Summary
Kort visuell beskrivning av den kirurgiska tekniken och anordning som används för leverans av (gen och cell) terapier in i ryggmärgen. Tekniken demonstreras i djuret, men är helt översättas och för närvarande används för tillämpning på människor.
Abstract
Detta är en kompakt visuell beskrivning av en kombination av kirurgisk teknik och anordning för leverans av (gen och cell) terapier in i ryggmärgen. Medan tekniken visas i djuret, är det förfarande som FDA-godkänd och för närvarande används för stamcellstransplantation i de ryggmärg hos patienter med ALS. Medan FDA har erkänt proof-of-principle-data om den terapeutiska effekten i mycket präglas gnagarmodeller, är användningen av stora djur anses avgörande för att validera en kombination av ett kirurgiskt ingrepp, en enhet, och säkerheten för ett slutligt terapi för humant bruk . Storleken, anatomi och allmänna sårbarhet ryggraden och ryggmärgen av svin redovisas i bättre modell människan. Dessutom är den kirurgiska processen för att exponera och manipulera ryggmärgen samt stänga såret i grisen nästan omöjlig att skilja från den humana. Vi tror att den friska grisen modellen representerar en kritiskcal första steget i studiet av förfarandet säkerhet.
Protocol
1. Djuranvändning
Rutiner visade häri har godkänts av Emory University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Kvinna Göttingen minigrisar väger cirka 15-20 kg används.
2. Anestesi
Djuren får fasta ungefär 12 timmar före operation. Djur sedering och anestesi induktion består av en cocktail av intramuskulär Ketamin (35 mg / kg), acepromazin (1,1 mg / kg), och Atropin (0,04 mg / kg). Djuren intuberades därefter och hölls på syre och 1-3% isofluran narkos. Vid denna punkt, är rygg och huvud av varje djur rakades. Anestesidjup övervakas av veterinärer. Avsaknad av interdigitala, ögon-och ögonlocksreflexer samt hjärt-och andningsfrekvens, pulsoximetri, direkt / indirekt blodtryck, end-tidal av koldioxid mätningar och muskeltonus / svar på skadliga stimuli används för att övervaka djup av anestesi.
3. Positionering
Djur förs till operationssalen och placeras i en liggande position på en ram anpassad för att efterlikna patienter positionering på en Jackson spinal operationsbord. Ramen utnyttjar justerbara selar som placeras under bröstet och bäckenet av djuret, så buken hänga fritt och därför minimerar trycket på buken och bröstet och därmed epidural venös blödning (figur 1). Ramen ger också extern fixering av ryggraden för förfarandet 1.
Dessutom djuren placerades på en uppvärmd återcirkulerande dyna för att bibehålla kroppstemperaturen och en öronvenen kateter för fluid administration och eventuella nödvändiga läkemedelsavgivning under operation. Slutligen kirurgiska området prepped med alkohol och Chlorhexadine eller Betadine lösning och operationsdukar placeras på det kirurgiska området.
le "> 4. LaminektomiEn ca 10-15 cm hudsnitt utförs och paraspinal muskulaturen dissekeras bort ryggraden bilateralt. Därefter är en dorsal flera nivåer laminektomi utförs. Lamina och spinosus processer tre kotor överliggande C3-C5 eller L2-L4 segment avlägsnas med användning av rongeurs och en kirurgisk borr.
5. Placering av Spinal Derrick
Vi kallar Spinal Derrick enheten konstruerad för leverans av (gen och cell) terapier in i ryggmärgen 2-5. Ingående diskussion om utformningen och utvecklingen av denna enhet kan hittas på Riley et al., 2011. 4
Att fästa anordningen till patienten, är perkutana tjänster placeras genom 1cm hudincisioner över och under den primära snitt och monterade på lamellen ovanför och nedanför den primära snittet.
Därefter två integrerade sårhakar fäst till four perkutana inlägg ovanför och under snittstället att exponera den del av ryggraden som har genomgått laminektomi.
6. Dural Opening
Med hjälp av ett Woodson dentalverktyg och en 11 blad, är en 2,5 cm snitt görs genom duran, exponerar ryggmärgen. Dura reflekteras bort från det pial skiktet med 4-0 Nurolon sutur och fäst till den djupa paraspinal muskulatur.
Kirurgiska biffar placeras i rostral och kaudala extrema öppningen. Dessa ger en partiell barriär mot cerebrospinalvätska flöde och även ge en säker mål för kirurger att placera rotskott utan att skada sladden. Hos människor, enligt operationsmikroskop förstoringsgraden pial ytan dissekerades vid denna punkt. På grund av tekniska begränsningar är denna procedur inte krävs eller genomförbart i djur.
7. Spinal Cord injektioner och sidoförskjutning av Spinal Derrick för ytterligare injektions
Omedelbart före injektioner, är en bolus av Metylprednisolon (125 mg, IV) ges för att förhindra ryggmärgen svullnad.
Vid denna punkt, är plattformen järnvägssystemet fäst och sidoskenorna justeras för att passa den lämpliga längden. Gondolen är topp-lastas på 2 bar och Z-enheten är monterad på kardanknuten. Därefter laddade kanylen placeras på Microdrive. Använda kardanknuten på mikroinjektion plattformen, de koronala och sagittala vinklar justeras för att säkerställa en bana vinkelrät mot ytan av de spinala Injektioner följer placeringen av kanylen. Nålen placeras följaktligen medialt till den dorsala ingångszon (DREZ). Den DREZ identifieras enligt 3,5 X kirurgisk lupp förstoring och trängde på en ortogonal bana på sladden ytan i en punkt <1 mm medialt.
Hos människor, ger en preoperativ MRI en baslinje bedömning Of ryggmärgen mått för operativ planering. Dessutom är tjockleken av ryggmärgen för att bestämma målet djup ventrala hornet.
Suspensionen infunderas på ett djup av 4 mm från pial kontakt. En fläns gjord av Ultem plast tjänar som en propp på pia yta för att förhindra nålen från att avancera djupare än önskat. När nålspetsen är placerad på målet, är den styva metall yttre hylsa dras upp, vilket den flexibla slangen exponeras. När injektionen är avslutad, är nålen kvar på plats under ytterligare 1 min för att förhindra cell återflöde upp kanylen injektionen tarmkanalen.
Försiktighet iakttas för att undvika ytan kärlsystem av något justera mikrostationen antingen lateralitet eller Rostro-kaudalt. Vissa blödningar från penetration webbplatser kan förekomma. När en sådan blödning uppstår, är mikro biffar placeras över blödande punktionsställe och sug appliceras på dem för att suga blod ur kanylen penetrtion webbplats och förhindra ackumulering i sladden. Detta möjliggör tillförlitligt för blodet att koagulera. Kauterisation undviks liksom direkt tryck.
Efter nål bort, är stereotaktisk apparat flyttades till nästa målplatsen längs Rostro-caudal axeln, åtskilda av 2 eller 4 mm eller som är nödvändiga för att undvika synliga blodkärl på den dorsala ytan av ryggmärgen. Denna process upprepas så många gånger som föreslås i en given studie.
8. Flytande kanyl
En anpassad infusionskanyl av liten diameter används för injektioner. Kanylen består av en 30-gauge avfasade nål av fast längd ansluten till en 30-gauge böjlig silastiskt slang av variabel längd. Den distala änden är försedd med en Hamilton luer lås som är ansluten till en pump microinjector. Den proximala silastic slangen ensheathed inom en 24-gauge styv yttre kanylen som platser på den proximala änden av kanylen fläns. Denna fläns båda sätenaden yttre kanylen och tjänar som en djup stopp för injektionsnålen. För varje injektion lämplig volym av en terapeutisk upphängning infunderas med en hjälp av en i förväg kalibrerad MINJ-PD microINJECTOR pump (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) med en hastighet av 5 ^ per minut.
9. Stängning
När alla injektioner har gjorts, är det spinala borrtornet försiktigt bort och snitten är stängda i fyra skikt. Dura stängs med hjälp av en 4,0 Nurolon stygn, i en vattentät sätt. 0 Vicryl sutur används för djup muskulär skiktet. Fascia stängs sedan med 0 Vicryl sutur också i en vattentät sätt. Det dermala lagret slutligen stängs med 2,0 Vicryl med rakstygn. Hud stängning avslutas med en 3-0 nylonsutur.
10. Återvinning och Smärtbehandling
Djur extuberade och övervakas under 2 timmar efter anestesi återhämtning. Därefter djuren överförs till enskilda Cåldrar och kontrolleras minst en gång per dag för mat konsumtion, defekation och urinering.
För smärtlindring är ett transdermalt fentanyl plåster (75 mikrogram) häftade på baksidan av djuren för tre dagar av postoperativ smärtlindring. Dessutom kan Buprenorfin (0,05 mg / kg, bud, IM) också ges i upp till tre dagar postoperativt.
11. Resultat och representativa Outcomes
Kliniska och beteende observationer utförs före operation och därefter registreras på dag 1 till 7 och varje vecka tills slutpunkten enligt studien design. Behavioral uppgifter samlas in för att bedöma neurologiska sjuklighet som tidigare beskrivits 6. Sensorisk funktion bedöms av närvaro eller frånvaro av ett tillbakadragande svar på mekanisk stimulans till tårna hos främre och bakre ben. Motorik följer Tarlov poäng (tabell 1): 0 - Förlamning, ingen rörelse, 1 - märkbar tonus i bakbenen, lätt movement, 2 - rörelse i bakbenen, men inte kan sitta eller stå, 3 - Förmåga att stå och gå, men ataktisk och under korta perioder, 4 - Fullständig återhämtning, normal motorik.
Säkerhet vid förfarandet bestäms av förmågan hos ett djur att återgå till föroperativa baslinjen. Övergående neurologiska underskott bör främst lösa mellan postoperativa dagarna 1 och 7, med vissa variationer beroende på djurens raser och förfarande (antal injektioner, bland andra parametrar). Permanent sjuklighet definieras av varaktiga neurologiska underskott som inte löser med tiden djuren når IACUC standard slutpunkt (Figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
| Tarlov Betyg | |
| 0 | Förlamning, ingen rörelse |
| 1 | Märkbara tonus i bakbenen, liten rörelse |
| 2 | Rörelse i bakbenen, men inte kan sitta eller stå |
| 3 | Förmågan att stå och gå, men ataktisk och under korta perioder |
| 4 | Fullständig återhämtning, normal motorisk funktion |
Tabell 1. Tarlov Betyg. Neurologisk sjuklighet och återhämtning bedöms genom poängsättning djurets motorik.
Figur 1. Tabell Positionering för GÅNGe. Djuren placeras i en liggande position på en ram anpassad för att efterlikna patienter positionering på en Jackson spinal operationsbord. Ramen utnyttjar justerbara selar som placeras under bröstet och bäckenet av djuret, så buken hänga fritt och därför minimerar trycket på buken och bröstet och därmed epidural venös blödning. Ramen ger också yttre immobilisering av ryggraden för förfarandet.
Figur 2. Motorik Bedömning och utfall representant. Djuren genomgår en allmän neurologisk undersökning före operationen och regelbundet efter fullständig återhämtning från förfarandet. Gång och motorisk funktion bedöms enligt Tarlov poäng. Denna skala ger objektiva kriterier bedöma djurens förmåga att pendla som surrogate mätning av motorisk funktion. Säkerhet vid förfarandet bestäms av förmågan hos ett djur att återgå till föroperativa baslinjen. Övergående neurologiska underskott bör främst lösa mellan postoperativa dagarna 1 och 7, med vissa variationer beroende på djurens raser och förfarande (antal injektioner, bland andra parametrar). Permanent sjuklighet definieras av varaktiga neurologiska underskott som inte löser med tiden djuren når IACUC standard slutpunkt.
Kompletterande
Vid cellterapi, före laminektomi och under anestesi, en jugularven 10F kronisk kateter (åtkomsttekniker, CCPS072106A) placeras för intravenös administrering av immunsuppressiva under hela studien. Halsen av djuret prepped och draperas. Den inre halsvenen exponeras kirurgiskt och kanylerades med katetern, som är fäst med en 3-0 sidenslips. Den proximala änden av den inre halsvenen är denn ligeras med en 3-0 sidenslips. Därefter är katetern tunnlas ur nackskinnet dorsalt och säkras med 3-0 nylon stygn. Slutligen såret bevattnade och stängs med en löpande 3-0 nylon stygn. Sådant förfarande krävs inte hos människa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots godkännande att gå vidare med den beskrivna tekniken hos människor 7-9, kritiska frågor återstår att besvaras för att ryggmärgen behandlingar för att lyckas. En noggrann förståelse av ryggmärgen tolerans mot intraparenkymal injektion krävs för att göra det möjligt för planering och genomförande av försök att utveckla behandlingar för demyeliniserande, degenerativ och traumatisk ryggmärgen sjukdom. För närvarande finns det ingen klar uppfattning om antalet injektioner som stora däggdjur ryggmärgen tål utan övergående och bestående morbiditet. Likaså är avståndet injektioner skulle kunna påverka sjuklighet. Dessutom makroskopiska (t.ex. ventilation-relaterade eller oavsiktlig patientrörelser) och mikroskopisk (dvs svängning med både ventilation och hjärt puls) ryggmärgen rörelser innebära risker för ryggmärgen under injektion. En förståelse av tröskeln för sjuklighet i en stor djurmodell kommer att hjälpadosering beräkningar för alla spinal program sladd terapi. Vår translationell ryggmärgen transplantation laboratoriet är tillgänglig för att hjälpa prekliniska utvecklingsprogram för alla lag nu designa försök för ryggmärgen applikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Boulis är uppfinnaren av enheter för att möjliggöra säker och noggrann injektion av människans ryggmärgen. Neuralstem, Inc. har köpt en exklusiv licens till denna teknik. Dr Boulis fick en invento andel av denna avgift, och har rätt till royaltybetalningar för distribution av denna teknik. Andra författare har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Emory University Avdelningen för Animal Resources personal för veterinärvård. Finansieringskällor är: ALS Association, försvarsdepartementet och Neuralstem, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
