации. Для определения количества LysoTracker окрашивания, выберите красный канал и пороговых изображения (преобразует изображение в черно-белое), что красное окрашивание в настоящее время представлены белые пиксели. Выберите белых пикселей и использовать гистограмму функции для получения общего количества.
  3. Используйте синий канал для подсчетачисло ядер в этой области. Это может быть полезно вести учет счетчик на аннотирования изображений.
  4. Запишите значения, а затем вычислить средний уровень окрашивания в клетке. Повторите этот анализ с той же настройкой порога для всех изображений Вы хотите попробовать.

5. Представитель Результаты

Существует нормальная картина PCD во время эмбрионального развития, что может измениться, когда гена фактора роста, такие, как ежик Соник (Shh), удаляют 16,17. С LysoTracker небольшая молекула красителя, который очень диффузии, весь эмбрион может быть представлена ​​для оценки областей PCD даже глубоко внутри мезенхимы 12,13 рисунке 1 показана схема LysoTracker окрашивания для нормальной и Shh -. / - Мутантных эмбрионов мыши на 10.5dpc. На данном этапе, PCD значительно увеличивается в Shh - / - мутантных эмбрионов, особенно в конечностях и сомита регионс. Части эмбрион может быть отображена в целом крепление при большем увеличении (1В), чтобы оценить общую картину. Расчлененный часть также может быть разрез с вибрирующим микротома (1С) или криостат (DF), чтобы показать PCD регионах более подробно.

TUNEL анализа лучше всего делать на тонких участках, где проникновение терминальной трансферазы менее проблематично. Окрашивание LysoTracker и анализа TUNEL может быть сделано в той же ткани (рис. 1D-G). Эти результаты показывают, что, хотя не существует строгая корреляция между 1:01 и LysoTracker TUNEL окрашивания, общая регионов PCD перекрытия значительно. При большем увеличении, то можно увидеть, что puncta пятно с положительным анализом TUNEL, но не с LysoTracker краситель, puncta, что пятно только с LysoTracker краситель, и puncta, которые перекрывающихся пятен.

Когда EB покрыт на желатин покрытием поверхности, дифференциации клеток будет перемещающихсяэлектронной наружу. После 10 дней культуры, клетки дифференцировались в различные типы клеток, в том числе нейроны, клетки мышц, и кардиомиоциты. Культурах показано на рисунке 2 содержит смешанные популяции этих типов клеток, однако можно было бы адаптировать наш протокол для изучения PCD конкретного типа клеток интерес. Например, EB может рассматриваться с ретиноевой кислотой для повышения дифференциации нейронов 19, а затем LysoTracker анализ может быть использован для оценки гибель нейронов в различных условиях. В нормальной культуре дифференцированных клеток ES, есть несколько клеток, которые подвергаются PCD, и они могут быть обнаружены с LysoTracker и / или TUNEL анализов (рис. 2A). PCD может быть вызвано различными цитотоксическими агентами, такими как перекись водорода (H 2 O 2), который вызывает окислительные повреждения и инициирует апоптоза 20,21. Низкие дозы H 2 O 2 увеличивает какLysoTracker и TUNEL окрашивания по сравнению с отсутствием лечения, в то время как высокие результаты в дозе усадки клеток и распространение LysoTracker и TUNEL положительности. Подобный результат в зародыше, то можно увидеть, что puncta пятно с положительным анализом TUNEL, но не с LysoTracker краситель, puncta, что пятно только с LysoTracker краситель, и puncta, которые перекрывающихся пятен. Следствием применения цитотоксическим агентом, который индуцирует apopotosis по сравнению с сывороткой условиях голода, которые вызывают аутофагии (рис. 2D). Клетки, которые подверглись период сывороточного голодания (1 час) демонстрируют иную картину, где LysoTracker и TUNEL окрашивания не сильно коррелируют. LysoTracker окрашивания значительно увеличилось по сравнению с необработанными культурами, однако TUNEL положительности находится на нормальном уровне.

Применение стандартных инструментов, доступных в Adobe Photoshop, LysoTracker окрашивания может быть определена количественно с простой способ сегментации, что позволяет вычислить средний уровень окрашивания для популяции клеток. 3А-B показано, как выглядит изображение образца в количественном процесса. Начиная с базовой изображение с LysoTracker окрашивание в красный канал и DAPI-окрашенных ядер в синем канале (панель 3А), красный канал этого образа был thresholded, чтобы преобразовать изображение в черно-белом и белые пиксели были Затем выбираются и подсчитывали (рис. 3А). Порога уровня был выбран, которая представляет картины LysoTracker окрашивания. Как и в любой количественного метода, который использует изображения, важно, чтобы избежать передержки ваши фотографии так как это может потенциально привести к более подчеркивая различия. Число ядер в поле можно считать, глядя на только синего канала (рис. 3В) и маркировки ядер с использованием инструмент для рисования, такие как кисти, считая (рис. 3В). Тогда можно выразить йэлектронной уровень окрашивания, вычисляя средний уровень окрашивания в клетке (количество пикселей / ядер счет). Если мы хотим использовать этот алгоритм для высоких по-пут скрининга, большинство пакетов скрининга можно измерить яркость в определенном канале, а также имеют функцию идентификатора объекта, что будет считать ядер в поле, однако для большинства типовых применений ручной метод является быстрым и простой. К примеру, образец область из рис 2A-C количественно и результаты подтверждают, что повышение концентрации H 2 O 2 приводит к более высокому уровню LysoTracker окрашивания (рис. 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. LysoTracker окрашивание в нормальных и Shh - / - эмбрионов. А, А 'Нормальные и Shh -. / - Эмбрионов мышей на 10,5 DPC, окрашивали LysoTracker Красная, установленный в Vectashield и фотографировали подepiflourescence рассекает микроскопом. Скобки указывают расположение передних конечностей B, B 'лапы нормальной и Shh -.. / - Эмбрионов отображаемого при большем увеличении. Обратите внимание на нормальные области клеточной гибели, в том числе "Задняя зона некроза (отмечены звездочкой) и региона в проксимальных мезенхиме зачатка конечности (отмечена стрелкой). Shh конечностей нулевой проявляют сильное окрашивание в медиальной и дистальной части . C, C '. медиальной разрезы передней конечности почки как нормального, так и не имеющими почки конечности. Обратите внимание на наличие окрашивание в проксимальных мезенхимы (стрелка) и AER (стрелки) нормальной почки конечности и сильное окрашивание в спинных и брюшных и дистальной мезенхиме в нуль почки конечности. DF. Же разделе (12 микрон, замороженные раздел) отображаемого на LysoTracker и TUNEL окрашивания (Roche 1684795). В разделе проходит через дистальной части Shh нулевой mesenchyme. Стрелка указывает на AER. Обратите внимание, как общая картина очень похожа помощью обоих методов, однако окрашивание не перекрывается полностью. G, G '. На более высоком увеличении AER и мезенхимы, можно увидеть, как наличие puncta, которые LysoTracker или TUNEL-позитивных Только, а также puncta, которые перекрытие окрашивания.

Рисунок 2
Рисунок 2. LysoTracker окрашивание в дифференцированных клетках ES. Дифференцируя клетки высевают на 8-камеру слайды в отсутствие LIF. Чтобы показать, как LysoTracker и TUNEL окрашивания сравнения, апоптоз путем вызывали с 2 разных доз H 2 O 2, в то время как путь аутофагии вызывали использовании 1 час сывороточного голодания. Эти изображения были сделаны с помощью Zeiss LSM5 конфокальный микроскоп-A''. Необработанные культуры показывают некоторые нормальные апоптоза как указано LysoTРэкера и TUNEL окрашивания. Шаблон с использованием обоих методов главным образом перекрывается (белые стрелки), однако, можно увидеть несколько puncta, которые LysoTracker только положительные (красные стрелки) B-B'', CC ". Обращения с увеличением количества H 2 O 2 стимулирует апоптоз . низкие дозы показывает более LysoTracker и TUNEL положительные puncta по сравнению с необработанными клетками. высокой дозе вызывает в еще более LysoTracker и TUNEL положительные puncta. Белые стрелки указывают на перекрытие окрашивания, в то время как красные стрелки указывают на puncta, которые являются положительными для LysoTracker только. Это также можно увидеть puncta, которые являются только положительные для TUNEL окрашивания (зеленые стрелки) DD ". сывороточного голодания могут вызвать аутофагии, который может стимулировать накопление материала в лизосомах и autophagolysosomes. Обратите внимание, как много puncta LysoTracker видны по сравнению с необработанными культурами. TUNEL положительные puncta присутствуют (большинство из которых перекрытия LysoTracker пятнония, белые стрелки), однако число не сильно увеличилось по сравнению с необработанными условиях. Кроме того, в сыворотке условиях голода, LysoTracker только положительные puncta широко распространены (красные стрелки).

Рисунок 3
Рисунок 3. Количественный метод оценки уровня окрашивания в популяции клеток, используя Adobe Photoshop. A: часть рис. 2A был выбран и LysoTracker (красный канал) и DAPI окрашивания (ядра, синий канал) показано на этой панели ». Красного канала 3А был thresholded чтобы преобразовать его в черно- -белом изображении. Белые пиксели могут быть выбраны и рассчитывали с использованием гистограммы функции B-B ':. Синий канал показывает ядер и при подсчете их изображения могут быть нанесены с помощью функции рисования, такие как кисти C:. Это бывшиедостаточное количественное выборки из панелей 2А-C. Данные представлены в виде точек на ядрах. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важные признаки апоптоза включают обнаружение повреждений ДНК с анализом TUNEL, наряду с обнаружением активности каспазы (обнаружен с МАТ или связывающей молекулы, такие как ZVAD-FMK), наблюдение клеточные изменения, и представление фосфатидилсерина (PS ) на поверхности мембраны (обнаружен аннексина V обязательным). Есть некоторые недостатки каждого из этих анализов. Например, терминальной трансферазы, используемых в анализе TUNEL не проникает за пределы нескольких слоев клеток. Также аннексина V можно выделить клетки, которые не апоптоза, таких как те, которые имеют повреждения мембраны (аннексина V проникает внутрь клетки и отмечает PS на внутренний листок). Кроме того каспазы анализов можно обнаружить каспазы деятельности, которые не связаны с апоптозом. LysoTracker не является заменой для этих анализов, однако оно может быть полезным дополнением анализа в зависимости от контекста.

LysoTracker окрашивания имеет ряд преимуществпо сравнению с другими методами. Потому что это небольшие молекулы красителя, в отличие от белков, таких как терминальной трансферазы (используется в анализе TUNEL) или аннексина V, он легко диффундирует через толстую ткань. Это означает, что LysoTracker окрашивания особенно полезна для поиска изменений в общую картину апоптоза. Таким образом, особенно полезно применение LysoTracker окрашивания, как при первом прохождении теста для определения моделей PCD в эмбрионах или клетках различных генотипов или смотреть на общий эффект от применения определенных токсинов или лекарственной терапии. Кроме того, высокое отношение сигнал-шум краситель, простота использования (клеток или тканей может просто быть погружен), его способность быть установлены и выносливость флуорофора сделать использование LysoTracker идеально подходит для больших объемов скрининга клеток или тканей, которые могут обладать PCD.

Как и с любой тест для PCD, однако, контекст эксперимента важно, чтобы рассмотреть. Во время раннего эмбрионального мыширазвития, в отсутствии иммунной системы, умирают клетки могут быть фагоцитированы соседние клетки 22. Пока не известно, как быстро это происходит. Однако, так как можно найти TUNEL положительные puncta, которые не являются LysoTracker положительным (рис. 1G), клетки могут проходить на более поздних стадиях апоптоза (фрагментация ДНК), а затем удалены путем фагоцитоза. Когда TUNEL и перекрытия LysoTracker окрашивания, это может означать, что ячейки или фрагмент, содержащий фрагментированной ДНК в настоящее время фагоцитированы. Наконец, LysoTracker-положительным только puncta может указывать на сотовый мусора, который не содержит ДНК, но очищается от соседних клеток. Таким образом, во время раннего развития мыши, независимо от анализа (TUNEL или LysoTracker), окрашивание картина может указывать как клетки, которые умирают и соседние клетки, содержащие мусора.

Наши результаты (рис. 2A-C) показывают, что LysoTracker может быть очень полезной для оценкиПХБ в культурной дифференциации клеток ES, и поэтому, вероятно, будет полезно для различных культурных типов клеток. Интересно, что когда клетки стимулируются с H 2 O 2 к апоптозу, большинство TUNEL положительные puncta также LysoTracker положительным (рис. 2В ", 2С"). Это говорит о том, что в монослой культуры, соседние клетки могут по-прежнему быть в состоянии фагоцитируют около умирающих клеток. Действительно со значительно более высокой дозы H 2 O 2 (10 мм), подавляющее большинство клеток содержат TUNEL положительные puncta и относительно мало LysoTracker окрашивания, предполагая, что, когда так много клеток умирают, ни одна из них достаточно здоров, чтобы выступать в качестве не- профессиональных фагоцитов (данные не представлены). Важный момент, что не очень хорошо оценили, что независимо от того, анализа, это может быть трудно определить, если один смотрит на умирающего ячейку, которая имеет высокую активность лизосомальных или труп умирают клетки охвачен соседней клетки, особенно когдаклетки находятся в непосредственной близости.

LysoTracker также является полезным инструментом для оценки аутофагии 23-26 и в ответ на сывороточного голодания, дифференцированных клеток ES отображения заметное увеличение числа LysoTracker окрашивания puncta (ср. рис с 2D-2А). Это, вероятно, указывает на увеличение в формировании autophagolysosomes и лизосом в ответ на наличие питательных веществ уменьшились (как было показано в других контекстах использования LysoTracker 24,25). В отличие от TUNEL окрашивания, в то время как еще в значительной степени перекрывается с LysoTracker окрашивания, не сильно возрастает, что указывает, что, хотя клетки испытывали стресс от потери сыворотки, после 24 часов, это напряжение было не достаточно, чтобы индуцировать апоптоз.

Таким образом, одной оговоркой, чтобы рассмотреть (или потенциальное преимущество, в зависимости от того, что кто-то хочет анализа) является то, что в то время как LysoTracker можно отметить регионов апоптоза (умирающих клеток, а также соседейING непрофессиональных фагоцитов), он также может пометить клетки, в которых происходит аутофагии. Чтобы определить точный механизм PCD, то лучше сделать несколько анализов и если это возможно, использовать большое увеличение оптической или электронной микроскопии различать различные возможности. Таким образом, эти примеры показывают, что LysoTracker является отличным инструментом для оценки PCD но в контексте анализа должны быть тщательно проанализированы, так как LysoTracker положительные puncta может представлять собой увеличение лизосом активности в связи с непрофессиональным фагоцитоз или из-за аутофагии 27,28 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим членов Мариани лаборатории для помощи редактирования протокола. Эта работа финансировалась CIRM Докторантура Обучение Грант (JLF), стажировка CIRM BRIDGES (TZTT), Роберт Э. и мае Р. Райт Foundation (МКО) и Университета Южной Калифорнии (МКО).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen #L-7528
Hanks BSS Invitrogen 14025-076
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3
Vectashield VECTOR H-1200
DMEM Cellgro 10-013-CV
Non-essential amino acids Cellgro 25-025-CI
Sodium pyruvate Cellgro 25-000-CI
FBS Hyclone SH30071.02
Pen-Strep Invitrogen 15140-122
b-Mercapt–thanol, 50 mM Invitrogen 21985-023
LabTek-II Chamber slides
(8-well)		 Nalge Nunc International 154534
0.1% Gelatin Millipore ES-006-B
Dulbecco's PBS (D-PBS) Cellgro 21-031-CV

Solution Recipes

4% Paraformaldehyde

For 100 ml:

  1. Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH.
  2. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat.
  3. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml.
  4. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots.

WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling.

EB Culture Media

For 500 ml EB Media:

DMEM: 404.5 ml
FBS: 75.0 ml
L-Glutamine: 5.0 ml
Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml
Non-essential amino acids: 5.0 ml
Sodium pyruvate: 5.0 ml
β-Mercapt–thanol: 500 μl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
  2. Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
  3. Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  4. Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
  5. Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
  6. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  7. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  8. Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
  9. Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
  10. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
  11. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
  12. Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
  13. Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
  14. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  15. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  16. Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
  17. Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
  18. Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
  19. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  20. Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
  21. Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
  22. Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
  23. Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
  24. Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
  25. Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
  26. Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
  27. Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  28. Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).

Tags

Биология развития выпуск 68 молекулярной биологии биологии стволовых клеток клеточной биологии эмбрионов мыши эмбриональных стволовых клеток лизосом запрограммированная смерть клетки изображений звуковой еж
Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fogel, J. L., Thein, T. Z. T.,… More

Fogel, J. L., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (68), e4254, doi:10.3791/4254 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter