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Neuroscience

Dissecção, Cultura, Análise e de Published: December 23, 2012 doi: 10.3791/4377
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, College of William and Mary
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Abstract

O processo pelo qual a região anterior da placa neural dá origem à retina de vertebrados continua a ser um dos principais focos da investigação clínica e básica. Para além da óbvia importância médica para compreender e tratar doenças da retina, o desenvolvimento da retina de vertebrados continua a funcionar como um sistema modelo importante e elegante para compreender a determinação de células neuronais do tipo e da diferenciação 1-16. A retina neural é composto por seis tipos de células discretas (gânglio, fotorreceptores amácrinas, horizontal, células bipolares e células gliais de Müller) dispostos em camadas estereotipados, um padrão que é largamente conservada entre todos os vertebrados 12,14-18.

Enquanto estudava a retina no embrião intacto desenvolvimento é claramente necessária para a compreensão de como este órgão complexo desenvolve a partir de uma saliência do cérebro anterior em uma estrutura de camadas, há muitas questões que beneficiam from empregando abordagens utilizando cultura de células primária de presumíveis células da retina 7,19-23. Por exemplo, analisando as células a partir de tecidos removidos e dissociados em diferentes fases permite discernir o estado da especificação de células individuais, em diferentes fases de desenvolvimento, isto é, o destino das células na ausência de interacções com os tecidos vizinhos 8,19-22 ,24-33. Cultura primária de células também permite que o investigador para tratar a cultura com os reagentes específicos e analisar os resultados de um nível da célula individual 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, um sistema modelo para o estudo clássico de desenvolvimento neural precoce 19,27,29,31-32,40-42, serve como um sistema particularmente adequado para a cultura de células da retina primário 10,38,43-45.

Tecido da retina presuntivo é acessível desde as primeiras fases de desenvolvimento, imediatamente após a indução neural 25,38,43. Além disso, dada ªem cada célula no embrião contém uma fonte de gema de ovo, as células da retina pode ser cultivada em um meio muito simples definidos que consistem de uma solução salina tamponada, eliminando assim os efeitos de confusão de incubação ou outros produtos à base de soro 10,24,44-45 .

No entanto, o isolamento do tecido da retina de tecidos circundantes e o processamento subsequente é um desafio. A seguir, apresentamos um processo para a dissecção e dissociação de células da retina em Xenopus laevis que serão utilizadas para preparar culturas de células primárias que, por sua vez, ser analisados ​​para a actividade de cálcio e a expressão do gene com a resolução de células simples. Embora o tema apresentado neste artigo é a análise de transientes de cálcio espontâneas, a técnica é amplamente aplicável a uma grande variedade de questões de pesquisa e abordagens (Figura 1).

Protocol

Todos os experimentos são realizados seguindo os protocolos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso no College of William and Mary. Estágios de desenvolvimento referenciados neste protocolo estão de acordo com Nieuwkoop e Faber 46.

1. Dissecação

  1. Permitir que o meio de cultura celular e Cálcio Magnésio Médio Free (CMF) para equilibrar à temperatura ambiente. Você também vai precisar Modificado 0,1 X Marc Ringer (MMR) pH 7,4-7,6.
  2. Esterilizar os seguintes itens, aplicando uma luz UV durante 30 min numa câmara de fluxo de células de cultura laminar. (Spray cada item com etanol 70%, antes de colocar na capa.)
    • 35 milímetros de plástico placas de Petri.
    • 60 milímetros de plástico placas de Petri.
    • 35 pratos de superfície milímetros Nunclon.
    • 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
    • p1000 micropipeta (1000 micropipeta ul).
    • Aerossol resistentes P1000 dicas (1.000 uL dicas de aerossóis micropipeta resistentes).
    • Álcoolcaneta resistente.
    • Fina dissecação fórceps.
    • * 15 ml tubos cônicos (apenas para a atividade de cálcio de imagem).
    • * Apenas para imagens de atividade do cálcio.
  3. Uma vez que a capa foi UV esterilizado e soluções têm atingir a temperatura ambiente, ligar a câmara de fluxo laminar na capa, spray para baixo luvas e garrafas de mídia com 70% de etanol e garrafas de mídia lugar no capô.
  4. No interior do capuz preparar o seguinte com uma micropipeta p1000 para cada placa de células, garantindo a rotulagem apropriada.
    • 60 milímetros uma placa de Petri de plástico contendo 10 ml de Meio de Cultura Celular - placa de dissecação.
    • Um prato de 35 milímetros superfície Nunclon contendo 2 ml de meio de cultura celular - Placa Cultura. (Pratos de plástico Nunclon não são ainda tratados com quaisquer colas.)
    • Um vazio de 1,5 ml de microcentrífuga tubo Explante-Tube dissociação.
    • * Um 15 ml cônico falcãotubo contendo 15 ml de meio de cultura celular. Para lavagem excesso Fluo4-AM, quando a atividade de cálcio imagem.
  5. Dentro do capô, preparar o seguinte com uma micropipeta p1000 para cada sessão de dissecção (mais de uma retina pode ser dissecada em uma sessão).
    • Um 35 milímetros de plástico placa de Petri contendo 2 ml CMF - Remoção Lavar Plate.
    • Um 35 milímetros de plástico placa de Petri contendo 2 ml CMF - Remoção Placa dissociação.
  6. Fora do capuz preparar o seguinte:
    • Uma placa de Petri 60 milímetros de plástico por placa de células contendo 10 ml 0,1 X MMR - Holding Plate.
    • Uma placa de Petri 60 milímetros de plástico por placa de células contendo 10 ml MMR 0,1 X - Placa Irmãos.
    • 60 milímetros uma placa de Petri de plástico por sessão de dissecação contendo 10 ml 0,1 X MMR + 0,5 mg / ml de MS-222 (tricaina) - Placa de anestesia.
    7. placa dissociação explante (resultando em uma solução de tripsina 0,1%), agite para misturar, e reserve.
  7. Se dissecar um embrião que é mais jovem do estágio 30, adicione 10 mg de colagenase B para a placa de dissecação (resultando em uma mg / ml de colagenase uma solução B), agite para dissolver e reserve.
  8. Seleccionar um embrião de fase desejado, a transferência para a placa de retenção, com uma pipeta de transferência não-estéril, e remover a membrana vitelina (se o embrião ainda não chocados), utilizando fórceps finos.
  9. Transferir várias identicamente encenado embriões para a Placa Sibling com uma pipeta de transferência não-estéril.
  10. Se o embrião é estágio 25 ou anterior, proceder directamente com a dissecação, de outra forma transferir o embrião para a Placa anestesiados com uma pipeta de transferência não-estéril e permitir que o embrião se sentar até movimento e resposta a estímulos cessa. Isso pode levaraté um minuto.
  11. Prossiga com dissecção (Figura 2) em um escopo de dissecação (objetivo 4X, ocular 10X).

Para a fase de embriões 25 anos ou menos:

  1. A transferência de embriões para a placa de dissecação com uma pipeta de transferência não-estéril.
  2. Utilizando dois pares de pinças finas, fazer um corte sagital mediano no lado ventral do embrião, a partir da extremidade posterior e continuando através do prensa de cimento na porção anterior do embrião.
  3. Abra cuidadosamente o embrião agarrando a borda do corte e espalhando a esquerda e direita. Isso resulta em um embrião com o lado dorsal voltada para dentro da placa de dissecação, e com a ectoderme ventrais espalhar aberta para revelar a endoderme e mesoderme dentro.
  4. Iniciar a remoção da endoderme e mesoderme (Figura 2A e 2B). A primeira camada e maior deste tecido é muito "fofo" com uma aparênciagrandes células e organização pouco óbvia.
  5. Depois de remover esta camada, o somitos e notocorda se tornará visível. Para um melhor contraste, mova o embrião a um prato de 60 milímetros separado Petri de plástico contendo 10 ml de meio de cultura celular e 100 ul de solução a 1% de sulfato de azul do Nilo (em água) durante 2-3 min antes da transferência de volta para a placa de dissecação. Isso vai manchar o ectoderma, somitos, e notocorda para facilitar a identificação e orientação.
  6. Concentrando-se na porção anterior do embrião, cuidadosamente remover a notocorda e mesoderme qualquer remanescente expondo o cérebro e as vesículas óticas (Fig. 2C).
  7. Uma vez que o cérebro e vesículas ópticas são completamente exposto, usar a pinça para cortar o tubo neural e ectoderme subjacente apenas posterior para o cérebro.
  8. Transformar esta parte (o cérebro e vesículas ópticas) de forma que a ectoderme está no topo.
  9. Tomando cuidado para não danificar as vesículas subjacentes óptica, cuidadosamente remover a ectoderme (Figura 2D).
  10. Finalmente, utilizando um fórceps, separar as vesículas ópticas a partir do cérebro (Figura 2D e 2E).

Para os embriões mais velhos do que estágio 25:

  1. Enquanto o embrião está na placa anestesiados, remover a porção ventral do embrião com um fórceps.
  2. Para um melhor contraste, mova o embrião para uma placa de Petri 60 milímetros de plástico contendo 10 ml de 0,1 X MMR e 100 uL de 1% de sulfato de azul do Nilo, durante 2-3 min antes de se transferir para a placa de dissecação. Isso vai manchar o azul ectoderma.
  3. Uma vez na placa de dissecação, puxe o ectoderma sobrejacente a retina (ou vesícula óptica para a etapa de embriões 26-30) (Figura 2F e 2G). Se Sulfato Azul do Nilo foi utilizado, a ectoderme será tingido de azul, mas o tecido subjacente retina não.
  4. Retire a retina ou vesícula óptica cuidadosamente com forceps (Figura 2H, 2I e 2J). É útil para manter o embrião no lugar com um par de pinças e retire a retina ou vesícula óptica com a outra.

2. Dissociação de tecidos e chapeamento de Células

Nota Importante - Ao transferir tecidos, não permitem a retina ou vesícula óptica para tocar todos os limites de ar-líquido, se isso ocorre, as células vão lise.

  1. Uma vez a vesícula óptica ou retina foi dissecado, transferir cuidadosamente para a explantação Lavar placa com uma micropipeta p100 utilizando pontas resistentes a aerossol e permitir a sentar-se durante 30 segundos.
  2. Transferir 80 uL de tripsina a 0,1% em CMF-se da placa de dissociação para a explantação Tubo Dissociation explante.
  3. Usando uma micropipeta, p100 e aerossóis pontas resistentes, transferir a retina ou vesícula óptica da explantação Lavar a placa Dissociati Explanteno tubo, evitando a transferência da solução de lavagem dos explantes.
  4. Permitir que o tecido se dissociar no Tubo A dissociação explante durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma retina foi utilizado por placa, no entanto, observar que é possível utilizar mais do que uma placa de per se assim for desejado aumentar o número de células por placa.
  5. A placa de células, em primeiro lugar lentamente remover 40 ul da solução a partir do Tubo de dissociação Explante e descartar utilizando uma micropipeta e p100 aerossol pontas resistentes. Usando um conjunto de p100 e 40 ul de aerossol pontas resistentes, transferir as células (agora que o tecido tenha dissociado) à placa de cultura. Quando a aspiração das células na placa, pipetar lentamente e manter as células em uma pequena área no centro do prato.

Nota: Se as imagens múltiplas de células devem ser tomadas ao longo da experiência, anexar uma grade (Cellattice) para o lado de baixo da placa de cultura

  1. Permitir que as células de se sentar sem ser perturbado por pelo menos 1 hora a aderir à placa Nunclon. Após este tempo, eles devem ser tratados com muito cuidado ou podem soltar-se.
  2. Células de cultura para a fase desejada pela observação dos embriões de irmãos, que são criados na mesma temperatura medida que as células. Se as células vivas não estão a ser utilizados para posterior manipulação, eles podem ser fixados em solução MEMFA neste momento.

Nota Importante: A maioria das nossas experiências são fixos dentro de 6 horas de plaqueamento das células. A longevidade das células em cultura é dependente da fase em que o tecido foi dissecada e a quantidade de gema ainda presente nas células, as células dissecadas a partir de menores (fases neurula) permanecem saudáveis ​​em cultura durante 5-6 dias, enquanto que as células adquirido embriões mais velhos (natação girinofases) irão permanecer viáveis ​​em cultura durante 2-3 dias.

3. Imagem de cálcio 47-49

Este protocolo utiliza o cálcio sensíveis Fluo4 microscopia confocal e-AM para quantificar transientes de cálcio em células individuais. Todos os passos usando Fluo4-AM deve ser realizada ao abrigo da luz, como Fluo4-AM é sensível à luz. Todas as lavagens devem ser adicionados ou removidos utilizando uma micropipeta e p1000 aerossol resistentes dicas. A pipetagem deve ser feito lentamente e no sentido do bordo da placa para evitar perturbar as células. A mídia não é alterada porque as culturas são geralmente fixados em até 6 h de ser dissecado. Para longo prazo culturas, a mídia deve ser trocada diariamente.

  1. Fluo4-AM é armazenado a -20 ° C, e sugere-armazenar em alíquotas de 5 ul. Antes de usar, descongelar uma alíquota de 5 ul de Fluo4-AM abrigo da luz e adicionar 2 ul de Pluronic F-127 directamente a esta alíquota.
  2. Após a cultura das células durante o período de tempo desejado (pelo menos1 h), retirar 1 ml do meio de cultura de células a partir da placa de cultura. Adicionar isto ao Fluo4-AM e Pluronic, misturando por pipetagem suave.
  3. Lentamente transferir toda esta solução de novo para a extremidade da placa de cultura das células a ser trabalhada e deixar que as células nesta solução em repouso durante 1 hora para absorver o Fluo4-AM.
  4. Para lavar o excesso de Fluo4-AM a partir do meio de cultura celular, completar a série de lavagem seguinte:
    • Remover 1 ml de meio da placa.
    • Adicionar 3 ml de meio de cultura fresco celulares (a partir do tubo cónico de 15 ml) à placa.
    • Executar duas lavagens adicionais, cada vez removendo lentamente 3 ml de solução a partir da placa e adicionar 3 ml de meio de cultura fresco de células.
  5. As células devem estar agora em 4 ml de meio de cultura de células e contêm Fluo4-AM. Fluo4-AM é enzimaticamente clivada, uma vez dentro da célula, impedindo-a de sair de difusão da célula ou em quaisquer compartimentos ligados a membranas. Antes de carregar a placa sobre a fase do microscópio confocal para imagiologia, desenhar uma linha vertical vermelho com marcador permanente no prato, mantendo a tampa para evitar que as partículas do marcador de contaminar a cultura. A linha vertical é desenhada para o lado da placa de Petri (à base do prato de Petri, e não a tampa). A sua finalidade é a de indicar a orientação da placa de cultura em relação ao campo de visão, de modo que a orientação precisa e alinhamento das células individuais podem ser re-estabelecido num ponto mais tarde.
  6. A placa está agora pronta para o carregamento no estágio do microscópio confocal para a imagiologia. Visualizar as células usando as configurações de campo brilhantes em um microscópio confocal de varredura a laser (objetiva 20X). Encontrar uma área de células densas, que não contém tufos, de preferência, com um campo de visão que contém os números de grelha grandes na lamela Cellatice para fazer encontrar o mesmo campo de visão mais fácil, mais tarde, quando a cultura de imagem depois de sihibridização tu. Antes da imagiologia, o foco para baixo através da cultura e dar uma imagem de campo brilhante da grelha abaixo das células para registar a localização e orientação da cultura celular. Isto permite que o realinhamento das células para análise posterior.
  7. Levantar o plano focal e capturar uma imagem de campo brilhante das células antes da imagiologia de cálcio começam (Figura 3A).
  8. Uma vez que o plano central das células está em foco, a placa está pronta para a imagiologia da actividade de cálcio. Configurações irão variar dependendo do microscópio e a aplicação. Nós imagem das células utilizando um laser de 488 nm de árgon, durante 1, 2 ou 12 horas com os seguintes parâmetros:
    • 1 hr imagens:
      • Laser de argônio 488 nm verifica a 4% de sua potência máxima de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada quatro segundos (900 scans por hora).
    • 2 imagens de RH:
      • Laser de argônio 488 nm verifica a 4% de sua potência máxima de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada8 seg (450 scans por hora).
    • 12 imagens de RH:
      • Laser de argônio 488 nm verifica menos 2% do seu poder máximo de 30 mW.
      • Digitalizar uma vez a cada segundo 48 (75 exames por hora).

Estes parâmetros irão resultar em um conjunto de 900 imagens fixas de quadro para cada intervalo de tempo. Actividade de cálcio pode então ser gravado através da análise de níveis de fluorescência ao longo do curso de tempo nas imagens (Figura 3B), com a utilização de uma aplicação de processamento de imagem, tais como ImageJ 50.

4. Fixação Células

  1. Na sequência de imagens, as células podem ser fixadas por 30 min, removendo 3 ml de solução a partir da placa e da adição de 1 ml de 2X MEMFA para o restante 1 ml de meio de cultura.
  2. Após a fixação, remover MEMFA e desidratar as células com uma série de cinco lavagens min cada, num volume de 1 ml:
    • 25% de etanol em 1X tampão de fosfato salino (PBS).
    • Etanol a 50% em PBS 1X.
      • <li etanol> 75% em sdd H 2 O (água desionizada destilada estéril).
    • Substituir a última lavagem com 1 ml de etanol a 100% e placa armazenar a -20 ° C.

Nota: O metanol pode também ser usado para estas lavagens e para armazenamento.

5. Hibridização in situ fluorescente (FISH)

As culturas podem ser analisadas utilizando o protocolo padrão de FISH para Xenopus como descrito 51, com modificações para a cultura de células, conforme descrito por Anderson na Lab 52. Modificações no Laboratório Anderson protocolo estão listadas abaixo. Todas as lavagens são realizadas nas placas de 35 mm de Nunclon volumes de cerca de 1 ml, a menos que indicado em contrário. As soluções são as definidas no Sive et al. 53, a menos que indicado em contrário.

Nota Importante: Não use fluoresceína marcados com sondas de RNA ao realizar hibridização in situ em células fotografada paraactividade de cálcio. Anticorpos anti-fluoresceína se ligará residual Fluo4-AM em células e pode provocar um sinal positivo em todas as células na cultura.

Dia 1: Permeabilização e Hibridação

  1. Lavagens de reidratação deve ser classificado para o solvente utilizado para a desidratação de armazenamento. Para as nossas experiências, as lavagens foram graduadas de etanol em 1X PBS.
  2. Na sequência de re-hidratação, lavagem das células três vezes adicionais em 1X PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
  3. Misturar 25 ml de trietanolamina 0,1 M (pH 8,0) com 62,5 ul de anidrido acético num tubo Falcon e rapidamente misturar até ficar bem disperso, como discutido no Laboratório Anderson 52 protocolo. Incubar as culturas nesta mistura durante 10 min à temperatura ambiente. Após o tratamento de anidrido acético, lava-se as células em solução salina de citrato de sódio 1X (SSC), durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Remover a solução de lavagem SSC último e substitua com HCl 0,2 M (em sdd H 2 O) durante 10 min para permeabilizar as células. </ Li>
  5. Lavar a HCl com duas lavagens em 1X PBS durante 5 min.
  6. Prehybridize em tampão ISH a 60 ° C num banho de água com agitação durante um período mínimo de 6 horas, mas não durante a noite prehybridize como este diminui severamente sinal.
  7. Hibridizar durante a noite a 60 ° C durante 8-14 horas, em 750 ul de sonda diluída (1:250 de diluição a partir de uma sonda purificada). A intervalos de concentração de sonda purificado 1,0-1,5 ug / uL.

Dia 2: a remoção da sonda Unbound e Incubação de anticorpos

  1. Remover e lavar a sonda de culturas durante 5 min em 0,2 x SSC a 60 ° C. Lavar em 0,2 X SSC fresco durante 1 hr a 60 ° C.
  2. Remover as culturas a partir do banho de água e permitir-lhes ajustar a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Enxaguar em 0,2 X SSC à temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Lavar durante 15 min em 1X PBS com 0,1% de Triton-X-100 (PBT).
  5. Para inactivar peroxidases endógenas, lavar durante 1 hora em um 2% de H 2 O 2 em solução de PBT.
  6. Bloquear em 2% de reagente de bloqueio em tampão de ácido maleico (MAB), durante 1 hora à temperatura ambiente. Verificámos que este método de bloqueio aumenta a sensibilidade em relação aos anteriores métodos de bloqueio em 20% de soro de ovelha em PBT.
  7. Incubar as culturas em 1 mL de 2% de reagente de bloqueio em MAB contendo uma diluição 1:1.000 de um anticorpo POD-conjugado durante a noite a 4 ° C.

Dia 3: Remoção de anticorpo não e Desenvolvimento de fluorescência

  1. Remover a solução de anticorpos e lavar 3 vezes em TBST durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  2. Lavar 4 vezes em TBST durante 15 minutos à temperatura ambiente enquanto agitando continuamente a uma velocidade lenta.
  3. Lavar duas vezes em PBT à temperatura ambiente durante 10 min.
  4. Aplicar 750 ul de fluoresceína-tiramida 1:200 ou 1:25 Cy3 tiramida diluído em PBT. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e adicionar 2,5 ul de 0,3% de H 2 2. Agitar durante 40 minutos para permitir que o sinal para se desenvolver.
  5. Lavar, pelo menos, 4 vezes durante 15 minutos cada em TBST à temperatura ambiente com agitação.
  6. Uma vez que o sinal foi totalmente desenvolvido, lave durante 5 min em 1X PBT.
  7. Fixar em 1X MEMFA durante 1 hora à temperatura ambiente e armazenar em 1X PBS a 4 ° C.

6. Imagem Resultados peixes e Co-registo com dados de imagem de cálcio

  1. Após a conclusão de FISH, as placas de cultura de células são gravadas para determinar quais as células exibem um sinal positivo de fluorescência para uma dada sonda. Utilizar a lamela Cellattice para encontrar o campo de visão exacto estudado durante imagiologia de cálcio e alinhar a chapa para a orientação dos quadros de imagem de cálcio.
  2. Concentre-se ao plano do centro de células e dar uma imagem de alta resolução, só com o Hélio-Néon laser HeNe 543 nm a 15% da sua potência máxima mW 1 (Figura 3C).
  3. No quadro original de 900 conjunto de imagens tiradas a partir do protocolo de imagem de cálcio,identificar células individuais como as regiões de interesse (ROI), através da utilização de um programa de processamento de imagem (como ImageJ 50). Extrair dados de ROI fluorescência como um conjunto de pontos de dados que representam os valores de tempo de fluorescência par (Figura 4).
  4. Sobrepor a imagem FISH resultados com os ROIs identificados a partir das imagens de cálcio (Figura 3D).
  5. Registar cada ROI como positivo para a sonda, negativo para a sonda, ou desconhecidos - no caso de que a célula correspondente ao ROI já não pode ser encontrada dentro do campo de visão da imagem de FISH.
  6. Os dados do processo de ROI de fluorescência usando scripts de análise estatística (como projetado através MATLAB ou outra linguagem de programação) para comparar os níveis de atividade de cálcio entre os diferentes estágios dissecadas (Figura 5A e 5C) ou células positivas para sondas FISH diferentes (Figura 5B e 5D). Todos os scripts utilizados em nosso laboratório estão disponíveis gratuitamente, mediante solicitação.

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Representative Results

Exemplos de sucesso dissecados vesículas óticas (etapa 25) e retina (etapa 35) são mostrados nas Figuras 2E e 2J. Embora este protocolo pode ser utilizado em várias fases de desenvolvimento, é essencial para se obter apenas o tecido da retina para garantir a precisão para outras experiências. Remova cuidadosamente a epiderme em todas as etapas e garantir que seus fórceps não perfurar o tecido da retina. Na fase de 35 anos ou mais, a lente pode ser vista como uma camada transparente sobre a retina e pode ser removido por raspagem cuidadosa usando uma pinça.

A cultura de células com êxito chapeado primário é mostrado na Figura 3A. Quando a dissociação de tecidos, é importante que não saiam do explante retina na solução de lavagem durante mais tempo do que o recomendado tempo de incubação de 30 segundos para evitar que o tecido de dissociar na solução de lavagem. Para além disso, assegurar que o tecido é permitido para dissociar na solução de tripsina durante uma hora completa(Embrionário mais velhos e as fases larvares pode exigir ainda mais) para permitir uma distribuição uniforme de células na placa de cultura. Uma vez que as células são chapeadas, ter cuidado quando se desloca a placa de mudança e soluções para evitar a lavagem das células a partir da placa.

As Figuras 3B e 3C mostram imagens do varrimento de cálcio e actividade em experiências de hibridação fluorescente in situ (FISH), respectivamente. As células que aparecem verde brilhante na imagem de cálcio são as células que estão a sofrer um aumento transitório dos níveis de cálcio intracelular, como resultado da libertação de lojas de cálcio interno. As células podem, então, ser analisadas quanto à expressão de genes utilizando FISH, e padrões de expressão de genes pode ser correlacionada com os padrões de actividade de cálcio spiking sobrepondo as imagens (Figura 3D). Usando uma combinação de Python e scripts MATLAB (disponível gratuitamente a pedido), os dados são obtidos por meio da análise da atividade de fluorescência de cada indivíduosal região de interesse (ROI), através do curso da imagem. Um exemplo da actividade de cálcio para uma célula individual (ROI) ao longo de 1 h de formação de imagens é mostrado na Figura 4, um espigão é visível em cerca de 57 min de imagiologia. Na Tabela 1, os dados representativos para a percentagem de células positivas para várias sondas são mostrados, enquanto que não há dados específicos para esta experiência relatada na literatura (o ponto de nossas experiências em curso é o de determinar estas percentagens), os nossos resultados são consistentes com dados de tipos semelhantes de experiências relacionadas com a actividade do cálcio na medula espinhal 17,55,56.

Parâmetros utilizados para análise incluem o número, periodicidade e amplitude de espigas. Figura 5 apresenta resultados representativos de imagem de cálcio e experiências de peixes em células embrionárias da retina utilizando sondas para xVglut1, Ptf1a, e xGAD67. Usando MATLAB scripts, o número de espigas por each ROI é determinado e o número de espigas é calculada a média para todos os ROIs no experimento. O número médio de espigas de cada experiência pode então ser compilado com outras experiências, resultando na média de um grupo de experiências. Parcelas de distribuição cumulativas podem ser criadas para apresentar a distribuição do número médio de espigas para todas as experiências de um grupo. Scripts de MATLAB são então utilizados para a análise estatística dos dados.

A Figura 5 apresenta dados representativos após a análise MATLAB. Em resumo, os nossos resultados mostram que a actividade do cálcio é developmentally regulada, com um pico na fase spiking 35 (p <0,002) (Figuras 5A e 5C). Em termos de actividade correlacionando cálcio com células positivas para uma sonda específica, ao passo que não houve diferenças estatisticamente significativas, no entanto houve uma tendência (p = 0,08) para as células positivas para xGAD67 (um marcador para as células diferenciadas GABAérgicos) para exibir highe r níveis de actividade de cálcio spiking do que as células positivas para o marcador ou para Ptf1a glutamatérgica, um gene que codifica um factor de transcrição do gene relacionado com a promoção do fenótipo GABAeric. Embora preliminares, estes dados sugerem que podem haver células GABAérgicos, que se desenvolvem de uma maneira independente de Ptf1a ou que a actividade dependente da especificação neurotransmissor não está a actuar ao nível de Ptf1a.

Figura 1
Figura 1. Esquemático processual. Uma vez o tecido da retina é dissecado e dissociado, a cultura primária de células pode ser utilizado para uma grande variedade de aplicações.

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Figura 2. Fotografias dissecção. Embriões foram coradas em Nilo Sulfato de Azul para o aumento do contraste. AE: Stage 24. FJ: Stage 35. Abreviaturas:. Ov, vesícula óptica; fb, do cérebro anterior; sc, medula espinhal, eu, mesoderme, por isso, somitos; le, lente; cg, glândula de cimento; retina re, ep;, epitélio Clique aqui para ampliar a figura .

Figura 3
Figura 3. Imagens de cultura celular com ROIs circulou. A. Campo claro. B. seguinte imagem Fluo-4 tratamento (AM) com ROIs circulou. C. imagem FISH (as setas indicam exemplos de células positivas para a subunidade alfa do canal de cálcio voltagem gated CaV2.1). D. Sobreposição de campo claro, Fluo-4, e imagens FISH.

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Figura 4. Exemplo de actividade de cálcio para uma única célula (ROI). Plot da fluorescência (em unidades relativas de fluorescência, RFU) em função do tempo (em minutos) a partir de uma imagem de fluorescência Fluo4 cálcio.

Figura 5
Figura 5. Resultados exibindo picos de cálcio por etapa e sonda. A. Número médio de pontos do cálcio em fases 30 (n = 4), 35 (n = 8) e 38 (n = 13). B. número médio de espigas por cultura de cálcio entre os diferentes sondas utilizadas para a hibridação in situ na fase 35 xVglut1 (n = 3), xGAD67 (n = 3), e Ptf1a (n = 4). C. trama distribuição cumulativa do número médio de espigas por cultura em fases 30, 35, 38. D. cumulativa distributino gráfico da média do número de espigas por cultura de células identificadas como tendo um sinal positivo para a sonda de hibridação in situ na etapa 35,. xVglut1, xGAD67 e Ptf1a clique aqui para ampliar a figura .

Sonda Etapa n (placas) n (células) Percentagem Positiva
xGAD67 35 4 1042 2%
38 4 690 2%
Ptf1a 30 3 352 1%
35 6 1856 1%
xVglut1 30 1 47 57%
35 3 692 2%
38 3 364 4%

As células da tabela 1. Cento positivos.

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Discussion

Com os seus tipos de células bem caracterizadas que são conservados entre todos os vertebrados, a retina é um modelo útil para o estudo dos processos moleculares, celulares que regulam a especificação celular e diferenciação do tipo. Cultura celular primária proporciona um método poderoso para a investigação de uma grande variedade de processos, incluindo a expressão de genes, a dinâmica de proteínas, e de cálcio e actividade eléctrica no nível de resolução única célula. Aqui apresentamos uma técnica simples para a cultura primária de células de tecido dissecado presuntivo da retina em Xenopus laevis, um organismo especialmente favorável para tais estudos, uma vez que a retina presuntivo é facilmente acessível desde os primeiros estágios de desenvolvimento e que a cultura primária de células pode ocorrer em um meio definido consistindo de uma simples solução salina.

Embora facilmente adaptável a maioria das configurações de laboratório, há várias etapas que requerem atenção particular. Dissections deve ser realizada com fórceps recentemente sharpened. Fases mais jovens (<r 30.) Benefícios do tratamento com colagenase B misturado com o meio de cultura celular. Todos os passos que envolvem a transferência de tecido ou de células a partir de um meio para outro deve ser realizado com um cuidado especial para evitar que o tecido ou as células entrem em proximidade da interface ar-solução. A pipeta contendo o tecido deve ser completamente submerso na abundância de fluido e as células ou tecido expelido muito lentamente. Depois que as células foram plaqueadas, todas as transferências de fluido, incluindo, Fluo4-AM disso, e meio de cultura celular, ou lavagens de fixação, tem de ser realizada com cautela, uma vez que as células podem ser facilmente desalojado. Tal como acontece com todas as culturas de células, a esterilidade é preocupante, assim deve ser tomado cuidado para esterilizar todos os materiais. Por fim, deixando os explantes de retina dissociadas sentar para o período de tempo designado no meio de dissociação é fundamental para a fixação das células com êxito e para evitar aglomeração.

Durantea condição de dissecação e cultura descrito no presente protocolo, tanto a necrose e apoptose são extremamente limitadas (menos do que 5-10% das células). A perda de células na placa (apoptose) é raramente observada durante pré e pós sessões de imagem confocal. Manipulação de culturas de células cuidadosamente é a chave para a viabilidade celular. Mudanças de solução deve ser efectuada muito lentamente e firmemente para impedir a necrose celular e apoptose. Embora as experiências de delinear a relação precisa de tipos de células da retina estão actualmente em curso, fazemos nota que uma variedade de tipos de células da retina parecem ser representado nas culturas e que as células gliais Muller (que têm uma morfologia distinta) não são dominantes nas culturas .

Uma preocupação potencial quando se analisa depois as placas em experiências de hibridação in situ é a de que algumas das células podem ter movido, mas esta pode ser tratada com o uso de programas de rastreio de células. Além disso, inerente à técnica de cultura de células primárias, uma limitação principal é the óbvia perda de padronização espacial que está presente no tecido intacto. A identidade das células individuais deve ser estabelecida usando ensaios moleculares ao invés da posição do tecido. No entanto, esta característica também proporciona a oportunidade de analisar o estado da especificação de células muito precisamente e na ausência de contínuas interacções célula-célula. Também permite que o investigador a tratar selectivamente as células com factores de crescimento ou outros compostos e analisar com precisão os efeitos sem a influência de sinais de células vizinhas. Embora tenhamos empregue esta dissecção da retina e da técnica de cultura de células primária para correlacionar imagiologia de cálcio com marcadores fenotípicos específicos de neurotransmissores, esta técnica é adaptável a uma vasta gama de outras aplicações a jusante, incluindo as gravações electrofisiológicos e de células individuais de expressão de genes, utilizando ensaios de RT-PCR, ou "próximo -gen "análise do transcriptoma (Figura 1).

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Nós graciosamente agradecer ao Dr. John Hayes para scripts; drs. Eric Bradley e Christopher Del Negro para a assistência com a microscopia confocal, de Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, e Liz MacMurray por seu trabalho no desenvolvimento do projeto e fornecer dados preliminares, o Dr. Greg Smith para sugestões úteis sobre a análise estatística. Este trabalho foi financiado por uma bolsa do NIH (NINDS IR15N5067566-01) para MSS e do Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant para o College of William and Mary.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc's Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart's Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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