Modellen van bot metastase

Summary

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Abstract

Botmetastasen schering en inslag in verscheidene maligniteiten, met inbegrip van borst, prostaat en long. Eenmaal in bot, tumoren zijn verantwoordelijk voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit ^1. Aldus bestaat er een grote behoefte om de moleculaire mechanismen die de inrichting, groei en activiteit van tumoren in het bot begrijpen. Verschillende in vivo modellen zijn opgericht om deze gebeurtenissen te bestuderen en elk heeft specifieke voordelen en beperkingen. De meest gebruikte model gebruikt intracardiale inoculatie van tumorcellen aan de arteriële bloedtoevoer athymische (naakt) BalbC muizen. Deze procedure kan worden toegepast op vele verschillende types tumoren (zoals PC-3 prostaatkanker, longcarcinoom en muis uiervet pad tumoren), maar in dit manuscript richten we ons op de borstkankermodel, MDA-MB-231. In dit model gebruiken we een zeer bot-selectieve kloon, oorspronkelijk afgeleid in de groep Dr Mundy's in San Antonio ^2, dat hals inmiddels getransfecteerd voor GFP expressie en opnieuw gekloneerd door onze groep ^3. Deze kloon is een bot uitgezaaide variant met een hoog osteotropism en zeer weinig metastasen in longen, lever of bijnieren. Terwijl intracardiale injecties worden meestal gebruikt voor onderzoek naar bot metastase ^2, in bepaalde gevallen intratibial ⁴ of uiervet pad injecties zijn meer geschikt. Intracardiale injecties worden meestal uitgevoerd met menselijke tumorcellen met als doel de controle latere stadia van metastase, specifiek het vermogen van kankercellen om arresteren in botten, overleven, prolifereren en tumoren die zich ontwikkelen tot kanker geïnduceerde botziekte stellen. Intratibial injecties worden uitgevoerd als de nadruk op de relatie tussen kankercellen en bot na een tumor is uitgezaaid naar het bot, die ruwweg correleert met gevestigde gemetastaseerde botziekte. Geen van deze modellen recapituleert vroege stappen in het metastatische proces vóór embolie en vermeldingvan tumorcellen in de circulatie. Voor het controleren van de primaire tumorgroei of metastase van de primaire locatie aan het bot, dan uiervet pad inentingen zijn meestal de voorkeur, maar zeer weinig tumorcellijnen zal consequent aan het bot uitzaaien van de primaire site, met 4T1 bot-preferentiële klonen, een muis borstklier carcinoom, de uitzondering ^5,6.

Dit manuscript gegevens inoculatie procedures en hoogtepunten belangrijkste stappen in na inoculatie analyses. Specifiek omvat celkweek, tumorcel inoculatie procedures voor intracardiale en intratibial inentingen alsmede beknopte informatie over wekelijks gecontroleerd door x-ray, fluorescentie en histomorfometrische analyse.

Protocol

1. Cel Onderhoud

1. Veel botten uitgezaaide subklonen van MDA-MB-231 zijn gedefinieerd met variabele neiging tot bot kolonisatie en groei. Voor onze experimenten gebruiken kloon afgeleid van de GFP-gemerkte MDA-MB-231 ontwikkeld UTHSCA ^2. Deze specifieke sub-kloon vormen zichtbaar osteolytische botlaesies ongeveer 3 weken na inoculatie met opoffering na 4 weken.
2. Handhaven cellen in DMEM met 10% FBS en 0,1 mg / ml penicilline-streptomycine bij 37 ° C in 5-8% CO ₂ ^7.
3. Passage cellen bij 80-90% confluentie en re-plaat met een 1:10 verdunning (dit varieert afhankelijk van het celtype en de grootte plaat. Voor MDA-MB-231-cellen in een T-75 is ongeveer 6x10 ^5), die is ongeveer elke 72 uur.
4. MDA-MB-231 cellen een algemeen fibroblastische verschijning met talrijke pseudopodia. Elke afronding is indicatief overbevolking of andere ongewenste stress, en moet worden vermeden omdat ditkunnen beïnvloeden metastatisch potentieel in vivo.
5. Idealiter moeten de cellen in cultuur worden gehouden slechts kort voor enting (raden minder dan 1 week of totdat genoeg cellen voor het experiment) en een nieuwe injectieflacon worden ontdooid wanneer afronding of veranderingen in celgroeisnelheid optreden.

2. Celpreparaat

1. Trypsinize cellen bij 80-90% confluentie met 0,15% trypsine / EDTA (Gibco verdunnen 0,5% trypsine EDTA 1:2 in PBS). Deze concentratie maakt een snelle afscheiding (<2 min) en vermindert klonteren van de cellen.
2. Verwijder onmiddellijk cellen van plaat met 10 ml ijskoude DMEM met 10% FBS, pipet in 15 ml conische buis en gecentrifugeerd bij 200 xg gedurende 5 minuten.
3. Hersuspendeer pellet in een 50 ml conische buis in 25 ml ijskoude PBS (zonder Ca en Mg) en tellen.
4. Centrifugeer opnieuw pellet en resuspendeer in 10 ⁶ cellen per ml (intracardiale) of op 250.000 cells/10 pl (intratibial) in ijskoude PBS. De temperatuur van PBS is belangrijk om samenklonteren van cellen en achtereenvolgens embolie na injectie. De celsuspensie moet blijven op ijs tijdens het uitvoeren van injecties en levensvatbaar blijven en niet-klonteren gedurende 30 minuten. Hoewel de exacte vereiste aantal platen varieert van onderzoeker onderzoeker, We gebruiken een T-75 voor tussen 8-10 muizen.

3. Intracardiale Inoculatie

1. 4-6 weken oude vrouwelijke (Foxn nu-/ -: Harlan) muizen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel andere immuun-gecompromitteerde muizen (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID en etc.) kunnen ook gebruikt met menselijke kankercellijnen experimenten.
2. Het naakt muizen moet worden gevoed Teklad 2920x dieet 5-10 dagen voor injectie op mortaliteit door de injectie procedure te verlagen, en het verminderen van achtergrond fluorescentie in beeldvorming procedures (aangezien het eten is alfalfa gratis).
3. Bij gebruik van muizen dan nu / nu, verwijdert haar door het scheren of het gebruik van Nair (in onze ervaring Nair werkt beter) op ventrale buik area voordat procedure.
4. Verdoven muis in een isolatiekamer met een verdamper isofluraan (2,5% Iso: 2-3 l / min O ₂₎ of andere gewenste anesthesie (in onze ervaring is de beste isofluraan getolereerd intracardiale inentingen).
5. Verplaats een muis op een moment om de neuskegel van de anesthesie machine in een roestvrij stalen geventileerde kap.
6. Plaats elke muis op zijn rug met de borst naar boven.
7. Was de borst met een 10% povidon / jodium wattenstaafje / oplossing gevolgd door 70% ethanol, 2 keer herhalen.
8. Mark muis op de borst voor injectie (met behulp van een steriele marker of markering iets naar de kant te houden van de injectieplaats steriel). We maken gebruik van een teken locatie, halverwege het borstbeen en de bovenkant van xyphoid proces, en iets naar links (anatomische) van het borstbeen. Teken een luchtbel in de injectiespuit om ruimte tussen de plunjer en meniscus (belangrijk voor cardiale zien puls) van een 300 ui 28 g ½ insulinespuit maken enhet opstellen van 100 pi van de cellen.
9. Rechtop te houden naald. Houd de huid van de muis strak met de andere hand, steek de naald.
10. Succesvolle insertie in linker ventrikel moeten resulteren in een duidelijke rode heldere puls van bloed in de injectiespuit. Op deze diepte, zorgvuldig druk plunjer van de spuit (100 pl volume), zonder noemenswaardige beweging van de naald om te voorkomen dat aanprikken van de hart-of morsen cellen in de borstholte.
11. Na cellen worden geïnjecteerd, trekt op zuiger om een ​​kleine hoeveelheid negatieve druk te verminderen druipen van cellen in de borstholte maken.
12. Trek de naald direct uit de borst terwijl ze zeker het kantelen van de naald te voorkomen tijdens het verwijderen, die de bekleding van het hart kan scheuren en bloedingen veroorzaken.
13. Breng lichte druk op de borst op de injectieplaats om het bloeden te verminderen.
14. Verwijder de muis uit de neuskegel en blijven lichte druk gedurende ongeveer 1 minuut toe te passen.
15. Beweeg de muis om verwarming pad tot volledige conbewuste.
16. Als de muis begint te draaien of na herstel trillen, de waarschijnlijke oorzaak is een embolie. Intraperitonally injecteren muis met 80-120 mg / kg ketamine van de bloedstroom en het hartminuutvolume te verhogen terwijl het verminderen vaatweerstand. Dit zou moeten helpen met de muis langs de prop. Na dit gebeurt, is het beter om celpreparaten, omdat het aangeeft dat de cellen klonteren. We veranderen celpreparaten na ongeveer 8 muizen, of 30 minuten.

4. Intratibial

1. Injecteer muis met Buprenex (0,1 mg / kg) en dergelijke erkende analgetische onmiddellijk vóór procedure.
2. Verdoof muis met behulp van isofluraan, ga dan naar neuskegel en onderhouden van anesthesie.
3. Reinig beide benen met 10% povidon / jood swab / oplossing, gevolgd door ethanol, 2 keer herhalen. Epileren benen (met Nair of soortgelijk product) voor het reinigen of bont aanwezig.
4. Voorzichtig begrijpen laterale malleolus, mediale malleolus, en onderste helft van het scheenbeen met wijsvinger en thUMB, buig been (combinatie van flexie en exorotatie, zodat de knie zichtbaar en toegankelijk.
5. Bevochtig de huid met 70% EtOH om de zichtbaarheid van de onderliggende knieschijf ligament, wat zichtbaar moet zijn als een aparte, dikke, witte lijn te verhogen. Terwijl stevig grijpen enkel / been van de muis insert 28g ½ naald onder patella, door het midden van patella ligament, en in de voorste intercondylaris gebied in de top van het scheenbeen.
6. Bij het plaatsen van de naald in de tibia, zorgvuldig begeleiden bij groeischijf met behulp van stabiele, stevige druk met lichte boren actie.
7. Bij penetratie van scheenbeen groeischijf, zal de naald tegenkomen duidelijk minder weerstand.
8. Gebruik een zachte, zijdelingse beweging van de naald om ervoor te zorgen naald in het scheenbeen en door middel van de groeischijf. Beweging zal worden beperkt als de naald in de juiste plaats binnen scheenbeen.
9. Duw langzaam zuiger tot en met 10 ul van cel-oplossing injecteren. Weinig tot geen weerstand worden gevoeld op dit punt.
10. Slowly halen naald.
11. Volgens dezelfde procedure, gaan naar de volgende poot 10 pl PBS injecteren.
12. Verwijder de muis uit narcose en blijf verwarming pad tot hersteld.
13. Bewaken van de muizen in de komende 24 uur en injecteer met extra Buprenex elke 12 uur als de dieren nog steeds tekenen van nood tonen.

5. Imaging Time Cursus

1. Luciferase Imaging: voorkomend geval luciferase beeldvorming moet worden gebruikt beginnen op 7 dagen na tumorcel inoculatie (hoewel in de meeste botmetastasen modellen detecteerbaar dichter bij dag 14). Muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 150 mg / kg luciferin, verdoofd en afgebeeld 8 min na injectie met IVIS materiaal ^8.
2. GFP beeldvorming: Typisch GFP-expressie tumoren beginnen te detecteerbaar zijn rond dag 10 tot 14 voor intratibial injecties en 16-21 voor intracardiale experimenten met Maestro imaging-apparatuur (CRI) ^9. Kort werden muizen verdoofd met isofluraan (3%) En gehandhaafd onder verdoving door middel van een neuskegel in de Maestro beeldvorming kamer. Voor onze eGFP-expressie brengen we gebruik van de blauwe filter set (498 excitation/515 emissie voor eGFP) op 500 ms blootstelling in 10 nm stappen.
3. Faxitron (X-ray): X-stralen worden wekelijks afgenomen begint tussen dag 7 tot 14. Laesies zullen zichtbaar zijn in de intracardiale model op dag 21 en een week eerder in de intratibial injecties ^3. De radiografische gegevens voor ex vivo en in vivo werd verkregen met een Faxitron LX-60 bij 35 kV gedurende 8 seconden blootstelling.
4. Andere Imaging: Imaging modaliteiten wordt in zijn geheel gebaseerd op de specifieke onderzoek. Naast de hierboven beschreven werkwijzen, kunnen levende dieren beeldvorming op basis van 3D micro-tomografie (μCT), micro-positron emissie tomografie (μPET) en andere modaliteiten ^10,11 waardevolle informatie.

6. Muis Sacrifice

1. Elk model heeft een iets ander tijdsverloop. Met MDA-MB-231 cellen muizen meestal worden cachectische of dwarslaesie tussen 21 en 35 dagen en meestal rond dag 28 (IT geïnjecteerde muizen tussen 21-28 dagen).
2. Als meerdere muizen ontwikkelen laesies beginnen te breken door het corticale bot, paraplegic worden, of 10-20% van het lichaamsgewicht, alle muizen in onderzoek met ketamine / xylazine overdosering met cervicale dislocatie (of andere goedgekeurde methode IACUC) offeren verliezen.
3. Verwijder botten nodig voor verdere studie en opslaan in gebufferde 4% formaline.
4. Muizen met borst tumoren zijn een teken van een gemiste injectie en moeten worden uitgesloten van de studie.

7. Ex Vivo Analysis

1. μCT: scannen in 70% EtOH maakt structurele en histologische parameters te meten op dezelfde bot specimen.
2. Contour en analyseren naar individuele experimenteel ontwerp en de uitrusting ^10. Onze gegevens werden verkregen met een Scanco μCT 40 met behulp van 12 uM resolutie.
3. Histomorphometry: Proces exemplaren met behulp van bij voorkeur histologische methoden en kleuren met hematoxyline / eosine ⁷

8. Representatieve resultaten

Na intracardiale of intratibial inoculatie van tumorcellen (figuur 1) muizen worden wekelijks gecontroleerd door radiografie en fluorescentie (of luminescentie). Laesies gewoonlijk duidelijker worden door x-ray van week 2 en 3, terwijl ze zichtbaar door fluorescentie en luminescentie al week 2, afhankelijk van het model (Figuur 2). Laesies zichtbaar als een donkere gaten in het bot, en meer uitgesproken in de tijd (Figuur 3). Laesies werden gekwantificeerd met Metamorph analyse van röntgenfoto's en fluorescentie werd gekwantificeerd met behulp Maestro (CRI) beeldvorming acquisitie en analyse software. Als laesies beginnen te groeien, muizen vaak worden cachectische. Offer vereist wanneer muizen verloren 10-20% van hun aanvankelijke gewicht. De toestand van de muizen kunnen snel veranderen en gecontroleerd worden meerdere keren per dag. Tussen 3-4 weken muizen begonnen een of beide achterpoten slepen en de hele studie opgeofferd. Beelden werden genomen vóór offeren. Na verdoving overdosis werd bloed verzameld om markers van botmetabolisme of andere factoren te meten. Na cervicale dislocatie, de huid werd ontdaan van de muis en botten uitgesneden en schoongemaakt ex vivo imaging (figuur 3) die visualisatie van tumorfoci zal ten minste 7 dagen eerder dan in vivo imaging technieken. Zodra beeldvorming werd voltooid botten werden geplaatst in het label cassettes en opgeslagen in formaline voor fixatie en verdere histologische verwerking of μCT analyse. Histomorfometrie werd uitgevoerd op de monsters naar de tumorlast en BV / TV geven nadat μCT werd uitgevoerd op een tibia om de hoeveelheid botafbraak (figuur 4) te kwantificeren.

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Figuur 1. Juiste plaatsing van injectie. Ventrale radiografische weergave (A) van volwassen muis thorax geeft juiste plaatsing van de naald in ^de 4e intercostale ruimte en in de linker ventrikel van intracardiale inoculatie. Anatomische oriëntatiepunten worden weergegeven met horizontale stippellijnen op het borstbeen (een witte rand). Op de huid van de muis het borstbeen en xyphoid proces dienen als herkenningspunt, en de naald wordt ingebracht iets links van het borstbeen. Ventrale radiografische weergave (B) van volwassen muis been geeft juiste plaatsing van de naald in de proximale tibia, uitgelijnd tussen de condyli. Vanuit een laterale perspectief van de punt van de naald wordt geplaatst achter de tuberositas tibiae en diep om de epifysairschijven. Ideale locatie voor injectie wordt aangegeven door witte cirkel.

Figuur 2. Tijdsverloop van bot metastase modellen. Progressie van ca.ncer geïnduceerde botziekte weergegeven met x-stralen en GFP + fluorescerende beelden van tumoren in vivo door intratibial injecties (A) en intracardiale injecties (B).

Figuur 3. Tijdsverloop van intracardiale MDA-MB-231 model Bovenste rij:. Ex vivo beeld dat GFP-fluorescentie op dag 0, 14, 21 en 28 na intracardiale injectie van MDA-MB-231. Merk op dat de tumor foci op dag 14 zijn alleen zichtbaar in ex vivo na zachte weefsels te verwijderen. Onderste rij: Ex vivo radiografische beelden van dezelfde femora illustreren osteolytische botlaesies. Merk op dat botafbraak gewoonlijk niet zichtbaar tot 3 weken na injectie cardiale.

Figuur 4. Kwantificering van het bot metastatische progressie. GFP + tumor als gevisualiseerd door Maestro beeldvorming ex vivo van Tibiae van een niet-tumor dragende muizen (A) en een muis 4 weken na injectie van een intracardiale GFP expressie MDA-MB-231-subkloon (B). Tumorfoci correleren met gebieden van botafbraak zoals door Faxitron (D) ten opzichte van een bot zonder tumor (C). Bone structurele en minerale gegevens van microCT metingen wordt weergegeven als 3D-beelden van een gezonde bot (E) en een tumor dragende bot (F) als gebieden van botafbraak worden weergegeven als nietig gebied. Verdere bot en tumor detail gezien in H & E gekleurde histologische secties (G & H).

Discussion

Studies van tumor-geïnduceerde botziekte berusten op verschillende diermodellen waarvan de twee meest gebruikte zijn intracardiale en intratibial inentingen. In veel gevallen intracardiale is de beste optie voor het bestuderen van metastasen in het bot, maar het geeft niet het volledige metastatische proces, en dus uiervet pad of andere orthotope injecties moet idealiter worden gebruikt in de richting van dat doel. Tumorcellen niet gemakkelijk uitzaaien van de primaire locatie in de meeste studies met menselijke cellen, en zo ja, ze hoofdzakelijk uitzaaien naar de longen. Sommige stammen van de 4T1 cellen metastaseren naar bot ^5,6, maar de laesies kleiner, moeilijker te kwantificeren, en de cellen dan menselijke murine. Bovendien kan GFP expressie opwekken van een immuunrespons in immuuncompetente modellen waarbij 4T1 klonen vaak gebruikt die kan bemoeilijken langdurige studies metastase ^12. Andere modellen van tumor-geïnduceerde botziekte, zoals myeloom, gebruik maken van staartader injitingen ^13. Echter, zal deze aanpak niet werken voor vaste tumormetastase studies als het zal overweldigend zaad van de tumoren in de longen, waardoor de muizen van een longziekte sterven voordat het ontwikkelen van uitzaaiingen in de botten. Intratibial injecties algemeen minder gunstig dan de andere methoden gezien, omdat het niet leidt tot een model van metastase, maar de progressie van vastgestelde botmetastasen, en kan ontsteking veroorzaken op de injectieplaats. Toch is deze procedure nuttig eerste metastatische stappen en inrichting scheiden van de directe effecten op terminale kanker-geïnduceerde botziekte. Bovendien in het geval van vele prostate tumormodellen, is de enige manier die zorgt voor consistente tumorgroei in bone ^4.

De keuze van voor bewaking botziekte is als kritische specifiek voor de studie van de route van inoculatie. In onze groep maken wij gebruik van verschillende technieken, afhankelijk van de studie, thij meest voorkomende daarvan zijn x-ray, fluorescentie en histologie. Hoewel veel groepen overgebracht naar luciferase beeldvorming, hebben wij gevonden dat we minder botmetastasen met de luciferase-getransfecteerde cellen en dat we meer anatomische details met fluorescerende beeldvorming en gemakkelijker co-lokalisatie met x-stralen krijgen. Bovendien heeft directe vergelijking tussen modaliteiten niet toegeven een belangrijk voordeel om luciferase beeldvorming voor de vroege opsporing in het bot. Echter, elke groep uitvoeren van deze experimenten moet de bruikbaarheid van elke benadering voor hun studie geëvalueerd.

Bovendien, hoewel die in veel andere modellen, de gedetailleerde ex vivo analysetechnieken zijn aan bot. We gewoonlijk analyseren botverlies door μCT. Terwijl eveneens uitgevoerd om studies die normaal bot, wordt de analyse van tumor-dragende botten gecompliceerd door het frequent verlies of onderbreking van de groei plaat als marker. Histologische analyses ook enigszins genuanceerd in tumor-Dragende botten ten opzichte van protocollen ontwikkeld voor niet-tumor dragende botten en zachte weefsels. In dit protocol beperken we de beschrijving van de ex vivo analyses om focus te houden bij de meest gewoonlijk gebruikt door onze groep. Net als bij in vivo analyses, zal elke groep moeten bepalen welke aanpak het beste werken voor hun studie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells	Originally ATCC-Internally cloned and selected
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsin	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT scanner	Scanco
Athymic Nude Mice	Harlan	Fox nu -/-
Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Irradiated Rodent Diet	Teklad	2920x