Summary
माउस जननांग पथ से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए एक कुशल तरीके से वर्णित है. इस विधि एंजाइम पाचन और Percoll ढाल जुदाई का लाभ लेता है कुशल अलगाव की अनुमति. इस तकनीक को भी अन्य प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूल है
Abstract
जठरांत्र, मूत्रजननांगी, और सांस इलाकों में, प्रविष्टि के रोगजनकों के लिए ऐसे वायरस और बैक्टीरिया 1 के रूप में, पोर्टल उपलब्ध कराने सहित mucosal सतहों. Mucosae भी मेजबान में आगमनात्मक साइटों रोगजनकों के खिलाफ आंत्र पथ में Peyers पैच और नाक से जुड़े श्वास नलिका में lymphoreticular ऊतक के रूप में प्रतिरक्षा उत्पन्न. इस अनूठी विशेषता मेजबान रक्षा प्रणाली के एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी के रूप में mucosal उन्मुक्ति लाता है. कई अध्ययनों जठरांत्र और श्वसन mucosal साइटों पर ध्यान केंद्रित किया गया. हालांकि, वहाँ प्रजनन mucosal साइटों के छोटे से जांच किया गया है. जननांग पथ mucosa यौन संचारित (एसटीडी) बैक्टीरियल और वायरल संक्रमण सहित रोगों के लिए प्राथमिक संक्रमण साइट है. एसटीडी सबसे महत्वपूर्ण स्वास्थ्य दुनिया का सामना करना पड़ आज की चुनौतियों में से एक हैं. रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र का अनुमान है कि वहाँ संयुक्त राज्य अमेरिका में 19 लाख नए संक्रामक हर साल रहे हैं. STडी एस अमेरिका स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली हर 2 साल 17 अरब डॉलर की लागत, व्यक्तियों और लागत भी तत्काल और जीवन भर के स्वास्थ्य के परिणामों के बारे में अधिक. आदेश में इस चुनौती का सामना करने के लिए, प्रजनन mucosal उन्मुक्ति का एक बड़ा समझ की जरूरत है और लिम्फोसाइटों अलग इन अध्ययनों के एक आवश्यक घटक है. यहाँ, हम एक reproducibly प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन के लिए murine मादा जननांग इलाकों है कि अन्य प्रजातियों के लिए adaption के लिए संशोधित किया जा सकता से लिम्फोसाइटों को अलग विधि प्रस्तुत करते हैं. नीचे वर्णित विधि एक माउस पर आधारित है.
Protocol
1. जननांग पथ हटाने
- अनुमोदित दिशा निर्देशों का उपयोग कर माउस euthanize. कम midline चीरा बनाने के लिए और त्वचा को वापस लेना.
- अलग करने के लिए और पूरे जननांग पथ डिंबवाहिनी से योनि खोलने को हटा दें.
- कैंची के साथ पूरे पथ longitudinally खोलें.
- पूरा RPMI-10/EDTA साथ एक पेट्री डिश में ठीक (<1mm के बारे में) टुकड़े (नीचे सूत्र देखें) में ठीक शल्य कैंची से जननांग पथ कट और एक चुंबकीय दोषी के लिए सेट पर कमरे के तापमान पर 125 मिलीलीटर फ्लास्क में ऊतक हलचल 15 मिनट. इस प्रक्रिया को दो बार दोहराया जाता है और फिर तैरनेवाला, जो उपकला और अन्य मलबे शामिल खारिज कर दिया है.
- एक सेल झरनी (40μm) के माध्यम से फ्लास्क की सामग्री डालो. EDTA अवशेषों पूरा माध्यम से धो लें.
पूरा RPMI/10: RPMI 500 मिलीलीटर (Gibco), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), गर्मी निष्क्रिय, 5 मिलीग्राम पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीग्राम 1M HEPES.
पूरा RPMI-10/EDTA: 10% 5μM ई के साथ RPMI (जैसा ऊपर)डीटीए
2. जननांग पथ ऊतक पचाने
- ऊतक टुकड़े 20 मिलीलीटर ताजा RPMI-10/collagenase के साथ एक नई कुप्पी (नीचे नुस्खा देखें) स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस में एक चुंबकीय दोषी को सख्ती ऊतक हलचल सेट पर 1 घंटे के लिए ऊतक को पचाने में.
पूरी RPMI-10/collagenase: अधिकार का उपयोग करने से पहले, reconstitute कोलैजिनेज प्रकार (सिग्मा, -20 पर दुकान डिग्री सेल्सियस, या निर्माता के निर्देशों के अनुसार.) आठवीं, पूरा RPMI/10 में 450-500U/ml की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ने. - 1 पाचन के बाद, 100 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से supernatants एकत्र, बर्फ पर कोशिकाओं रखना.
- एक नई कुप्पी पचाया नहीं ऊतक स्थानांतरण और कदम 2.1 दो 3 अलग digestions के एक कुल के लिए नए सिरे से पूरी RPMI-10/collagenase का उपयोग बार दोहराएँ. इस बिंदु पर, नहीं दिखाई ऊतक टुकड़े समाधान में होना चाहिए.
- पूल एक नमूना से सभी को एक साथ supernatants और 100 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से इकट्ठा. ग स्पिननीचे Ells. सेल छर्रों Percoll gradients का उपयोग कर अलग हो जाएगा.
3. जननांग पथ Percoll gradients का उपयोग कोशिकाओं को अलग
- उपयोग करने से पहले Percoll के प्रत्येक एकाग्रता तैयार:
- 100% isotonic Percoll: मिश्रण 9:01 स्टॉक (फार्मेशिया Biotch) Percoll 10x पीबीएस बनाम. यह 7.4 एचसीएल का उपयोग कर पीएच.
- 40% Percoll समाधान: मिश्रण 100% isotonic Percoll और पूरा RPMI की 60 मिलीलीटर की 40 मिलीलीटर.
- 70% Percoll समाधान: पूरा RPMI की 30 मिलीलीटर के साथ मिश्रण 100% isotonic Percoll की 70 मिलीलीटर.
- में 6 कदम 40% Percoll समाधान से प्रत्येक कोशिका गोली Resuspend. 70% Percoll की एक समान मात्रा gradients बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. ढाल ट्यूबों की स्थापना के लिए दो तरीके हैं:
- के तहत परत: एक ढाल ट्यूब में 40% Percoll के साथ सेल निलंबन पहले तो ध्यान से परत के तहत 70% Percoll जोड़ने के लिए,.
- अधिक परत: ट्यूब 70% Percoll में 1 जोड़ते हैं, तो ध्यान से और धीरे धीरे 40% पर कोशिकाओं से युक्त Percoll लोडशीर्ष.
- ढाल नमूने @ 900 XG, कमरे के तापमान centrifuged ब्रेक से 20 मिनट के लिए किया जाएगा.
- लिम्फोसाइटों 40% और 70% Percoll परतों के बीच इंटरफेस परत में हो जाएगा. सावधानी से इंटरफ़ेस परत फसल RPMI 01:03 साथ धोने और 740 XG पर नीचे स्पिन. लिम्फोसाइटों सेल गोली में हो सकता है और आगे उपयोग के लिए तैयार हो जाएगा.
4. प्रतिनिधि परिणाम
माउस जननांग पथ और प्रवाह cytometry विश्लेषण (FACS) से लिम्फोसाइटों के अलगाव का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. जननांग पथ क्लैमाइडिया muridarum से संक्रमित intravaginally माउस 7 दिनों के संक्रमण के बाद हटा दिया गया था. दो जननांग इलाकों के साथ जमा किया गया क्रम में FACS द्वारा कार्यात्मक और phenotype परीक्षा के लिए पर्याप्त लिम्फोसाइटों. Dissected ऊतकों पाचन और अलगाव कदम के रूप में ऊपर उल्लिखित द्वारा प्रोसेस किया गया. एकल कक्ष निलंबन विभिन्न fluorochrome संयुग्मित सना हुआ थामाउस CD3, CD4 और CD8 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी. चित्रा 1 CD4 CD8 सकारात्मक टी टी lymphocytes gated पर CD3 सकारात्मक कोशिकाओं बनाम सकारात्मक टी कोशिकाओं की एक प्रस्तुति डॉट साजिश से पता चलता है. हमारी प्रक्रिया अलग रोग मॉडल के जननांग इलाकों से अलग करने के लिए माउस मॉडल में विभिन्न रोगों में विभिन्न प्रतिरक्षा सेल कार्यात्मक और प्ररूपी विशेषताओं का आकलन लिम्फोसाइटों की जांच कर सकते हैं. वृक्ष के समान कोशिकाओं, न्युट्रोफिल, मैक्रोफेज एन.के., NKT, टी कोशिकाओं (एजी-विशिष्ट टी कोशिकाओं), बी कोशिकाओं आदि 3-10 जैसे विविध प्रतिरक्षा कोशिकाओं, शामिल हैं.
चित्रा 1. लिम्फोसाइटों क्लैमाइडिया muridarum साथ संक्रमित चूहों के जननांग इलाकों से अलग थे, यहाँ प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करके किया गया. प्रक्रिया के बाद पूरा जुदाई, लिम्फोसाइटों fluorochrome संयुग्मित CD3, CD4 और CD8 साथ दाग रहे थे. वृत्त का चतुर्थ भाग डेटा CD3 + लिम्फोसाइटों पर gated थे,CD4 दिखा + बनाम CD8 + के साथ और gated कोशिकाओं का प्रतिशत.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कैसे माउस जननांग इलाकों से लिम्फोसाइटों को तैयार करने के लिए और आसानी से महारत हासिल है. इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण बात करने के लिए बर्फ पर रखने के द्वारा कोशिकाओं सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए है. इस विधि से सेल उपज तकनीक पर निर्भर करता है, कौशल, माउस के संक्रामक स्थिति (अनुभवहीन या संक्रमण के बाद दिन), रोगज़नक़ (बैक्टीरियल, वायरल, फंगल) और murine प्रजनन पथ की जांच की धारा (डिंबवाहिनी, गर्भाशय से निपटने, योनि खंड या पूरे जननांग पथ). हमारे समूह और अन्य लोगों के माउस 5-7 जननांग पथ से अलग लिम्फोसाइट आबादी पर विभिन्न अध्ययनों को प्रकाशित किया है. हमारे हाथ पर एक अनुभवहीन माउस / BALB ग से पूरे जननांग पथ 2 उत्पन्न × 90% व्यवहार्यता के साथ कर सकते हैं 10 6 कोशिकाओं. कई अवसरों में, लिम्फोसाइटों आगे कार्यात्मक और / या प्रवाह cytometric 3-10 विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. हमारे विधि, CE द्वारा आमतौर पर इस्तेमाल किया अलगाव 11 विधि, के साथ तुलना मेंकरूँगा उपज 10 गुना वृद्धि हुई है. इस प्रक्रिया को अपेक्षाकृत लंबा है, लेकिन यह अलग लिम्फोसाइटों के अधिक उपयोग पर निर्भर करता है सरल किया जा सकता है. जब कोशिकाओं प्रवाह cytometry विश्लेषण जैसे गैर कार्यात्मक assays के लिए उपयोग किया जाता है, विधि Percoll ढाल कदम लंघन द्वारा shorted हो सकता है. इस पद्धति का एक शक्तिशाली और एक कुशल उपकरण mucosal लिम्फोसाइटों अध्ययन और संक्रामक रोग अनुसंधान में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, बाद में वैक्सीन के विकास की सुविधा प्रदान करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम धन (काक) R01 AI026328 R01 और AI079004 (काक) के अनुदान के लिए NIH शुक्रिया अदा करना है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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