Summary
Abstract
העין המורכבת של דרוזופילה melanogaster מורכב מכ 750 אומטידיה (עיני יחידה). כל אומטידיום מורכב מכ 20 תאים, כולל תאי מפרישי עדשה חרוט, תאי פיגמנט, תאי זיפים ושמונה photoreceptors (PRS) R1-R8 2. הפורטוריקנים יש מבנים מיוחדים, microvillar את rhabdomeres, המכילים פיגמנטים רגישים לאור, את Rhodopsins (RHS). את rhabdomeres של שישה הפורטוריקנים (R1-R6) בצורת טרפז ומכיל Rh1 3 4. את rhabdomeres של R7 ו R8 מוצב במקביל במרכז הטרפז ולשתף אותו הנתיב של אור. R7 והפורטוריקנים R8 stochastically להביע שילובים שונים של RHS בשני תתי סוגים עיקריים 5: בתת סוג 'P', בעמ 'Rh3 R7s היא בשילוב עם Rh5 בעמ R8s, ואילו בתת הסוג "Y", בRh4 y R7s קשור RH6 בy R8s 6 7 8.
מפרט מוקדם של הפורטוריקנים ופיתוח של אומטידיה מתחיל בדיסק זחל עיני מחושים הדמיוני monolayer של תאי האפיתל. גל של בידול חולף על פני הדיסק 9 ויוזם את ההרכבה של תאים לא עברו התמיינות לאומטידיה 10-11. 'תא המייסד' R8 מצוין ראשון ומגייס R1-6 ולאחר מכן R7 12-14. לאחר מכן, במהלך התפתחות גלמים, בידול יחסי הציבור מוביל לשינויים נרחבים מורפולוגיים 15, כולל היווצרות rhabdomere, synaptogenesis וסופו של דבר ביטוי RH.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות מוגדרות של התפתחות רשתית, אשר יכול להיות מיושמות על מנת לטפל במגוון רחב של שאלות הנוגעות להיווצרות רשתית ומסלולי התפתחות. כאן, אנו משתמשים בשיטות אלה כדי להמחיש את בידול יחסי הציבור ההדרגתי ברמת התא בודד בכל הר זחל, midpupal ומבוגרות רשתיות (
Protocol
1. מבוא
בסרטון הזה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות התפתחותיות מוגדרות: 3 instar הזחל, midpupal ושלב המבוגר. למרות שהפרוטוקול שלנו פועל גם עבור שלבי גלמים אחרים (לפרטים על שלבים מוקדמים יותר, ראה 16), בחר בשלב midpupal, כפי שהוא אופטימלי להדמיה כל הפורטוריקנים במישור מוקד אחד והגרעינים שלהם הם קל לזיהוי, המאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של גורמי שעתוק. הנתיחה של גלמי רשתיות מאוחר דומה מאוד לנתיחה של רשתית בוגרת.
ראשית, אנו מדגימים כיצד לאסוף זחלים וגלמים בשלבים הרצויים. אז, תסבירו כיצד להשיג נתיחות אופטימליות של זחל 17-18, midpupal ורשתיות בוגרות. שנית, אנחנו מדגימים איך לדמיין פיתוח יחסי הציבור בשלבים אלה באמצעות מיקרוסקופיה confocal ואימונוהיסטוכימיה.
s = "jove_title"> 2. בימוי ועריכת הדגימה
תקופת ההתפתחות של חרקים היא טמפרטורה תלויה. כדי להקל על היערכות לשחזור של זחלים וגלמים, אנו ממליצים להעלות את כל המניות לטוס ב25 ° C במחזור 12 hr/12 שעתי אור / חושך.
זחלים שלישי instar: כ 96 שעות לאחר הטלת ביצה (ב 25 ° C), האכלה מאוחר 3 instar זחלי תחנה ולשוטט על קירות בקבוקון המזון, שבו הם בסופו pupate. השתמש במברשת רכה או מלקחיים עדינים המסיר את זחל נדודים השלישי instar מקיר בקבוקון מזון.
גלמי 50% ('midpupae') הם נצפו כ 48 שעות לאחר התגלמות. לעיתוי מדויק, אתה יכול להקיף גלמים לבנים בנויים רק עם סמן על בקבוקון מזון. לחלופין, להעביר את כל הגלמים הלבנים לבקבוקון חדש לקבלת בקבוקון של בימוי אחיד (לבימוי של גלמים תוך שימוש בקריטריונים מורפולוגיים, ראה 19). לאחר 48 שעות, בזהירות remאובת midpupae מהבקבוקון שמשתמש במלקחיים.
זבובים בוגרים: זבובים להרדים מבוגרים צעירים (2-5 ימים לאחר eclosion) על משטח CO 2. הסר את הראש באמצעותו מלקחיים ולאחסן אותם בכוס כן קערה ובה הקר 1x PBS.
3. נוהל דיסקציה (1-2 שעות אודות לניסוי)
לאחר איסוף הדגימה, למקם אותם בטיפה הקרה PBS על צלחת נתיחת Sylgard. לנתח על 10-15 רשתיות לגנוטיפ.
נא להתייעץ את גיליונות בטיחות חומרי נתונים, כמו גם הבריאות והסביבה של המוסד שלך ומשרד ביטחון לטיפול הולם של החומרים כימיים והציוד (ראה טבלאות בסוף הפרוטוקול זה).
1. דיסקים דמותי Eye זחל
- אתר את הקצה הקדמי של הזחל, המכיל את הקרסים בפה. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ על החלק האמצעי של הזחל בעדינות בבסיס של מנת Sylgard. השתמש anothאה מלקחיים כדי לתפוס את קרסי הפה ומשוך בעדינות ובאיטיות מהגוף. השלך את החלק העיקרי של הגוף, ולהשתמש באיברי הפה כדי להחזיק את החלק הקדמי כדי להסיר רקמות מיותרות מהדיסקים הדמיוניים שנותרו צמוד למוח.
- העברת מוח עם דיסקים דמותי ידי תופס את קרסי פה עם מלקחיים ל1x PBS בצלחת זכוכית של שלוש טובה. לבצע שלב קיבעון (שלב 4.1.).
- לאחר קיבוע, להסיר בלוטות רוק, רקמת שומן ומושך את המוח מהדיסק הדמיוני עיני המחושים. כדי לשפר את הנגישות של נוגדנים 'קשים', קרום peripodial, הנמצא על פני השטח של האפיתל, ניתן להסיר על ידי לחיצה רצופה על חלק המחושים של הדיסק וקילוף הקרום משם עם סיכה לנתח. בשלב בא, לבצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).
2. התגלמות / Midpupal רשתיות 50%
- החזק קצה אחורי של מקרה גלמים עם מלקחיים.סור בעדינות את המשטח הקדמי של מקרה הגלמים שנאחז בציפורן עם מלקחיים עוד ולהתרחק באיטיות מpuparium. לקלף ציפורן שיורים לחשוף את הראש.
- השתמש בעצות של המלקחיים כדי לדקור את השק הבסיסי, הרך באזור הקדמי הגבה. זה מספק גישה לראש. עדינות להפריד את הראש מבית החזה על ידי מציצה לאט את הראש עם פיפטה P20. לגרש את הראש מקצה פיפטה לתוך קר הטרי 1x PBS והסרת רקמה עודפת; לתפוס את הציפורן ולהסיר את ראש חוטם. המשך לצעד קיבעון (שלב 4.1.).
- פירס האונה האופטית עם סיכת ביתור 1 כדי לייצב את הרקמות. הכנס את הסיכה לנתח האחרת בין lamina והרשתית להיפרד מרשתית lamina / האונה אופטית. בצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).
3. עיניים מבוגרות
- תפוס את מרכז כמוסת הראש האחורית עם מלקחיים ולהסיר חלקי פה (חוטם), tiss שומןue וtracheae.
- תפוס את הציפורן עם הראש הגבה 1 מלקחיים ולהשתמש בזה כדי להפריד את עיניים מרקמת המוח על ידי משייכתו בעדינות צידה. ברוב המקרים, lamina, נדן דק ושקוף של neuropil המוח, יישאר מחובר לרשתית. זה קל יותר להסיר את lamina לאחר קיבוע.
- הסרת ציפורן בשולי העין, אבל להשאיר חתיכה קטנה מאחור כדי להקל על העברת רשתיות לפתרונות שונים. לבצע קיבוע (שלב 4.1.).
- הסר את lamina ידי תופס אותו בצד אחד עם מלקחיים ומושכים בעדינות צידה עם מלקחיים האחרים מבלי לפגוע ברשתית. הסרת ציפורן שיורים, כפי שאפשר לקפל לתוך הרשתית במהלך ההרכבה. שני צעדים אלה הם קריטיים להמחשת photoreceptors, שאחרת היה מוסתר על ידי lamina ושרידים של ציפורן במהלך תהליך ההדמיה. המשך אל אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).
4. קיבעון וwashing (אודות 1 שעות)
- אחסן את הרשתיות הגזורות ב1x PBS בכלי זכוכית גם שלושה מונחים על קרח בזמן הכנה טריה מקבעים (לדלל 40 microliters של 37% פתרון פורמלדהיד עם 360 μl של 1x PBS, מערבולת וחנות על קרח). אנו ממליצים להמשיך בפרוטוקול הקיבעון ולהימנע מזמני אחסון ארוכים על קרח (> 15 דקות).
- החלף 1x PBS עם 200 μl של 3.7% פתרון פורמלדהיד. ודא הרקמה שקועה במקבע. זה קריטי, כפי שהוא עשוי אחרת לא ניתן לתקן כראוי. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר וtracheae עם המלקחיים.
- דגירה על ייקר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- החלף מקבעים עם 1x PBS ולשטוף פעמים עם 1x PBS. המשך כביסה ב PBS למשך 30 דקות (שבייקר, בטמפרטורת חדר).
- החלף PBS עם PBST. שטוף פעמים עם PBST.
- המשך בהסרת קרום peripodial מדיסקי זחל עיניים (3.1.3). וlaminas מרשתיות midpupal / מבוגר <חזק> (3.2.3., 3.3.4.).
5. אימונוהיסטוכימיה
- חסימה: החלף PBS עם 200 μl של סרום הנורמלי של 5% בPBST ולדגור רשתיות במשך 20 דקות על שייקר בטמפרטורת חדר.
- החלף פתרון חסימה עם פתרון נוגדן ראשוני. לאטום את הצלחת שלוש היטב עם parafilm ודגירת הלילה בייקר בטמפרטורת חדר.
- החלף פתרון עם PBST ולשטוף 3 פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של 1 שעה שבייקרה בטמפרטורת חדר.
- העברה בפתרון שני נוגדנים ולדגור בצלחת parafilm אטומה היטב בכוס שייקרו לילה בטמפרטורת חדר.
- החלף פתרון נוגדן עם PBST ולשטוף שלוש פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של שעה אחת שבייקר בטמפרטורת חדר. הדגימות יכולות להיות כל זמן בPBST במשך כמה ימים, אבל זה קריטי להוסיף PBST טרי לפחות פעם ביום כדי למנוע מהם להתייבש.
6. Mounting
- להרכבת עדשות של זחל וmidpupal, השתמש P20 להעביר רשתיות למרכז שקופית זכוכית נקיה. הסר PBST העודף. השתמש במלקחיים כדי ליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה.
- הוסף 10 μl של הרכבה בינונית על גבי הרשתית. לכסות אותם בעדינות עם פתק כיסוי 24x40-1 וחותם עם לק השקוף.
- למבוגרי רשתיות הרכבה, להכין 'הגשרים' 20: להוסיף שתי טיפי μl 5 של גליצרול 50% בשני הקצוות של צד זכוכית ולכסות אותם בתלושי כיסוי 22x22-1 (0.13-0.17 מ"מ עובי).
- הסר את PBST עם פיפטה P20; לוודא שהרשתית לא תתייבש. הוסף 20 μl של הרכבה בינונית עד טוב. השתמש בינוני גובר להעביר רשתיות עם P20 לשקופית 'הגשר' הזכוכית.
- השתמש במלקחיים כדי לכוון (עדשות צריכות להתמודד שקופיות זכוכית) וליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר עם P20.
- לאטמקום להחליק כיסוי 24x40-1 (0.13-0.17 מ"מ עובי) מצד אחד על גבי וקצוות חותמים עם לק השקוף או נייר דבק. דגימות חנות ב 4 ° C בתיבת שומר שקופית מיקרוסקופ (לשמור בחושך).
7. נציג תוצאות
כדוגמה ליישום של פרוטוקול זה, אנו מראים תוצאות יציגות להמחשת בידול photoreceptor בשלושת שלבי ההתפתחות בוידאו. דיסק עיני מחושי זחל ורשתית midpupal הוכתמו נוגדנים מטביעים סוגי photoreceptor שונים במהלך התפתחותם (איור 1 א ', ב') ורשתית מבוגר הייתה מוכתמת בשני נוגדני rhodopsin לדמיין שתי תת photoreceptor (התרשים 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. פתרון בעיות
מניסיוננו, נתיחות דורשות תרגול (עד מספר שבועות) והם הקלו על ידי השגת עמדת יד נוחה של 21 על נח את המרפקים ואמות על השולחן ובאצבעות יצירת קשר עם צלחת הניתוח. אצבעות בדרך זו, רק אגודלים, אינדקס ובינוניים לבצע תנועות עדינות.
הסרת lamina מבלי לפגוע בקולטני האור היא כנראה הצעד המאתגר ביותר. עיסוק עם wildtype אדום עיניים עף ראשון לפני ביתור מוטנטים לבני עיניים, כlamina הוא הרבה יותר קל לראות נגד פיגמנטציה העיניים האדומות. כמו כן, להשתמש בתאורה מאחור ורקע כהה מתחת לצלחת לנתיחה כדי להשיג ניגוד אופטימלי.
עם זאת, העיניים האדום הוא הפיגמנט ניאון ויכול לגרום לרקע גבוה במהלך תהליך ההדמיה. זה יכול להחליש את האותות מהנוגדנים מהשניים. אסטרטגיה טובה היא keep שטיפת הרשתיות למבוגרים עבור ארבעה עד חמישה ימים ולהחליף את פתרון כביסה עם PBST טרי לפחות פעם ביום. הפיגמנט יהיה דהוי; הקפד לשטוף גנוטיפים ניסיוניים ושליטה לאותו המשך הזמן.
2. יישומים
פסד ועיניים ספציפיות רווח-of-פונקציה מתקרב 22 23 להפוך את עין תסיסנית מערכת חזקה במיוחד למניפולציות ומסכים גנטיים. יתר על כן, שיטות חישוביות שפותחו לאחרונה לניתוח תא בודד ב3D שחזורים של רשתית שלמה מאפשרות ניתוח של פנוטיפים מוטציה ברזולוציה גבוהה 24. פרוטוקול זה ולכן ניתן ליישם במגוון רחב של שאלות הנוגעות להתפתחות עין ואת מנגנוני הפיקוח הבסיסי 16,25-28.
האיור 1. שלם מ 'רשתיתounts בשלושה שלבי התפתחות שונים. ) דיסק דמיוני עין זחל מוכתם בנוגדנים נגד שבע עד (ירוק) וננס (מגנט). B) רשתית Midpupal. שני נוגדנים להשתמש כדי להמחיש את כל photoreceptors R1-R8 (Elav, כחול) וR7 photoreceptors (פרוספרו, ציאן). ג) רשתית למבוגרים. ביטוי סטוכסטיים וסותר של פיגמנטים רגישים Rh5 (ציאן) וRH6 (אדום) בשני תת סוגים של קולטני אור R8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת Ehrman לח.י.. ח', קרן ג'יין קופין צ'יילדס זיכרון למלגת דוקטורט מחקר רפואית לRJJ, NIH F32EY016309 גרנט לDV, מלגת ניו יורק של דיקן אוניברסיטה לעבודת דוקטור DJ, GrantR01 NIH EY13010 לתקליטור ואחוות DFG לJR (RI 2208/1- 1). אנו מודים לנינה וגט ופמלה Boodram להערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F.
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
