Summary
この記事とそれに付随するビデオはオルガノイドユニットオン足場のアプローチを使用して、マウスにおける組織工学腸を生成するための我々のプロトコルを提示します。
Abstract
組織工学小腸（TESI）が正常に40日以内に術前の重みに戻り、その結果、大量の小腸切除後のルイスラットを救出するために使用されてきました。ヒトでは1、巨大小腸切除は、短腸症候群になる可能性があり、機能的な吸収不良非経口栄養依存性、肝不全や肝硬変、multivisceral臓器移植の必要性を含む重要な罹患率、死亡率、医療費を付与する。2本論文では状態、我々はマウスモデルにおける組織工学腸を作成するための我々のプロトコルを記述し、文書化多細胞オルガノイドユニットオン足場アプローチ。オルガノイドユニットは粘膜と間葉の両方の要素を含む腸由来の多細胞集合体、3腸管幹細胞ニッチを維持している間に関係があります。進行中および今後の研究では4日に私たちの技術の変遷マウスは、この種で利用可能なトランスジェニックのツールを利用することによってTESI形成の間に関与するプロセスの調査が可能になります。免疫不全マウス系統の5可用性はまた、私たちは人間の腸組織への技術を適用し、人間のTESIの形成を最適化することを許可しますヒトへの移行前にマウス異種移植。我々の手法は、すでに人間の患者での使用が承認された適正製造基準（GMP）の試薬および材料を採用していますので、脱細胞化された動物の組織に頼るのアプローチに比べて大きな利点を提供しています。このメソッドの究極の目標は、短腸症候群に対する再生医療の治療戦略としてのヒトへの翻訳である。
Protocol
1。オルガノイドユニットの準備
- マウスの解剖（はさみや鉗子）のための適切なインスツルは、オートクレーブにより滅菌しなければならない。
- 人道的に地元の動物実験委員会のプロトコルに従ってドナーマウスを安楽死させる。動物が進む前に死んでいることを確認してください。
- 腹膜腔へのアクセスを得るために正中切開を行います。露出を改善するために必要なスキンフラップは反映させることができます。
- 小腸を骨抜きとトライツ靱帯のすぐ遠位で割ります。シャープで優しい鈍的切開を使用して、その腸間膜から小腸を分離します。回盲部を識別し、これに近位小腸5ミリメートルを分割します。
- はさみを使用して、（インビトロジェン、アンチアンチ）10ミリリットル4℃、無菌ハンクス緩衝生理食塩水（HBSS、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）/ 1X抗生物質抗真菌薬でシャーレに腸間膜反対側縁に沿って長手方向にソリューションを腸を開きます。で開かれ、腸から糞便をクリア穏やかに撹拌し、次に4の10ミリリットル℃、滅菌HBSS / 1X抗抗15ミリリットル遠心チューブに開いた小腸を転送します。
- 4の10ミリリットル℃、試験管内抗抗滅菌HBSS / 1Xで開か腸を3回洗浄します。各洗浄は30秒間、15ミリリットル管の軽度の揺れを用いて行うことができる。振とう後、腸組織はチューブの底に沈む。間葉系デブリである浮遊物質を、捨ててください。ピペットで慎重に洗浄溶液を除去します。
- 4の10ミリリットル℃、はさみを使用して1mm未満正方形片に抗抗滅菌HBSS / 1Xとペトリ皿の中で洗浄した腸にミンチ。自動ピペットでミンチ材料を集め、試験管に入れます。
- 8分間500rpmでチューブを遠心分離します。脂肪と間充織含む上清を捨てる。
- 滅菌HBSS / 1X抗抗プラス0.125 mg / mlのディスパーゼ（Invitrogen）および800単位/ mの10mlでみじん切り、洗浄した物質を消化リットルコラゲナーゼタイプ1（ワージントン、レイクウッドニュージャージー州）。消化溶液40mlを準備するには、ディスパーゼ、コラゲナーゼの142 mgを5 mgを秤量し、40mlの体積に滅菌HBSSを加算します。新たに各時間オルガノイドユニットが用意されているこの溶液を調製し、使い4℃まで、準備完了状態に保つ。ステップ1.8からペレットに直接消化溶液を追加します。
- 20分間37℃で消化液でみじん切り、洗浄材料を含有する試験管をインキュベートする。
- 試験管を取り出し、さらに10mlのピペットを用いて磨砕することによって消化された組織を混乱させる。均一な外観が得られるまで、20から50回の間で繰り返します。
- 800 rpmで5分間試験管を遠心分離します。単一細胞を含む上清を捨てる。
- 4℃、滅菌したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Invitrogen）にプラス10％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（HI-FBS、Invitrogen）を10mlの消化反応を停止します。ペレを再懸濁しトンとチューブを横に振る。
- 800 rpmで5分間試験管を遠心分離します。最後の数滴まで、自動ピペットで注意深く上清を取り除きます。ペレットを再懸濁し避けるために最後の数滴のための使い捨てのプラスチックピペットを使用しています。
2。ポリグリコール酸の足場のロード
- 不織布、ポリグリコール酸（2mmの板厚、60mgのcm-3の嵩密度、気孔率> 95％、コンコルディア繊維、コベントリー、RI）からフォームが2 mm長、5 mmの外径が円筒形の足場文献に記載されているよう。 4。
- 蒸留水に70％エタノールを用いて調製し、ハサミで転倒使い捨て千マイクロピペットの先端2mmをトリムします。
- 4ウェル培養プレートに足場を置きます。第1のルーメンにしてから、外側の表面に、1000マイクロリットルピペットで足場上オルガノイドユニットをロード。内腔の被覆を確実にするためにピンセットを使用しています。妨害したり、ポリマーの円筒形状を開いて壊してはいけません。
3。ホストマウスへの移植
- 可能な場合はドナーと同じ背景に同系宿主マウスを使用してください。それ以外の場合は、（ジャクソン研究所、サクラメントカリフォルニア州）、免疫不全非肥満糖尿病/重症複合免疫不全またはNOD / SCID動物を採用しています。
- イソフルランで全身麻酔を誘導する。 、prepを剃るとマウスの腹部をドレープ。
- 腹膜腔への入り口を得るために5ミリメートル正中切開を行います。識別し、慎重に大網を骨抜きにする。大網上にロードされたポリマーを置き、ティッシュで包んでください。大網が破れないようにしてください。
- 5から0 monocryl縫合糸で大網にポリマーを固定します。そっとその解剖学的位置に包まれたポリマーと大網を交換してください。
- 4から0ビクリル縫合糸を使用して、レイヤーで腹部切開を閉じます。筋肉の閉鎖を実行し、切開下腹部内臓を傷つけないように注意してください。肌のために中断された縫合糸を使用して、。
- 切開に隣接皮下膨疹として滅菌水で2 mg / kgのケトプロフェン（Ketofen、フォートダッジ·アニマルヘルス）による術後鎮痛を管理します。動物を毎日評価されるべきであり、動物が痛みや苦痛の徴候を実証されている場合は、ケトプロフェンの追加投与は術後2日目に投与してもよい。術後3日目までに、動物は完全に痛みや苦痛の証拠なしで回復されるべきである。痛みや苦痛は、術後3日目に続く場合は、これは異常とみなされ、動物実験委員会及び動物飼育施設のプロトコールに従って対処すべきである。
- 静養するには、マウスや組織工学腸が4週間にわたって成長させる。 Septra 200ミリグラム/ 1:100希釈で5ミリリットル当たり40ミリグラム（ハイテクPharmacal、アミティニューヨーク州）とげっ歯類（ラボダイエット5001、PMIニュートリション、セントルイス、ミズーリ州）と水に動物の不断のアクセス権を与えます。
4。収穫
- フーマーnely 4週間注入した後、宿主動物を安楽死させる。
- 元の切開をもう一度開いて、腹膜腔へのアクセスを容易にするために頭の方にスキンが反映されています。
- 筋層を開き、組織の地球儀として組織工学構築物を識別します。
- 鋭い解剖を用いて腹腔内内臓からコンストラクトに癒着を降ろす。
- 取り付け後パラフィンホルマリンでコンストラクトを修正するか、そのようなリアルタイムPCRまたはタンパク質の単離などの生化学的アッセイのための新鮮な組織を使用しています。
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Representative Results
図1は、ここに記載されたプロトコルの全体的なスキーマを示しています。このプロトコルの最終的な結果は、地球やルーメン、粘膜、粘膜下組織と組織工学マウス小腸の球状の構造になっており、筋図2Aを囲むと、原料ポリマー足場と比較して、典型的な地球を、 図2（b）は、同じ構造を表示します急激にその内腔を明らかにするためにbivalved 図3は培養4週間後の典型的な成功したコンストラクトのヘマトキシリン/エオシン染色したパラフィンマウント断面を示しています。献。 4、我々は時間の首尾よく89％（44インプラントの39アウト）組織工学腸を作り出すことができました。
失敗したコンストラクトはない粘膜の形態の一つである。それは、地球が最後の組織学的分析で粘膜を持っているかどうかの収穫時の肉眼的形態に基づいて判断することは不可能である。したがって生化学的アッセイはperformeある場合新鮮なコンストラクト組織上のdは、それぞれ地球の半分が固定し、パラフィンは、粘膜、各試料中に存在することを確認するために、組織学的分析のためにマウントする必要があります。失敗したコンストラクトは、ヘマトキシリン/エオシン染色でのみストロマと線維化を実証します。
図1マウスにおける組織工学腸の生産のためのスキーマ。簡単に説明すると、ドナー組織がオルガノイド単位に収穫され、処理されます。オルガノイドユニットは、その後、ホストに移植し、4週間インキュベートする多孔性ポリグリコール酸足場、上にロードされます。人工構築物を取得され、組織学的または生化学的アッセイを経由して特徴付けることができる。
図2：組織工学腸の例は、4週間で収穫構築。 ：コンパで構築ポリマー足場を開始するrison。 B：同じ構築物は、その内腔を明らかにするbivalved。
図3標準的な正常組織工学腸コンストラクトの低消費電力ヘマトキシリン/エオシン顕微鏡写真。ラベルと矢印は、腸粘膜、接着ホスト膵臓と内腔を示す。
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Discussion
我々はオルガノイドユニットオン足場のアプローチを用いて、マウスにおける組織工学腸を製造するためのプロトコルを提示。最も重要なステップは、オルガノイドユニットの準備のものです。ケアを十分に清掃し、機械的に組織を処理するために注意しなければなりませんが、消化が行われた後、平等なケアを行う（ステップ1.11）オルガノイドユニットをoverdigestまたはovertriturateないように注意する必要があります。これが完了しているなら、オルガノイドユニットがステップ1.12の上清中に失われる可能性がある単一の細胞に減少し、組織工学腸を生成するために生き残る可能性は低いことができ、腸の幹細胞ニッチとして、この中に保存されないケース。
マウスのサイズが小さいことは、それが直接、生体内でその機能をテストするために宿主動物の腸に構築する組織工学吻合することに挑戦することができます。あるいは、ラットは 、in vivo で吻合容易TESIの成長のための大きいモデルを表しており、既にこのような理由1のために実行されています。他の人がこれらの動物で小腸切除と吻合、6または直腸肛門手術、7を実行することができたとして、それにもかかわらず、マウスの大きさは、克服できない障害物はありません。これらの問題に対処するために、in vitroの方法で私たちの組織工学腸コンストラクトの機能を特徴付けるための実験が進行中である。この手法には、追加の制限がTESI 4世代の89％の成功率が含まれています。つまり、組織単位（OU）ロードされた足場の89％が成功しTESIを生成します。他者によるこの技術のアプリケーションが100％に全体の収量を増加させるこの手法を改良·改善に役立つことがあります。生成された総組織質量を増加させることができた場合にも、この技術は改善されるかもしれません。現在、フローサイトメトリーは、収穫TESIコンストラクト中に存在する細胞の総数が注入で数存在するよりも3倍大きいことが実証されています（3.07×10 6±0.5×10 6）4。 TESIの生産量を改善することが治療への変換に向けた重要なステップです。
我々は、マウスの腸が、非常に薄肉かつ小口径のある、そのような豚やラットなどの他の種のものと比較して処理することが特に容易であることにも注意してください。ヒトでは、我々はオルガノイドユニットの準備手順の詳細の一部が消化液との時間のディスパーゼ、コラゲナーゼの濃度は、両方の適切な組織を消化し、単一細胞に過剰消化を避けるため、特にに修正されなければならないことを期待で、37℃にて消化
この技術の究極の目標は、ヒトの治療への遷移です。患者自身の組織からヒトの腸の組織工学は、潜在的に既存の治療法の欠点のnoneを指定して、短腸症候群（SBS）のため耐久性があり、長期的な治療法を提供することができます。短腸SYNドロームは、その吸収能力を大幅に低減され、患者が経腸栄養から十分な栄養を得ることができないように小腸の長さの合計は、通常より大きい50から75パーセント、かなりの割合の切除によって引き起こされる病態であり、図2で子どもたちは、SBSの最も一般的な原因は、あまり一般的ではないけど8,9はまた、SBSが原因クローン病の設定で複数の切除の成人に発生する可能性があります。中腸軸捻転による壊死性腸炎、または回転異常症に続発する大規模な小腸切除であるか、と血管疾患に続発する腸間膜虚血。10,11 SBSの患者が経腸摂取と十分な栄養を維持することはできませんので、肝不全や肝硬変で子供に複雑になることがあります自体長期完全静脈栄養を必要とするかもしれない12のSBS患者は、したがって重要耐える医療費は、最近、患者一人当たり160万ドル程度であると推定さSBS続発する腸障害に対するケアの5年間で13の現在の標準は、腸、肝臓/腸、または他のmultivisceral移植であるが、これは60％しか5年生存率を与え、免疫抑制療法の生涯コースに患者を委託14さらに、需要と供給と長い待ち時間では避けられない不一致の限られたドナー臓器の可用性の結果は図15したがって、患者の自家組織から組織工学は魅力的な代替手段であろう。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
トレイシーC. Grikscheit、エリック·R·バーセル、フレデリック·G·サラは、カリフォルニア再生医療研究所（CIRM）、助成番号RN2-00946から1（TCG）とTG2-01168（ERB、FGS）によってサポートされています。アリソン·L·シュペーアは大学外科エチコン学者の協会です。 Yashuhiro Torashimaは小児病院ロサンゼルスサバン研究所研究キャリア開発奨学金によって賄われています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
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