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Immunology and Infection

कीट Published: December 11, 2012 doi: 10.3791/4392
Automatic Translation
1, 1, 1
1INRA, Micalis UMR1319, France

Summary

अधिक से अधिक मोम कीट के लार्वा के मौखिक और इंट्रा haemocolic संक्रमण

Protocol

1. कीट पालन

अंडे से पिछले instar लार्वा को पूरे चक्र के बारे में 25 डिग्री सेल्सियस में 5 सप्ताह तक रहता है एक या 2 अतिरिक्त सप्ताह वयस्क तितलियों को प्राप्त करने की जरूरत है.

  1. कम से कम 100 pupae या नव विलय कर दिया वयस्क जी रखें एक 5 लीटर पिंजरे तार जाल में मेल्लोनेल्ला तितलियों. नर तितलियों 10 से 15 मिमी उपाय. वयस्क नर कीट बेहोश प्रकाश और अंधेरे निशान के साथ बेज रंग है. 20 मिमी के आसपास महिला तितलियों उपाय. महिलाओं / भूरे रंग ग्रे रंग के साथ पुरुषों की तुलना में गहरा रहे हैं.
  2. अंडे बिछाने के लिए पिंजरे में चार स्तरों कागज के दो पैक निलंबित. 2 दिनों के बाद, वयस्क महिला कागज के बीच किनारे पर अंडे देना होगा.
  3. एक सप्ताह में दो बार, चलो हवा प्रसारित करने के लिए ग्रिड के साथ नए प्लास्टिक पालन बक्से में पैक अंडे कागज जगह है, पराग और मधुमक्खी मोम युक्त. अंडे के बारे में 3 दिनों में पक्षियों के बच्चे और छोटे लार्वा मोम और पराग पर खिला द्वारा विकसित करने के लिए शुरू. वैकल्पिक रूप से, एक कृत्रिम आहार consistin लार्वा पर रखा जा सकता है500 ग्राम तरल शहद, 400 छ ग्लिसरीन, 100 ग्राम सूखे बियर खमीर, 250 ग्राम गेहूं का आटा, 200 ग्राम स्किम मिल्क पाउडर और 400 ग्राम की खिचड़ी का एक मिश्रण के जी. लार्वा प्रति भोजन की उचित अनुपात प्रदान करते हैं, नियमित रूप से नए बक्से में लार्वा अलग और भोजन हर दो दिन की भरपाई होगी.
  4. लार्वा लार्वा स्टेडियम के छह चरणों के दौरान पाला जाता है. प्रत्येक स्टेडियम लार्वा के सिर कैप्सूल की slippage के द्वारा होती है. जब लार्वा प्यूपीकरण से पहले अंतिम चरण तक पहुँचते हैं, वे खिला बंद करो और एक हल्के रेशम कोकून निर्माण शुरू करते हैं.
  5. उनकी सुरक्षा ककून में लार्वा आराम और pupae में बदलना होगा. वैक्स कीड़े प्यूपा चरण में एक से दो सप्ताह के लिए रहने के लिए वयस्क पतिंगे में उभरने. वयस्क पतिंगे पीते हैं और न ही खाने को नहीं है. संभोग होता है और मोम 'कीड़े जीवन चक्र फिर से शुरू होता है.
  6. विकृति परख प्रमाण के अनुसार, पिछले लार्वा चरण के दौरान लार्वा ले. इस चरण के दौरान वे खिला बंद करो, पालन बॉक्स के कवर के लिए कदम और रेशम उत्पादन शुरू. इसtage 5 दिन के आसपास रहता है.

2. संक्रमण के लिए कीट चयन

  1. संक्रमण से पहले पिछले instar लार्वा, जो 2-3 सेमी लंबी और वजन में 180-250 मिलीग्राम 24 घंटे का चयन करें और उन्हें एक खाली बॉक्स में डाल करने के लिए उन्हें भूखे.
  2. लार्वा के आसपास नवजात रेशम कोकून निकालें.

3. बैक्टीरियल तैयारी

  1. बेसिलस जीवाणु निलंबन की तैयारी के लिए / CFU मिलीलीटर 1x10 अंतिम 10 4 कॉलोनी गठन (CFU) इकाइयों / मिलीलीटर से 10 CFU 8 / अंतर haemocoelic इंजेक्शन के लिए मिलीलीटर और 6 3x10 से लेकर सांद्रता 8 CFU / मिलीलीटर (CFU प्राप्त करने के लिए घूस के लिए प्राप्त करने के लिए एक 50 LD बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर करता है). हमारे मामले में, बी cereus Luria Bertani शोरबा माध्यम में उगाया जाता है (पौंड, 10 एल / छ tryptone, 5 एल / छ खमीर निकालने, 10 एल / छ NaCl) 37 पर ° C आंदोलन के तहत जब तक स्थिर चरण में प्रवेश, विकास की वक्रता इसी वक्र. आयुध डिपो 600 एनएम उपाय (1 और 2 के बीच बी के लिए ) cereus और इसका इस्तेमाल करने बैक्टीरियल एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए, एक पहले बनाया अनुमापन वक्र का उपयोग. कमरे के तापमान और फास्फेट में resuspend पर 10 मिनट के लिए 5,000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरिया buffered खारा (पीबीएस: 1M KH 2 4 पीओ, 1M 2 कश्मीर HPO 4, 5M NaCl, पीएच 7.2). प्रत्येक लार्वा वांछित एकाग्रता में बैक्टीरियल निलंबन के 10 μl प्राप्त होगा.
  2. वैकल्पिक रूप से, बीजाणु निलंबन संक्रमण के लिए तैयार किया जा सकता है. Sporulation मध्यम HCT (5 / छ एल tryptone, 2 ग्राम / एल कैसिइन hydrolyzate, 12.5 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, 12.5 मिमी MgSO 4, 0.05 मिमी 4 MnSO, ​​1.2 मिमी 4 ZnSO, 1.2 मिमी Fe में बैक्टीरिया संवर्धन द्वारा spores प्राप्त करें 2 (4 तो) 3, तो 0.5% 2 एच 4, 25 मिमी 2 CACL) 3 दिनों के लिए 20 30 डिग्री सेल्सियस. Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट spores (10,000 XG, 15 मिनट), और धो बाँझ आसुत जल में दो बार. बीजाणु pel Resuspendबाँझ आसुत जल और गर्मी में 78 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए चलो वनस्पति बैक्टीरिया को दूर करने के लिए शेष है. लेग अगर प्लेटों पर धारावाहिक dilutions चढ़ाना निलंबन गिनना. प्रत्येक लार्वा वांछित एकाग्रता में बीजाणु निलंबन के 10 μl प्राप्त होगा.

4. विष तैयारी रो

  1. बी से Cry1C विष तैयार thuringiensis 407 तनाव प्लाज्मिड pHTF31C जीन एन्कोडिंग Cry1C ले जाने के साथ 21 बदल दिया है. संस्कृति 30 में 100 मिलीलीटर HCT मध्यम में तनाव ° सी 72 के साथ मानव संसाधन के लिए (इरिथ्रोमाइसिन 10mg/ml) एंटीबायोटिक पूर्ण sporulation, विष क्रिस्टल और संस्कृति तैरनेवाला में उत्पादन मुक्ति की अनुमति.
  2. एक 72% -79% sucrose ढाल पर तैरनेवाला से क्रिस्टल शुद्ध. पहले एक 40 मिलीलीटर ट्यूब में 79% sucrose के 17 मिलीलीटर जोड़ने. 79% sucrose के शीर्ष पर 72% sucrose के ध्यान परत 17 मिलीलीटर. अंत में, परत 10X केंद्रित sporulated संस्कृति की 5-6 मिलीग्राम और ट्यूब बंद. 20,00 पर 14 घंटे के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र0 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, क्रिस्टल spores से अलग करने के लिए. ढाल इंटरफेस में क्रिस्टल लीजिए. 25 मिलीलीटर ठंड बाँझ पानी में क्रिस्टल गोली Resuspend इसे धोने. 20 मिनट के लिए 8000 XG पर अपकेंद्रित्र. यह कदम तीन बार दोहराया जाता है सभी क्रिस्टल चिपके sucrose हटा. 5 मिलीलीटर बाँझ पानी में क्रिस्टल Resuspend और खुर्दबीन के नीचे का पालन करने के लिए शुद्धता का मूल्यांकन.
  3. क्लासिक क्रिस्टल में 50 मिमी NaOH presolubilized समाधान पर ब्रैडफोर्ड धुंधला हो जाना द्वारा विष प्रोटीन एकाग्रता का मूल्यांकन. विष क्रिस्टल का उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

5. इंजेक्टर तैयारी

  1. सटीक इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए, सेटअप 1 μl / सेक (चित्रा 1 ए) की गति के साथ एक स्वचालित सिरिंज पंप (जैसे केडी वैज्ञानिक KDS 100) का उपयोग करें.
  2. 300 μl पानी के साथ एक 1 मिलीग्राम चमड़े के नीचे सिरिंज या 20-25 लार्वा के संक्रमण के लिए बैक्टीरिया समाधान (हालत प्रति सिरिंज 1) भरें. ध्यान टा बुलबुले निकालेंसिरिंज pping, तो सिरिंज एक 0.45 x 12 मिमी सुई देते हैं.
  3. सुई लगानेवाला में सिरिंज रखें.
  4. 10 μl के इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए एक खाली ट्यूब में एक खाली इंजेक्शन प्रदर्शन.

6. कीट Intrahaemocoelic इंजेक्शन

  1. अंगूठे और तर्जनी के बीच स्वयं कीट रखें. फिर लार्वा (छल्ली) त्वचा (चित्रा 1C) में सुई लगानेवाला में तय सुई डालने.
  2. जगह में कीट रखें, जबकि 10 μl बैक्टीरियल समाधान (बीजाणु या वनस्पति बैक्टीरिया) इंजेक्शन.
  3. ध्यान से सुई से कीट को हटा दें.
  4. एक छोटे पेट्री (व्यास में 5 सेमी) पकवान, पकवान प्रति 5 लार्वा में संक्रमित कीट रखें.
  5. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए कम से कम 20 लार्वा संक्रमित.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन 48 घंटे के लिए एक मशीन में रखें.

7. कीट जबरदस्ती खिलाने (घूस)

  1. एक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 0.2 / & ग्राम मीटर मिश्रणयू, या तो बीजाणु या वनस्पति सेल निलंबन के साथ Cry1C विष एल अंतिम 3x10 4 से 7 10 μl प्रति 1x10 लेकर सांद्रता प्राप्त करने के लिए.
  2. एक 30G साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें, बैक्टीरियल 20-25 लार्वा के संक्रमण के लिए Cry1C विष समाधान के 300 μl के साथ 25 मिमी चमड़े के नीचे सुई. सिरिंज से बुलबुले निकालें.
  3. जगह कीट मैन्युअल रूप से इतना है कि उसके मुंह सुई सुई लगानेवाला में तय (चित्रा 1D), और यह बैक्टीरियल स्वचालित सिरिंज पंप का उपयोग कर समाधान के 10 μl के साथ बल फ़ीड में प्रवेश करती है.
  4. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए कम से कम 20 लार्वा संक्रमित.
  5. एक छोटे से 5 सेमी पेट्री डिश (डिश प्रति 5 लार्वा) में संक्रमित कीट रखें. 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन 48 घंटे के लिए एक मशीन में रखें.

8. रिकॉर्डिंग कीट मृत्यु दर

  1. बल खिला या इंजेक्शन के प्रयोगों के बाद, भोजन के बिना 25 पेट्री डिश में लार्वा रखने डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस लार्वा मो जांचनियमित रूप से एक 48 घंटे की अवधि से अधिक rtality. मृत लार्वा निष्क्रिय कर रहे हैं और आमतौर पर काले (चित्रा 1B) बारी.
  2. मृत्यु दर डेटा लॉग Probit 14 कार्यक्रम का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इस कार्यक्रम खुराक मृत्यु घटता की linearity परीक्षण और घातक खुराक (50 एलडी) प्रदान करता है. वैकल्पिक रूप से, (ग्राफ़ पैड) चश्मे, अस्तित्व विश्लेषण या मृत्यु दर डेटा जैसे अन्य कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

जी में अंतर बैक्टीरिया की haemocoelic इंजेक्शन मेल्लोनेल्ला कई डाह ऊतकों को नुकसान और कई मानव रोगज़नक़ों सहज प्रतिरक्षा कारकों के लिए प्रतिरोध के साथ काम करने वाले कारकों की पहचान के लिए किया गया है और बहुत उपयोगी साबित हो. एक उदाहरण के रूप में, आंकड़ा 2A बी के विभिन्न खुराक के इंजेक्शन के बाद कीट मृत्यु दर का प्रतिनिधित्व करता है cereus (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों बैक्टीरिया) 22 चित्रा 2B जी के संक्रमण के बाद बैक्टीरिया अस्तित्व का प्रतिनिधित्व करता है Pseudomonas aeruginosa 4 द्वारा मेल्लोनेल्ला.

गैलेरिया का बी के लिए एक मौखिक संक्रमण के मॉडल के रूप में उपयोग cereus और बी thuringiensis Cry1C 10 विष की कीटनाशी गतिविधि पर वनस्पति या बैक्टीरिया spores के synergistic प्रभाव के मूल्यांकन पर निर्भर करता है. लार्वा बीजाणु / मिश्रण विष की घूस के लिए अतिसंवेदनशील हैं, लेकिन केवल कमजोर Cry1 की घूस के लिए अतिसंवेदनशीलसी अकेले विष. बैक्टीरिया के बाद सेप्टिसीमिया से लार्वा मौत परिणाम आंतों की बाधाओं के टूटने के बाद haemocoel तक पहुँच चुके हैं चित्रा 3 क्रिस्टल की घूस के बाद लार्वा मृत्यु दर का प्रतिनिधित्व करता है और या तो जंगली प्रकार या बैक्टीरिया बैसिलस 10 की उत्परिवर्ती उपभेदों.

कुछ बैक्टीरिया Galleria में मौखिक संक्रमण के लिए परीक्षण किया गया है. बीच में मानव रोगज़नक़ों बी, परीक्षण Cry1C विष के साथ cereus उपभेदों सबसे जी के लिए उग्र थे मौखिक संक्रमण के बाद 24 मेल्लोनेल्ला. इस विधि के लिए संक्रमण के औपनिवेशीकरण / गैस्ट्रो आंत्र पथ पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, लार्वा पाचन तंत्र के संक्रमण के बाद निकाला जा सकता है, और मेजबान सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया उपनिवेश की स्थापना संशोधनों histological आयल वर्गों पर देखे जा सकते हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की घूस प्रक्षेपवक्र और उपनिवेशवाद समर्थक का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैलार्वा के विभिन्न डिब्बों के साथ उपकर. अंत में, विभिन्न कीट डिब्बों में एक जीन की विशिष्ट अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट 25 माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है.

चित्रा 1
चित्रा 1 (ए) स्वचालित सिरिंज पंप सुई लगानेवाला. (बी) (शीर्ष, काले) मृत और जीवित जी (नीचे, सफेद) मेल्लोनेल्ला लार्वा. (सी) जीवाणु जी की haemocoel में इंजेक्ट कर रहे हैं मेल्लोनेल्ला लार्वा. (डी) जी. मेल्लोनेल्ला लार्वा बैक्टीरियल तैयारी के साथ बल से सिंचित कर रहे हैं: सुई कीट लार्वा के मुंह में प्रवेश करती है.

चित्रा 2
चित्रा 2 अंतर haemocoelic इंजेक्शन के बाद परिणाम. (ए) जी के खिलाफ CwpFM डाह मेल्लोनेल्ला लार्वा 22. बी के विभिन्न सांद्रता cereus wil(407 बीटी) घ - प्रकार और ΔcwpFM उत्परिवर्ती उपभेदों 20 जी के haemocoel में inoculated गया मेल्लोनेल्ला लार्वा. मृत्यु 24 घंटे के बाद 37 डिग्री सेल्सियस दर्ज किया गया था (बी) जी में Pseudomonas aeruginosa PA14 संक्रमण के समय पाठ्यक्रम 4 मेल्लोनेल्ला. लार्वा के अनुसार पच्चीस बैक्टीरिया बार शून्य पर अंतःक्षिप्त थे. लार्वा संकेत समय अंक के बाद संक्रमण पर कुचल रहे थे और बैक्टीरिया की गिनती चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया गया है. प्रत्येक डेटा बिंदु बैक्टीरिया की गिनती के 10 लार्वा के 10 समूहों से मतलब है और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है. लार्वा इंजेक्शन के बाद लगभग 48 घंटे की मृत्यु हो गई, जब बैक्टीरियल सांद्रता 10 9 / छ पर पहुंच गया.

चित्रा 3
चित्रा 3 जी में pathogenicity की एक मूल्यांकन के रूप में और spores Cry1C विष क्रिस्टल की योगवाहिता. मौखिक घूस 10 के बाद मेल्लोनेल्ला लार्वा जी. मेल्लोनेल्ला लार्वामौखिक रूप से या तो Cry1C विष क्रिस्टल (लार्वा प्रति 1 ग्राम) के साथ संक्रमित थे, या 10 बी के साथ 6 thuringiensis spores, या Cry1C विष और बी के एक मिश्रण के साथ thuringiensis spores. लार्वा मृत्यु दर 48 घंटा के बाद 25 डिग्री सेल्सियस पर मूल्यांकन किया गया था

चित्रा 4
चित्रा 4 लार्वा के मौखिक संक्रमण: उपनिवेशवाद और बैक्टीरिया के ऊतक स्थानीयकरण. (ए) नीले डाई समाधान के 10 μl बल खिला द्वारा एक जी के मुंह में पेश किया गया था मेल्लोनेल्ला लार्वा. लार्वा के नीले रंग के साथ भरा आंत प्रकट dissected किया गया था. (बी) बीटी 407 तनाव और Cry1C विष का एक मिश्रण जी में पेश किया गया बल खिला मेल्लोनेल्ला लार्वा. 24 घंटे के बाद, पूरे लार्वा आयल एम्बेडेड, कट और तय किया गया. Histological अनुदैर्ध्य वर्गों (hematoxylin और Eosine और ग्राम दबाव) दाग थे. प्रकाश सूक्ष्म तस्वीर (400X) पेट (गहरे बैंगनी) से पता चलता है और आंतों की सतह पर स्थानीय ग्राम दाग बेसिलस (अंधेरे बैंगनी). (सी) बीटी का एक मिश्रण 407-Gfp फ्लोरोसेंट तनाव और Cry1C विष जी में पेश किया गया बल खिला मेल्लोनेल्ला लार्वा. 24 घंटे के बाद, जीवाणु haemocoel तक पहुँच चुके हैं और कीट शव बी के साथ भरा है हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त cereus. Vivo में 25 (डी) Ilsa अभिव्यक्ति का विश्लेषण. Epifluorescence द्वारा सूक्ष्म टिप्पणियों बी पर प्रदर्शन किया गया cereus pHT315 - pilsA'gfp ले. जीवाणु मौखिक संक्रमण के बाद मृत लार्वा 24 घंटा की hemocoel से अलग थे. ग्रीन बैक्टीरिया Ilsa प्रमोटर के सक्रियण के कारण GFP की अभिव्यक्ति का संकेत मिलता है. यह जब बैक्टीरिया haemocoel तक पहुँच चुके हैं इस (Ilsa) जीन की विशिष्ट अभिव्यक्ति से पता चलता है.

1 मूवी कीट पेट में समाधान की निगलना मौखिक के बाद फैलआयन. नीले डाई समाधान के 10 μl बल खिला द्वारा यूरोपीय मक्का छिद्रक Ostrinia nubilalis लार्वा के मुंह में पेश किया गया था. डाई जल्दी से कीट लार्वा की आंतों लुमेन में भरता है. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

कीड़े और विशेष रूप से लार्वा चरण का उपयोग करते हैं, कई रोगजनकों के लिए संक्रमण के मॉडल के रूप में, लगातार हो रहा है. पसंद के कुछ पहलुओं के लिए एक मॉडल (मक्खी मॉडल) ड्रोसोफिला दोनों वयस्क और लार्वा चरण 1,2 के रूप में प्रयोग किया जाता है. lepidopteran कीट जी मेल्लोनेल्ला भी मुख्य रूप से किया गया है इंजेक्शन बैक्टीरियल डाह परख करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल किया. ड्रोसोफिला की तुलना में अधिक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस से ऊपर) (अधिकतम 25 डिग्री सेल्सियस) को बर्दाश्त करने का लाभ महत्वपूर्ण है जब स्तनपायी रोगजनकों के लिए अध्ययन किया जा रहे हैं. गैलेरिया का आकार संक्रमण कैनेटीक्स और ऊतकों को नुकसान का अध्ययन करने के लिए और अधिक सुविधाजनक है. अंत में, हमारे प्रोटोकॉल मौखिक संक्रमण है, जो पाचन तंत्र से संबंधित अध्ययन के लिए एक लाभ है Galleria का उपयोग करने की संभावना का वर्णन करता है. इसी तरह, एक और बड़ी कमला, Manduca Sexta, लार्वा चरण इंजेक्शन द्वारा haemocoel में संक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है और मौखिक 26 संक्रमण के लिए हाल ही में.बी मोरी और स्पोडोप्टेरा प्रजातियों, जो जीनोम के 27 अनुक्रम भी दिलचस्प विकल्प प्रदान करते हैं, और मेजबान जीन आरएनएआई तरीकों या अन्य जीन जोड़तोड़ 28 से बंद कर सकते हैं. यहाँ, हम एक सरल तरीका है, कैसे पीछे Galleria लार्वा, कैसे उन्हें संक्रमित और कैसे संक्रमण की प्रक्रिया का पालन करने के लिए और स्कोर मृत्यु दर के क्रम में इस तरह के मॉडल की क्षमता दिखाने पर कुछ उदाहरण में वर्णन है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम Elisabeth Guillemet, Christophe बूइसॉं और Ludovic Bridoux उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. हम बहुत Sylvie Salamitou और Sinda Fedhila प्रारंभिक प्रणाली की स्थापना के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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References

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Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C.,… More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

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