Summary
Kurze Beschreibung der visuellen chirurgische Technik und Vorrichtung zur Lieferung von (Gen und Zelle) Therapien in das Rückenmark verwendet. Die Technik ist in dem Tier nachgewiesen ist aber völlig übersetzbar und derzeit für die Verwendung beim Menschen verwendet.
Abstract
Dies ist eine kompakte optische Beschreibung einer Kombination von chirurgischen Technik und Vorrichtung zur Lieferung von (Gen und Zelle) Therapien in das Rückenmark. Während die Technik in dem Tier nachgewiesen wird, ist das Verfahren FDA genehmigt und derzeit für Stammzellentransplantation in die Rückenmark von Patienten mit ALS verwendet. Während die FDA proof-of-principle Daten über die therapeutische Wirksamkeit in hoch dadurch Nagermodellen erkannt hat, wird die Verwendung von großen Tieren als kritisch für die Validierung der Kombination aus einem chirurgischen Eingriff, einer Vorrichtung, und der Sicherheit einer abschließenden Behandlung zur Anwendung beim Menschen . Die Größe, Anatomie und allgemeine Anfälligkeit der Wirbelsäule und des Rückenmarks der Schweinegrippe sind besseres Modell des menschlichen anerkannt. Darüber hinaus ist das chirurgische Verfahren zum Belichten und Manipulieren des Rückenmarks sowie Schließen der Wunde im Schwein praktisch nicht vom Menschen. Wir glauben, dass das gesunde Schwein Modell eine kritische stelltcal erste Schritt bei der Untersuchung des Verfahrensrechts Sicherheit.
Protocol
Ein. Einsatz von Tieren
Verfahren hierin gezeigt wurden von der Emory University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt worden. Female Göttingen Minipigs einem Gewicht von ca. 15-20 kg verwendet werden.
2. Anästhesie
Die Tiere werden etwa 12 Stunden vor der Operation fasten. Tierische Sedierung und Narkoseeinleitung bestehen aus einem Cocktail von intramuskulären Ketamin (35 mg / kg), Acepromazin (1,1 mg / kg) und Atropin (0,04 mg / kg). Tiere werden dann intubiert und instand zu halten Sauerstoff und 1-3% Isofluran Narkose. An diesem Punkt wird der Rücken und Kopf eines jeden Tieres rasiert. Narkosetiefe wird durch die tierärztliche Personal überwacht. Fehlen interdigital, Hornhaut-und Augenlidreflex sowie Herz-und Atemfrequenz, Pulsoximetrie, direkt / indirekt Blutdruck, endexspiratorischen Kohlendioxid-Messungen und Muskeltonus / Reaktion auf Schmerzreize werden verwendet, um Tiefe zu überwachen der Anästhesie.
3. Positionierung
Tiere sind in den Operationssaal genommen und in eine Bauchlage auf einem Gestell speziell entwickelt, um Patienten Positionierung auf einer Jackson Wirbelsäule OP-Tisch zu imitieren. Der Rahmen nutzt einstellbare Schlingen, die unter der Brust und Becken des Tieres angeordnet sind, so dass der Bauch frei hängen und somit die Minimierung Druck auf den Unterleib und Brust und konsequente epidurale venösen Blutungen (Abbildung 1). Der Rahmen bietet auch externen Immobilisierung der Wirbelsäule für das Verfahren 1.
Zusätzlich werden die Tiere auf einem erhitzten rezirkulierenden Pad platziert, um die Körpertemperatur und eine marginale Ohrvene für Fluid-Verabreichung und etwaige erforderliche Wirkstoffabgabe während der Operation katheterisiert aufrechtzuerhalten. Schließlich wird das Operationsfeld mit Alkohol und Chlorhexadin oder Betadine Lösung präpariert und chirurgischen Tüchern auf dem Operationsfeld angeordnet.
le "> 4. LaminektomieEin etwa 10-15 cm langen Hautschnitt durchgeführt und der paravertebralen Muskulatur wird von der Wirbelsäule seziert bilateral. Als nächstes wird eine dorsale mehrstufigen Laminektomie durchgeführt. Die Lamina und Dornfortsätze drei Wirbel darüberliegenden C3-C5-oder L2-L4-Segmente werden unter Verwendung rongeurs und einen chirurgischen Bohrers.
5. Die Platzierung des Spinal Derrick
Wir nennen Spinal Derrick die Vorrichtung zur Lieferung von (Gen und Zelle) Therapien in das Rückenmark 2-5 gestalten. Ausführliche Diskussion über das Design und die Entwicklung dieses Gerät kann auf Riley et al., 2011 gefunden werden. 4
Um die Vorrichtung an den Patienten zu sichern, werden durch perkutane Beiträge 1cm Hautinzisionen oberhalb und unterhalb der primären Einschnitt platziert und montiert an der Lamina oberhalb und unterhalb der primären Einschnitt.
Als nächstes werden zwei integrierten Retraktoren zum fo befestigtur perkutanen Beiträge oberhalb und unterhalb der Einschnittstelle, um den Bereich der Wirbelsäule, der Laminektomie unterzogen wurde freizulegen.
6. Dural Opening
Mit Hilfe eines Woodson Dentalwerkzeugs und einer Klinge 11 wird ein 2,5 cm Schnitt durch die Dura gemacht, Belichten des Rückenmarks. Die Dura weg von der Pia-Schicht unter Verwendung 4-0 Nurolon Nahtmaterial reflektierten und an der tiefen paraspinalen Muskulatur.
Chirurgische Patties sind in den rostralen und kaudalen Extremen der Öffnung platziert. Diese stellen eine teilweise Barriere gegen Zerebrospinalflüssigkeit Strömung und auch eine sichere Ziel für den Chirurgen, um ohne Beschädigung der Saugnäpfe Schnur platzieren. Bei Menschen unter Operationsmikroskop Vergrößerung wird die Pia-Oberfläche an dieser Stelle seziert. Aufgrund technischer Einschränkungen, ist dieses Verfahren nicht erforderlich oder möglich ist bei Tieren.
7. Spinal Cord Injektionen und seitliche Verschiebung der Wirbelsäule Derrick für zusätzliche Injections
Unmittelbar vor der Injektion wird ein Bolus von Methylprednisolon (125 mg, IV) gegeben Rückenmarks Schwellungen verhindern.
An diesem Punkt wird die Plattform Schienensystem befestigt und die Seitenschienen werden eingestellt, um die entsprechende Länge zu passen. Die Gondel ist auf die 2 Bars Top-geladen und der Z-Antrieb basiert auf dem Kreuzgelenk montiert. Weiter wird das beladene Kanüle auf dem Microdrive platziert. Verwendung des Kardangelenks auf der Mikroinjektion Plattform sind die koronalen und sagittalen Winkel eingestellt, um eine Trajektorie orthogonal zur Oberfläche des spinalen Injektionen folgen die Platzierung der Kanüle zu gewährleisten. Die Nadel wird entsprechend positioniert medial der Spinalganglien Eingangszone (DREZ). Die DREZ unter 3.5X chirurgischen Lupenvergrößerung identifiziert und auf einem orthogonalen durchdrungen Flugbahn zu dem Kord Fläche an einem Punkt <1 mm medial.
Beim Menschen stellt eine präoperative MRT eine Grundlinie Beurteilung of Rückenmarks Abmessungen für die operative Planung. Darüber hinaus ist die Dicke des Rückenmarks gemessen, um die Tiefe des Ziels Vorderhorn bestimmen.
Die Suspension wird in einer Tiefe von 4 mm von pialen Berührung infundiert. Ein Flansch des Ultem Kunststoff dient als Anschlag auf der Pia Oberfläche, um die Nadel aus Vorschieben tiefer als erwünscht zu verhindern. Sobald die Nadelspitze an der Zielstelle positioniert ist, wird der starre Metall Außenhülse hochgezogen, so dass der flexible Schlauch ausgesetzt. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, wird die Nadel an Ort und Stelle für eine zusätzliche 1 min zu Zelle Reflux bis die Kanüle Injektion Trakt zu verhindern links.
Es wird darauf geachtet Oberfläche Gefäßsystem durch eine leichte Anpassung der Microdrive entweder Lateralität oder rostro-kaudal zu vermeiden. Einige Blutungen vor dem Eindringen Seiten auftreten. Wenn solche Blutungen angetroffen wird, sind Mikro-Bratlinge über die Blutungen Einstichstelle platziert und Sog auf sie angewendet, um Blut Docht aus der Kanüle Penetration vor Ort und verhindern in der Schnur. Dadurch wird zuverlässig ermöglicht das Blut gerinnen. Kauter wird vermieden, da ist der direkte Druck.
Nach Nadel Entnahme wird die stereotaktische Gerät zum nächsten Zielort entlang der rostro-kaudalen Achse verlagert, getrennt durch 2 oder 4 mm oder als notwendig, um sichtbare Blutgefäße auf der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks zu vermeiden. Dieser Vorgang wird so oft wiederholt, wie in einer gegebenen Studie vorgeschlagen.
8. Schwimmende Kanüle
Eine benutzerdefinierte Infusionskanüle schmalen Durchmesser ist für die Injektionen verwendet. Die Kanüle besteht aus einem 30-Gauge-Nadel abgeschrägten fester Länge mit einer 30-Gauge flexiblen Silasticschlauch von variabler Länge. Das distale Ende mit einem Luer-Lock-Hamilton, die zu einer Pumpe befestigt Mikroinjektorkopfs eingepasst ist. Das proximale Silasticschlauch innerhalb einer 24-Gauge-Kanüle steifen äußeren umhüllt daß Sitze auf dem proximalen Ende der Injektionsnadel Flansch. Dieser Flansch beide Sitzedie äußere Kanüle und dient als Tiefenanschlag für die Injektionsnadel. Für jede Injektion wird das entsprechende Volumen einer therapeutischen Suspension durch ein infundiert Verwendung eines vorkalibrierten MINJ-PD Mikroinjektorkopfs Pumpe (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) mit einer Rate von 5 ul pro Minute.
9. Schließung
Sobald alle Einspritzungen vorgenommen wurden, wird die spinale Bohrturm vorsichtig entfernt und die Schnitte in vier Schichten geschlossen. Die Dura wird geschlossen mit einem 4,0 Nurolon Stich, in einem wasserdichten Mode. 0 Vicryl Naht wird für die tiefe Muskulatur eingesetzt. Fascia wird dann mit 0 Vicryl Naht auch in einem wasserdicht verschlossen. Die Hautschicht wird schließlich mit 2,0 Vicryl geschlossen, mit einem Laufstich. Hautverschluss abgeschlossen ist mit einem 3-0 Nylon Naht.
10. Recovery and Pain Management
Tiere sind extubiert und für 2 Stunden folgende Anästhesie Recovery überwacht. Weiter werden die Tiere auf einzelne c übertragenAlter und mindestens einmal täglich für die Nahrungsaufnahme, Stuhlgang und Wasserlassen überwacht.
Für Schmerz-Management ist ein transdermales Fentanyl-Pflaster (75 mcg) auf dem Rücken der Tiere für drei Tage postoperativen Analgesie geheftet. Zusätzlich können Buprenorphin (0,05 mg / kg, BID, IM) auch für bis zu drei Tage nach der Operation gegeben werden.
11. Ergebnisse und Vertreter Outcomes
Klinische und Verhaltensbeobachtungen werden vor der Operation durchgeführt und dann aufgezeichnet an den Tagen 1 bis 7 und wöchentlich entsprechend dem Studiendesign bis Endpunkt. Behavioral Daten gesammelt, um neurologische Erkrankungen zu beurteilen wie zuvor 6 beschrieben. Sensorische Funktion wird durch das Vorhandensein oder Fehlen einer Reaktion auf Entzug mechanischen Reiz zu den Zehen von vorderen und hinteren Gliedmaßen bewertet. Motor-Funktion folgt die Tarlov Score (Tabelle 1): 0 - Lähmung, keine Bewegung, 1 - Spürbare Tonus in der Hinterhand, leichte mEs werden Bewegungen, 2 - Bewegung in der Hinterhand, aber nicht in der Lage zu sitzen oder zu stehen; 3 - Fähigkeit zu stehen und zu gehen, aber ataktischen und für kurze Zeit; 4 - Complete Recovery normalen motorischen Funktion.
Sicherheit des Verfahrens wird durch die Fähigkeit eines Tieres zur präoperativen Grundlinie zurückkehren bestimmt. Transient neurologischen Defiziten sollte meist zwischen post-operative Tag 1 und 7 zu lösen, mit einigen Variationen je Tiere Rassen und Verfahren (Anzahl der Injektionen, unter anderen Parametern). Permanent Morbidität wird durch bleibende neurologische Defizite, die nicht durch die Zeit Tiere erreichen IACUC Standardendpunkt (Abbildung 2) nicht beheben definiert.
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Representative Results
| Tarlov Ergebnis | |
| 0 | Lähmungen, keine Bewegung |
| 1 | Spürbare Tonus in der Hinterhand, leichte Bewegung |
| 2 | Bewegung in der Hinterhand, aber nicht in der Lage zu sitzen oder stehen |
| 3 | Fähigkeit zu stehen und zu gehen, aber ataktischen und für kurze Zeit |
| 4 | Vollständige Genesung, normal Motorik |
Tabelle 1. Tarlov Score. Neurologische Erkrankungen und Erholung durch Scoring des Tieres Motorik untersucht.
Abbildung 1. Tabelle Positionierung für Procedure. Tiere werden in Bauchlage auf einem Gestell speziell entwickelt, um Patienten Positionierung auf einer Jackson Wirbelsäule OP-Tisch imitieren platziert. Der Rahmen nutzt einstellbare Schlingen, die unter der Brust und Becken des Tieres angeordnet sind, so dass der Bauch frei hängen und somit die Minimierung Druck auf den Unterleib und Brust und konsequente epidurale venösen Blutungen. Der Rahmen stellt auch externe Immobilisierung der Wirbelsäule für die Prozedur.
Abbildung 2. Motor Function Assessment und Vertreter Outcomes. Tiere durchlaufen eine allgemeine neurologische Untersuchung vor der Operation und in regelmäßigen Abständen nach vollständiger Erholung von dem Eingriff. Gang und Motorik sind nach dem Tarlov Punktzahl bewertet. Diese Skala bietet objektiven Kriterien Auswertung der Tiere Fähigkeit, als Surro ambulateGate Maß der Motorik. Sicherheit des Verfahrens wird durch die Fähigkeit eines Tieres zur präoperativen Grundlinie zurückkehren bestimmt. Transient neurologischen Defiziten sollte meist zwischen post-operative Tag 1 und 7 zu lösen, mit einigen Variationen je Tiere Rassen und Verfahren (Anzahl der Injektionen, unter anderen Parametern). Permanent Morbidität wird durch bleibende neurologische Defizite, die nicht durch die Zeit Tiere erreichen IACUC Standardendpunkt nicht beheben definiert.
Supplemental
Im Falle von Zelltherapien vor Laminektomie und unter Narkose eine Jugularvene 10F chronische Katheter (Access Technologies, CCPS072106A) wird für die intravenöse Verabreichung von Immunsuppressiva für die Dauer der Studie gegeben. Der Hals des Tieres wird präpariert und abgedeckt. Die interne Jugularvene wird chirurgisch freigelegt kanüliert mit dem Katheter, die mit einem 3-0 Seidenkrawatte gesichert ist. Das proximale Ende des inneren Halsschlagader istn mit einem 3-0 Seidenkrawatte ligiert. Anschließend wird der Katheter aus der Halshaut dorsal und getunnelt gesichert mit 3-0 Nylon Stiche. Schließlich wird die Wunde bewässert und mit einer fortlaufenden Naht 3-0 Nylon geschlossen. Ein solches Verfahren wird beim Menschen nicht erforderlich.
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Discussion
Trotz Genehmigung mit der beschriebenen Technik beim Menschen 7-9 gehen, bleiben kritische Fragen zu beantworten, damit das Rückenmark Therapien erfolgreich zu sein. Ein rigoroses Verständnis des Rückenmarks Toleranz gegenüber intraparenchymal Injektion erforderlich, um die Planung und Durchführung von Studien die Entwicklung von Therapien für demyelinisierende, degenerative und traumatische Rückenmarks Krankheit zu ermöglichen. Derzeit gibt es keine klare Verständnis der Anzahl von Injektionen, dass die große Säuger Rückenmarks ohne transienten und permanenten Morbidität tolerieren kann. Ebenso ist Abstand der Injektionen wahrscheinlich Morbidität beeinflussen. Darüber hinaus stellen makroskopischen (zB Ventilation-bezogenen oder unbeabsichtigte Bewegung des Patienten) und mikroskopische (dh Schwingung sowohl mit Belüftung und Herzpulses) Rückenmarks Bewegungen Risiken des Rückenmarks während des Einspritzens. Ein Verständnis der Schwelle für die Morbidität bei einem großen Tier-Modell wird helfenDosierung Berechnungen für alle Rückenmarks Therapie-Programme. Unsere translationale Rückenmarks Transplantation Labor zur Verfügung, um die präklinische Entwicklung Programme aller Teams entwerfen derzeit Studien zur Rückenmarks Anwendung helfen.
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Disclosures
Dr. Boulis ist der Erfinder der Geräte sicher und präzise Einspritzung des menschlichen Rückenmarks ermöglichen. Neuralstem, Inc. hat eine exklusive Lizenz zur Nutzung dieser Technologie erworben. Dr. Boulis erhielt Vorräte der Anteil dieser Gebühr und hat die Rechte an Lizenzgebühren für den Vertrieb dieser Technologie. Andere Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken der Emory University Division of Animal Resources Personal für tierärztliche Versorgung. Finanzierungsquellen gehören: ALS Association, Department of Defense und Neuralstem, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
- Usvald, D., et al. Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs. Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).
- Riley, J., et al. Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation. Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).
- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
- Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery. Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).
- Riley, J., et al. Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform. Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36, 164-171 (2011).
- Boulis, N. M., et al. Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Rev. Neurol. , (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes. Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).
- Boulis, N. M., et al. Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients. Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).
