Summary
Nous montrons comment utiliser la technique d'alimentation ARNi pour abattre gènes cibles et le phénotype taille score de corps
Abstract
Double-brin d'ARN médiée par interférence (ARNi) est une stratégie efficace pour faire tomber l'expression du gène cible 1-3. Il a été appliqué à de nombreux systèmes modèles, y compris les plantes, les invertébrés et les vertébrés. Il existe différentes méthodes pour atteindre 4,5 ARNi in vivo. Par exemple, le gène cible peut être transformé en un vecteur d'ARNi, puis de façon permanente ou transitoire transformé dans des lignées cellulaires ou des cellules primaires pour obtenir des effets inactivation génique; bien synthétisées oligonucléotides double brin de gènes cibles spécifiques (ARNi oligos) peut être transitoirement dans des lignées cellulaires transformées ou des cellules primaires pour réduire au silence des gènes cibles, ou double-brin synthétisé les molécules d'ARN peuvent être micro-injectées dans l'organisme. Depuis le nématode C. elegans utilise des bactéries comme source de nourriture, nourrir les animaux avec des bactéries exprimant double-brin d'ARN contre les gènes cibles fournit une stratégie viable 6. Nous présentons ici une alimentation ARNiméthode pour marquer phénotype taille du corps. Taille du corps chez C. elegans est régulée principalement par le TGF-β - ligand comme DBL-1, si ce test est approprié pour l'identification du TGF-β composants de signalisation 7. Nous avons utilisé différentes souches dont deux souches ARNi hypersensibles à répéter les expériences d'alimentation ARNi. Nos résultats ont montré que far-3 souche nous a donné le meilleur phénotype attendu ARNi. La méthode est facile à réaliser, reproductible et facilement quantifiables. En outre, notre protocole minimise l'utilisation de l'équipement spécialisé, il est donc approprié pour les petits laboratoires ou les établissements majoritairement de premier cycle.
Protocol
1. Préparation des plaques d'alimentation ARNi séquence porteuse gène cible
- Si vous utilisez les bibliothèques disponibles dans le commerce ARNi (par exemple à partir de LifeSciences Source BioScience), passez à l'étape 1.4. Alternativement, cloner des séquences de gènes cibles dans le vecteur L4440, un ver couramment utilisé ARNi plasmide 8, par protocole de clonage standard.
- Transformer le plasmide recombinant dans la souche bactérienne HT115 (DE3), la culture sur les plaques d'agar LB avec 25 ug / ml de carbénicilline et 12,5 pg / ml tétracycline, et de choisir un seul clone pour une utilisation future.
- Pendant ce temps, transformer le L4440 vecteur vide dans la souche bactérienne HT115 pour l'utiliser comme une commande pour les expériences.
- Culture fois recombinants et vide L4440-porteurs de bactéries dans 1 ml de bouillon LB avec 100 pg / ml d'ampicilline pendant la nuit à 37 ° C. Tétracycline n'est pas ajouté en raison du fait qu'elle réduit l'efficacité ARNi.
- Ajouter un autre bouillon de 5 LB ml avec 100 pg / ml d'ampicilline dans la nuit culture, incuber pendant une autre heure 6.4 à 37 ° C.
- Seed 0,5 ml recombinant ou vide L4440-portant culture bactérienne sur les plaques à vis sans fin ARNi. Étiquetez toutes les plaques avec le nom de clone.
- Marquer les plaques et incuber pendant une nuit à 37 ° C pour augmenter tapis bactérien, ce sont les plaques d'ARNi avec ou sans séquence de gène cible. Au moins 2 plaques doivent être préparés pour chaque condition.
2. Worms Culture sur les plaques d'alimentation ARNi
- Flamme stériliser la pointe d'un pick ver fil de platine. Utilisez le ver choisir de prendre 6-10 quatrième stade larvaire (L4) hermaphrodites à chaque plaque ARNi qui contient soit L4440 recombinant ou vides, les animaux utilisent les bactéries comme source de nourriture.
- Laissez hermaphrodites croître à 20 ° C (une des conditions de culture standard pour C. elegans) pendant la nuit, ils deviennent de jeunes adultes le lendemain.
- Transfert 6-10 jeunes adultes dans une nouvelle plaque ARNi en conséquence étiquetés et prêts.
- Laissez leadultes pondent des œufs pour 4-6 heures, puis supprimez tous les adultes à partir de la plaque; cette étape consiste à synchroniser la descendance. Une fois que les mères sont enlevées, commencez à compter le temps. C'est le temps zéro.
- Incuber les plaques à 20 ° C pour permettre aux animaux grandissent au stade de développement spécifique, dans ce protocole, nous choisissons les jeunes adultes pour l'analyse phénotypique. Pour passes rabattues qui se développent à un rythme normal, 72 heures d'incubation est suffisante pour que les animaux deviennent de jeunes adultes. Cependant, différents gènes influent sur le développement des animaux différemment. Si RNAi entraîne les animaux à se développer à un rythme différent, les jeunes adultes peuvent être identifiés comme étant ceux h pas plus de 24 L4 passé avec le développement vulvaire complété et 2-6 embryons dans l'utérus (si fertile). Pour identifier d'autres stades de développement, l'enquêteur doit utiliser le développement des gonades et de la vulve comme un guide.
3. Phénotypes note d'état corporel Taille de l'ARNi traité de Worms
- Placez deux couches de rubans d'étiquettes colorées sur une lame de verre. Assurez-deux deslames de verre soi. Puis, placer une lame de verre à nouveau entre les deux lames de ruban. Faire fondre agarose à 2% dans l'eau, appliquer une goutte au centre de la lame de verre nouveau, puis appuyez sur la lame de verre deuxième sur le dessus pour faire une fine couche de 2% d'agarose comme décrit précédemment 9.
- Une fois que l'agarose est solidifié, retirer la lame de verre haut, la lame d'agarose pad est prêt à charger vers. Glissière étiquette avec le nom de clone.
- Ajouter 10 ul 25 mm 3 NaN pour le pad agarose; prendre 30-40 individus dans la solution de NaN3 de les immobiliser, puis mettre la lamelle sur le dessus; répétez l'opération pour les deux recombinante et vide L4440-portant RNAi chez les animaux traités.
- L'image des vers sous loupe binoculaire à l'aide objectif 2.5x, ici nous utilisons Leica appareil photo numérique avec l'appui Qcapture logiciel.
- Pour l'étalonnage, d'abord capturer une image d'un souverain micromètre standard. Ensuite, ouvrez l'image dans l'image-Pro, Cliquez sur "mesure" et choisissez "étalonnage", puis choisissez«Assistant de calibrage spatial». Avec «calibrer l'image active" est sélectionné, cliquez sur "suivant". Saisissez le nom de l'étalonnage et de veiller à ce que les unités de référence spatiale sont mis à micromètre. Ensuite, cochez la case "créer un étalonnage de référence" et cliquez sur "Suivant". Cliquez sur "ligne de référence tirage au sort." Un bar échelle de référence apparaît. Repositionner la barre d'échelle pour faire correspondre les extrémités du micromètre, puis d'indiquer que la référence indique 1.000 unités. Cliquez sur "OK", "Suivant" et "Terminer".
- Une fois que le logiciel est calibré, ouvrez une image ver. Ensuite, sélectionnez dans la "mesure", sélectionnez "calibration" puis cliquez sur "select spatiale". Dans le menu déroulant, sélectionnez le nom du fichier créé pour l'étalonnage du micromètre. Puis, sous la "mesure", sélectionnez "mesures". Dans la fenêtre qui s'ouvre, sélectionnez l'outil à dessiner et tracer une ligne passant par le centre du corps de l'animal, de la tête à la queue avec la souris d'ordinateur (Figure 1). La longueur sera signalée dans la fenêtre. Maintenantvous avez deux groupes de données: la longueur du corps des animaux traités par ARNi des gènes cibles et les animaux témoins traités avec vide L4440 vecteur.
- Exportez les mesures de longueur dans un fichier Microsoft Excel ou d'autres logiciels de statistique appropriée. Analyser les données en calculant la moyenne et l'écart-type pour chaque échantillon. Puis comparer les échantillons à l'aide de Student t-test.
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Representative Results
Dans notre recherche, nous nous concentrons sur la réglementation taille du corps par la voie DBL-1/TGF-β. La perte de fonction des résultats voie DBL-1 dans une petite taille, y compris une longueur plus courte du corps par rapport à des animaux de type sauvage 7,10,11. Ainsi, écrans pour C. elegans mutants taille du corps sont capables d'identifier les composants de signalisation TGF-β et de modificateurs. DBL-1 signalisation est médiée par une conservée TGF-β voie de transduction de signal qui comprend des récepteurs de surface cellulaires et les transducteurs de signaux intracellulaires Smad 12. Pour tester l'efficacité de l'ARNi en se nourrissant pour l'identification des mutants taille du corps, nous avons utilisé cette technique pour faire tomber composants de la voie DBL-1: dbl-1/ligand; sma-2, sma-3, sma-4/Smads et sma-6/receptor. Pour notre étude, nous avons utilisé deux différents ARNi hypersensible C. elegans souches pour effectuer l'expérience: eri-1; lin-15b et far-3 13,14. Pendant ce temps, nous avons également utilisé N2 (standard de type sauvage) souche et lin-36, un composant de la voie de lin-15 dont la sensibilité ARNi est néanmoins semblable à N2 13. Nos résultats (figure 2) montrent que toutes ces souches affichée la phénotype corps court taille comme prévu (p <0,001), à l'exception sma-6 ARNi dans lin-36 arrière-plan. Dans far-3 fond, la longueur du corps de jeunes adultes après le traitement ARNi étaient de 84 ~ 95% de vecteur seul. En eri-1; longueurs d'arrière-plan lin-15b du corps, de jeunes adultes après l'ARNi étaient 68 ~ 86% des animaux témoins. En comparaison avec des souches de lin-36 et N2, les deux souches de l'ARNi hypersensible far-3 et eri-1; lin-15b étaient plus sensibles.
Figure 1. Des images représentatives de la longueur du corps animal qui est mesurée image animale A. avant la mesure.;
Figure 2. Longueur du corps des animaux dont les composants DBL-1 voie ont été inactivés par la méthode d'alimentation ARNi. Animaux ARNi dans toutes ces souches fond affiché le phénotype corps court longueur comme prévu (p <0,001), à l'exception sma-6 ARNi dans lin-36 fond. ARNi de far-3 et eri-1; lin-15b souches démontraient une plus forte phénotype que celui de lin-36 et milieux N2.
Figure 3. Schéma description de l'utilisation de l'ARNi stratégie d'alimentation pour cribler des gènes candidats.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l'identification des mutants défectueux de la taille du corps C. elegans par l'alimentation ARNi. Cette méthode est applicable à l'identification des composants de signalisation du TGF-β. Depuis ces composants sont hautement conservées à travers l'évolution 15, ces écrans sont pertinents pour élucider les mécanismes moléculaires de la signalisation du TGF-β dans tous les métazoaires. Une considération importante dans la conception d'un tel écran est la souche de départ. Nous avons démontré que les deux eri-1; lin-15b et far-3 sont plus sensibles à l'alimentation ARNi que les souches de contrôle, ce qui est cohérent avec les études antérieures 12,13. Cependant, même si eri-l; lin-15b démontré la plus forte phénotype, les animaux ne poussent pas bien et produit quelques-uns descendance. Ainsi, dans un écran de grande échelle, nous n'aurions pas assez d'animaux pour marquer phénotypes de cette souche. En conséquence, nous privilégions le far-3 souche d'appliquer laTechnique d'alimentation ARNi à la réglementation taille du corps. Un deuxième choix à considérer dans la souche de départ est l'opportunité d'engager un écran avec la voie de DBL-1 intact ou de commencer avec une souche sensibilisés dont la voie de DBL-1 est compromise ou hyperactive. Ces autres points de départ sont susceptibles de conduire à l'identification de chevauchement, mais des ensembles distincts de composants de signalisation. Notre protocole peut également être modifié pour l'étude d'autres phénotypes postembryonnaires. Dans ce cas, l'étape des animaux destinés à être marqués pour le phénotype d'intérêt peuvent avoir besoin d'être modifié en modifiant la durée de la croissance à l'étape 2.5. Avant d'entreprendre un écran à grande échelle pour d'autres phénotypes, nous recommandons un écran pilote avec des gènes connus pour produire le phénotype d'intérêt tels que nous décrivons ici pour dbl-1, sma-2, SMA SMA-3-4, et sma- 6.
En utilisant ce protocole, abattant composants de la voie DBL-1 a montré phénotype attendu la longueur du corps. Ttuyaux animaux ARNi étaient sur 68-95% de la longueur par rapport aux animaux témoins. Dans des études antérieures, DBL-1 voie perte de mutants génétiques fonction de l'âge adulte sont environ 50% plus courte que animaux de type sauvage 7,10,11. Par conséquent, la technique d'alimentation ARNi présentés ici n'ont pas d'éliminer complètement l'activité des gènes. Ainsi, le procédé peut être limitée dans sa capacité à identifier les composants de la voie qui ont un phénotype faible. Pendant ce temps, car il ya de nombreux gènes qui régulent la longueur du corps, les gènes identifiés à partir de l'écran pourrait également ne baisseront pas nécessairement DBL-1 voie. D'autres expériences doivent être effectuées pour placer les candidats dans des voies, comme c'est le cas pour toute méthode autre écran.
En résumé, les écrans d'alimentation RNAi chez C. elegans se sont avérés utiles dans l'identification des gènes impliqués dans un processus d'intérêt. Dans ce protocole, nous avons optimisé les protocoles existants pour être très efficace dans l'identification des défauts taille du corps. Le protocole peut être encore optimisémodifié pour l'étude d'autres phénotypes postembryonnaires.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions James Clark pour fournir des figures d'animaux à différents points dans le temps de développement. C. souches elegans dans cette étude ont été obtenues à partir du Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est soutenu par le Centre National de Ressources NIH Research (NCRR). Ce travail a été soutenu par CIRG 1817 à partir de CUNY à JL et CDD, et par le NIH 1R15GM073678-01-01 et 1R15GM097692 à la CDD Nous remercions le Dr William J Rice, le Dr Nathalia Holtzman, et Mélissa Silvestrini pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été réalisé dans l'accomplissement partiel des exigences d'un doctorat de la Graduate Center de la City University of New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M.
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C.
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
