Summary
Мы описываем быстрого выделения первичных мышиных тип II альвеолярных эпителиальных клеток (AECII) методом проточной цитометрии отрицательного отбора. Эти AECII показывают высокую жизнеспособность и чистоты и подходят для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований в отношении их роли в респираторных заболеваний, таких как аутоиммунные и инфекционные заболевания.
Protocol
Подробная информация о необходимых реактивов и материалов, перечисленных в таблице в конце протокола ниже. Перед началом работы, подготовить 15 мл трубки (по одному на мышь), содержащий 4 мл диспазы и предварительно нагреть их до 37 ° С на водяной бане. В нагревательный блок, вскоре нагревать небольшие аликвоты 1% легкоплавкой агарозы (в воде) до 95 ° C, пока сжиженный, а затем охлаждают до 45 ° C до использования.
1. Подготовка мышь легких
- Жертва мыши, CO 2 удушья. Примечание: Не выполняйте смещения шейных позвонков, так как это повредит трахеи, так что следующие шаги протоколов, таких как установка легких жидкость, не может быть выполнена успешно. Убедитесь, потеря ноцицептивных рефлексов.
- Спрей мыши с этанолом и сделать длинный разрез вдоль вентральной срединной линии тела. Потяните брюшной меха и кожи, а затем и аккуратно вырезать и удалить брюшины.
- Обескровитьмышь за счет сокращения левой и правой яремной вены (Vena jugularis), а также почечной артерии (Arteria renalis). Удалить течет кровь с ткани.
- Осторожно прокола, а затем удалить диафрагму, чтобы открыть сердца и легких путем срезания ребер. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не повредить легкие.
- С 26G канюли и 10 мл шприц, заполненный холодным фосфатным буферным раствором (PBS), прокол правого желудочка сердца и заливать легких с PBS до бесплатного крови.
- Вырезать и удалить слюнные железы, чтобы разоблачить трахеи. Также аккуратно вырезать мышцы окружающие трахею.
- Вставьте канюлю 22G пребывающего в трахею, извлеките иглу и нажать на пластиковый катетер к легким. Закрепить катетер, связывая небольшой кусочек пряжи вокруг трахеи и катетер.
2. Ферментативного расщепления ткани легких
При желании, бронхоальвеолярного лаважа образцы жидкости может бытьподготовленный промывки легкие через катетер, введенный в трахею с PBS или среднего до следующего шага.
- Использование 2 мл шприц, тщательно привить максимальный объем 2 мл диспазы (от 4 мл аликвоты) в легких через катетер, чтобы все лепестки раскрываются полностью. Заменить шприц с 1 мл шприц, содержащий 0,5 мл сжиженного агарозы, а также вселить в легких.
- Оставьте шприц катетера для предотвращения обратного потока из агарозы и сразу покрытия легкого с лабораторией бумаги и льда. Пусть агарозном геле в течение нескольких минут.
- Снимите салфетку, лед, шприцы и катетеры, сократить трахеи и акцизных легких, сердца и вилочковой железы из груди. Затем промыть легких в блюдо с PBS и удалить сердце, вилочковой железе и оставшиеся трахеи.
- Положить легких в оставшиеся 2 мл диспазы и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 мин.
3. Подготовка легкихСуспензии клеток
- Удалить из легких диспазы и передать его в чашку, содержащую 7 мл anti-CD16/32 антитела (1 мкг / мл конечная концентрация) в среде DMEM и 100 мкл ДНКазы.
- Используя щипцы, полностью разрушаются ткани легких, потянув ее на части и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре, мягко покачиваясь на рокера составляет 200 оборотов в минуту. При желании, суспензии клеток можно хранить при температуре 4 ° C до следующего шага.
- Фильтр клеточной суспензии через нейлоновые сетки сначала с 100 мкм, а затем с 70 мкм, 48 мкм и 30 мкм поры. Позаботьтесь, чтобы промыть каждой сетки, а также труб и посуда тщательно DMEM, чтобы минимизировать потери клеток и увеличить доходность. Если вы объединения образцов, это может быть достигнуто здесь в дальнейшем прохождение клеток суспензии от мышей одной группы через тот же фильтр. Обновление фильтра в случае засорения.
- В зависимости от объема, передает фильтрата с одним или более 50 мл пробирок ицентрифуге в течение 15 мин при 160 мкг и 4 ° C. Удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (0,15 М NH 4 Cl, 0,01 М KHCO 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2) и быстро прекратить лизис путем добавления 13 мл среды DMEM. Перенесите раствор в 15 мл трубки и центрифуги в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
4. Окрашивание антител для проточной цитометрии Cell-сортировкой
- Ресуспендируют клеток в 3 мл первичного коктейль антител, подготовленный в среде DMEM в разведении подходит для проточной цитометрии. (Антитела были ранее титровать для оптимальных рабочих разведений путем окрашивания 1 х 10 6 спленоцитов в объеме 100 мкл. 3 мл использование первичных коктейль антител содержащих оптимальные концентрации для каждого из используемых антител к клеткам объединения с пяти мышей. Если больше мышей, объединяют в одном образце, регулировать громкость).
- Для окрашивания, инкубировать клетки в течение 10 минут в темнотепри 4 ° C.
- Вымойте клетки путем заполнения 15 мл трубки с DMEM среде и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
- В случае несвязанных или биотинилированные антитела были использованы в 4.1: Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 2 - 3 мл вторичном коктейль антител. Пятно в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
- Вымойте клетки путем заполнения трубы с DMEM и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл DMEM и фильтр предварительной очистки через 50 мкм фильтр в трубе для мобильных сортировки. Дополнительно: Считаем клетки, чтобы получить общее количество клеток в суспензии клеток легких.
5. Cell-сортировка
- Смешать клеток путем перемешивания до сортировки. Используйте 100 мкм насадка для клеточной сортировки AECII. Оболочка давления жидкости, а также лазерного излучения и обнаружения длин волн зависят от инструментов, используемых для проточной цитометрии клеточного сортировки, а также флуорохромы используется в Антибоды окрашивания процедура.
- Ворота на SSC высококачественных элементов, которые являются негативными для флуорохромы используется для окрашивания и сортировки в пробирке, содержащей DMEM. Используйте вперед разброс высоты (FSC-H) по сравнению области (FSC-A) и в сторону разброс высоты (SSC-H) по сравнению области (SSC-A) окна, чтобы исключить любые дублеты или клеточных агрегатов (подробнее см. строб-стратегии в Рисунок 1).
- В целях сбора отсортированных клеток центрифуге в течение 20 мин при 280 мкг и 4 ° C.
- Ресуспендируют клеток в культуре среднего или буфера, необходимого для последующего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При сортировке клеток легких суспензий изолированы от здоровых мышей, ворота AECII, как правило, составляет около 42 ± 10% от всех событий. Этот процент может быть значительно ниже, если мышах с респираторными заболеваниями, такими как вирусные инфекции используются, в качестве начальной суспензии клеток будет содержать значительно выше доля лимфоциты и другие клетки иммунной системы на работу в дыхательные пути. Для AECII изолированы от IAV инфицированных легких на 3-й день после заражения мы наблюдали снижение частоты клеток в ворота AECII примерно на 50%.
Типичный вид, а также повторный анализ отсортированных клеток изображено на рисунках 1 б, 1 в. Как указано, чистоту изолированных клеток составляет примерно 92 ± 5%. На рисунке 2а, мы показываем, что для успешного разделения чистых популяций клеток может быть подтверждена путем окрашивания для поверхностно-активные белки C, которая выражается исключительно16 AECII, 17.
Мы заметили, что количество AECII изолированных на одного животного сильно зависит от используемого штамма мыши. В то время как BALB / с мышами обычно дает 1 х 10 6 AECII / мышь, C57Bl / 6 штамм только дает 1 - 3 х 10 5 AECII / мышь. Количество мышей использовали в эксперименте, следовательно, зависит от мышей штамма, а также тип последующего анализа должны быть выполнены.
Что касается жизнеспособности получить AECII, мы обычно находим жизнеспособность на уровне 90% по итогам проточной цитометрии клеточного сортировки. Такая высокая доля жизнеспособных клеток затем позволяет прямое функционального анализа, а также краткосрочные культуры изолированных первичных мышиных AECII.
Рисунок 1. Обзор оверсия стробирования стратегии, используемые для проточной цитометрии изоляции первичных мышиных AECII отрицательной селекции. (A) схематический обзор за стробирования стратегии. (B) представитель участков подвески рода клетки легких. (C) представитель результат повторного анализа отсортированных клеток. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Характеристика и молекулярный анализ отсортированы первичных мышиных AECII. (A) Cytospins отсортированных AECII окрашивали для поверхностно-активного вещества протеина С (SPC). По сравнению с фазово-контрастной микроскопии, почти 100% клеток были признаны положительными SPC. (B) представитель РНК профиль отсортированы первичных мышиных AECII после того, как РНК-изоляцией. Конкретные пики для 18S и 28S рибосомальной РНК вместе с расчетным фактором RIN представляют собой РНК-я ntegrity и качества нетронутыми изолированной РНК из AECII.
Рисунок 3. Анализ вируса гриппа А нуклеопротеида (NP) выражение в первичных мышиных AECII изолированы от зараженных мышей. C57Bl / 6 мышам вводили интраназально фосфатный буферный раствор или вирус гриппа А PR8/A/34 на 1, 2 или 3 до изоляции AECII . (A) представитель участки легких клеточной суспензии из незараженных, а также трехдневный инфицированных мышей C57Bl / 6 окрашенных для сортировки. (B) Грипп выражение NP вируса в отсортированном AECII были проанализированы с помощью внутриклеточного окрашивания NP-специфических антител и последующее потока цитометрии. (C) В таблице приведены средние интенсивности флуоресценции (MFI) НП окрашивания.
Рисунок 4. Анализ вируса гриппа А нуклеопротеида (NP) выражение в бывших естественных условиях заражены первичных мышиных AECII. (A) представитель потока цитометрии бывших естественных условиях вирус гриппа А заражены PR8/A/34 AECII от внутриклеточного окрашивания для вируса гриппа А NP 6 часа после инфицирования. (B) Резюме представитель результатов NP-окрашивания бывших естественных условиях вирус гриппа А заражены AECII 6 ч после заражения с различными разведения вируса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол для выделения мышиных AECII с помощью проточной цитометрии предлагает быстрый способ доступа к первичной клетки из легких мышей целый ряд функциональных и молекулярных исследований. Описанная процедура дает весьма жизнеспособной и чистых популяций AECII, достаточные количества прямых последующего анализа, такие как выделения РНК (см. рисунок 2b) и транскриптом исследований. Для функциональных приложений, также можно культуре изолированных клеток, что позволяет, например, генерация AECII кондиционированной среды или со-культуры экспериментов. В пользу специально для этих функциональных исследований, изоляции первичных клеток путем отрицательного отбора, как описано здесь дает нетронутыми клетки, которые не были предметом связывания антител. Однако, несмотря на преимущества обучения в основной AECII над теми, выполняются в клеточных линиях, существуют практические ограничения на использование этих первичных клеток. Рядом с простым ограничением в цифрах, Которые могут не соответствовать требованиям исследований, требующих обширных отбора, первичной AECII выжить в культуре только для ограниченного времени, которое мы наблюдали в среднем около 48 часов. В этих краткосрочных экспериментов культуры, мы основывали выбор культуральной среды на характер последующего анализа AECII кондиционированной среды был использован в и добились удовлетворительных результатов с IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Кат. № 31980) с добавлением 10% FCS, стандартные антибиотики и 0,25 мМ β-меркаптоэтанола.
В протоколе описано здесь отображается относительно легкий и быстрый способ выделения жизнеспособных и чистой первичной мышиный AECII в хороших номеров. Чистоту дали клетки после разделения критически зависит от процедуры клеточной сортировки. Ясное и сильное окрашивание клеточных популяций, которые должны быть исключены не менее важно, как строгие стробирования на SSC мероприятий высокого уровня, так что загрязнения с лимфоидных клеток, а также типЯ эпителиальные клетки сведены к минимуму. Что касается выхода разделенных клеток, мы обнаружили, что это максимально обширной промывка труб, фильтров сеток и пластин в процессе подготовки сырой суспензии клеток, а также полный распад тканей после ферментативного расщепления. Одна из основных выгод работы с первичной AECII том, что они могут быть выделены непосредственно от хозяев, страдающих заболеваниями дыхательных путей. Такие AECII будет были выставлены все факторы присутствуют в их естественной микро-среды, и поэтому хорошо отражают ситуацию в естественных условиях. В отличие от человека AECII 18, 19, это может быть распространен на широкий спектр экспериментальных систем при работе в мышиной модели. Мы были воспользоваться этим в исследованиях, касающихся аутоиммунного воспаления, а также вирусные инфекции легких. Таким образом, мы обнаружили, что AECII от мышей, страдающих от CD4 + Т-клеточный воспаления дыхательных выражать широкий спектр inflammatТеория гены, которые демонстрирует свои возможности для регулирования легких иммунный ответ 3. Кроме того, мы смогли показать, что дисплей AECII аутоантигенов через главного комплекса гистосовместимости класса II молекул, что приводит к функциональной активации автоматического реактивных CD4 + Т-клеток. В то же время AECII поддержания легкого толерантности, пряча факторы, способствующие индукции Foxp3 + регуляторных Т-клеток 4.
Что касается вирусных инфекций легких, мы успешно изолированы от основной AECII мышей, инфицированных вирусом гриппа. Как упоминалось выше, здесь AECII счет на меньшую долю всей суспензии клеток легких, а значительное количество иммунных клеток набирают в легкие, в ответ на инфекцию (см. рисунок 3а). Внутриклеточного окрашивания вируса гриппа А нуклеопротеида (NP) в изолированных клетках, свидетельствует о растущей выражение вирусного белка в течение времени, как показано в
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить М. Höxter для оказания технической помощи в сортировке первичных мышиных AECII от уровня биобезопасности 2 пробы.
Эта работа была поддержана грантами от Немецкого исследовательского фонда (DFG) в БД (SFB587, TP 12 и BR2221/1-1) и стипендию от Ганновера биомедицинских исследований Школы (DFG GSC 108) до AA. DB поддерживает инициативу Президента и сети Фонда имени Гельмгольца немецких научно-исследовательских центров (HGF) по контракту W2/W3-029 номер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
|||
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
