Summary
Procédé pour administrer des médicaments par voie intranasale à des souris éveillées dans le but de cibler le cerveau est décrit. Cette méthode permet de doses répétées sur de longues périodes en utilisant l'administration intranasale de médicament sans anesthésie, et nez-à-encéphalique livraison avec une exposition systémique minimale.
Abstract
L'administration intranasale est un procédé de délivrer des agents thérapeutiques dans le système nerveux central (SNC). Il est non-invasive et permet de grosses molécules qui ne traversent pas l'accès barrière hémato-encéphalique vers le SNC. Médicaments visent directement le système nerveux central avec l'administration intranasale, la réduction de l'exposition systémique et donc des effets secondaires indésirables systémiques 1. Livraison du nez vers le système nerveux central se produit en quelques minutes le long des deux voies de neurones olfactifs et trijumeau par une voie extra-cellulaire et ne nécessite pas de médicament à se lier à un récepteur ou le transport axonal 2. L'administration intranasale est une méthode largement diffusée et est actuellement utilisé dans des essais cliniques humains 3.
L'administration intranasale des médicaments dans des modèles animaux permet l'évaluation initiale de la distribution pharmacocinétique et l'efficacité. Avec la souris, il est possible d'administrer des médicaments aux animaux éveillés (non anesthésié) sur une base régulière à l'aide d'un spécialisée prise intranasale. Réveillez-livraison est bénéfique car elle permet à long terme de dosage chronique sans anesthésie, il faut moins de temps qu'avec l'anesthésie, et peut être appris et fait par de nombreuses personnes afin que les équipes de techniciens numéros dose peut grands de souris dans de courtes périodes. Efficacité des traitements administrés par voie intranasale de cette manière à des souris a été démontrée dans de nombreuses études, y compris l'insuline dans des modèles de souris diabétiques 4-6 et la déféroxamine chez des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. 7,8
La poignée intranasale chez la souris peut être appris, mais ce n'est pas facile et exige de la pratique, des compétences et une prise en main précise pour fournir efficacement des médicaments vers le cerveau et éviter de drainage pour le poumon et l'estomac. Les souris sont retenus à la main en utilisant une nuque modifié dans la main non dominante, avec le cou maintenue parallèlement au sol, tandis que la drogue est livré avec une pipette à l'aide de la main dominante. Il prend habituellement 3-4 semaines d'acclimatation à la manipulation avant les sourispeuvent être organisées avec cette poignée sans réponse au stress. Nous avons préparé cette vidéo JoVE pour rendre cette technique plus accessible administration intranasale.
Protocol
1. L'acclimatation à la manipulation de dosage par voie intranasale à des souris éveillées
Introduction
Les souris doivent être acclimatés à leur manipulation pendant une période de deux à quatre semaines avant le début de dosage par voie intranasale. L'acclimatation à la manipulation est importante, car elle permet d'assurer une position correcte du corps pour une efficacité maximale de l'administration de médicaments par voie intranasale éveillé. En outre, les souris qui n'ont pas été correctement habitués à ce processus peuvent avoir une réaction d'anxiété grave après l'administration. Souris devrait dépenser environ 2-3 jours sur chacune des neuf étapes avant de passer à l'étape suivante, selon le confort de l'animal à la manipulation. Le niveau de stress de la souris doit être utilisée comme une mesure du progrès. Cela signifie que la surveillance des mouvements de la souris, la quantité / fréquence de la miction, la défécation, des tremblements, et de mordre. Si une souris est une réaction de stress élevé, rester sur cette étape avant de passer à la suivante jusqu'à ce que la réponse est réduit. Un échantillon d'acclimatation schedule peut être vu dans le tableau 1. L'acclimatation des souris devrait progresser à travers les suivants une fois par jour étapes. La réalisation de ces étapes plus d'une fois par jour, dans une tentative d'accélérer l'acclimatation, il n'est pas recommandé.
- Placez la souris dans la paume de la main pendant une période de deux à trois minutes, pas plus d'un pied au-dessus du plafond de la cage, comme des animaux fréquemment sauter au cours de cette étape préliminaire. Si la souris tente de ramper hors de la main et jusqu'à son bras, il suffit de soulever la souris par la base de la queue et le replacer dans la main.
- Placez la souris dans la paume de la main pendant trois minutes et caresser l'animal doucement. Animaux de la souris directionnelle de la tête à la queue, tout en permettant à l'animal de se déplacer librement.
- Placez la souris dans la paume de la main pendant trois minutes tout en massant derrière les oreilles (légèrement pincer ensemble la peau sur le dos du cou en utilisant le pouce et l'index pointeur).
- Tenir / lipi la souris par la peau du cou pendant 30 secondes, en laissant le reste de la souris sur le plafond de la cage pendant 30 secondes avant de répéter la cale à nouveau.
- Maintenez la souris en utilisant la poignée intranasale, qui est décrit dans l'article 2, mais ne pas inverser l'animal (remplir jusqu'à l'étape 2.4). Tenir l'animal comme celui-ci pour une durée de 30 secondes et relâcher de nouveau au dessus cage. Répétez une seconde fois après une période de repos d'une minute.
- Maintenez la souris avec la poignée intranasale comme décrit dans la section 2, y compris inversant l'animal de sorte que son côté ventral est orientée vers le haut vers le plafond. Assurez-vous que le cou de l'animal est parallèle au sol. Maintenez cette position pendant 30 secondes. Répétez cette une deuxième fois après une période de repos d'une minute. Certaines souris résistent à l'emprise intranasale plus que d'autres, surtout quand il est utilisé pour la première fois avec inversion à cette étape de l'acclimatation. Si la souris se libère de l'emprise, de mettre la souris en arrière sur le plafond de la cage et re-prise. Répétez la re-prise si nécessaire, Mais de surveiller le niveau de stress de la souris et de le retourner à la cage si nécessaire. Un autre facteur qui peut jouer un rôle dans la perte de l'adhérence à ce point dans le processus d'acclimatation est l'inexpérience des gestionnaires d'animaux avec la technique de l'administration intranasale.
- Maintenez la souris avec la poignée intranasale, inverser, brièvement placer une pipette avec une pointe vide sur chaque narine, et maintenez la position pendant 30 secondes animaux. Répétez ceci après une période de repos d'une minute.
- Maintenez la souris avec la poignée intranasale, l'inverser, et par voie intranasale administrer 6 pl de sérum physiologique dans la narine gauche et à droite, comme décrit dans la section 3 (à l'étape 3.7).
- Maintenez la souris avec la poignée intranasale, inverti, et par voie intranasale administrer 6 pl de sérum physiologique dans la narine gauche et à droite deux fois de placer l'animal en arrière sur le plafond de la cage entre les deux, comme décrit dans la section 3.
2. Le Grip intranasale à des souris éveillées Immobiliser
- Placez la souris on le plafond de la cage.
- Avec le pouce et l'index de votre main dominante, maintenez la souris par la queue. Utilisation de votre majeur, l'annulaire et l'auriculaire, légèrement épingler la partie inférieure du corps vers le haut cage (figure 1A). Laissez la souris sur les barres de prendre comme vous étirer légèrement la souris sur et de mieux saisir la nuque.
- Avec le pouce et le majeur de votre main non dominante, pincez la souris fermement à la peau du cou (l'excès de peau) derrière le cou et les épaules. Tirez sur la peau lâche pour faire une tente de peau à travers les omoplates (figure 1B). Prenez le plus de peau possible, mais attention à ne pas tirer sur le muscle car cela pourrait causer un inconfort à la souris. Faites preuve de prudence afin de ne pas appliquer trop de pression à la cage thoracique de l'animal ou de la colonne vertébrale. Une pression excessive ou de traction de la peau peut entraîner une inhibition de la respiration dans certains cas.
- Placer rapidement l'index de votre main non dominante sur la tête de la souris commeprès du nez que possible et tirez sur la peau (figure 1C, 1D). Dans le même temps, faites glisser le pouce et le majeur vers la tête pour la position optimale. Idéalement, la souris ne devrait pas être en mesure de bouger sa tête verticalement ou horizontalement.
- Tout en maintenant la poignée sur la nuque, remettez la souris sur son dos. Dos de la souris doit se trouver dans la paume de votre main. Tenez fermement la queue de la souris (près de la base) contre votre paume avec vos deux derniers doigts (annulaire et auriculaire) pour stabiliser la souris, ou vous pouvez envelopper vos doigts sur le bas du corps (figure 1E, 1F).
- À ce stade, faire en sorte que le cou de la souris et le menton sont planes et parallèles au sol. Le menton doit être proche d'un angle de 180 degrés avec le cou autant que possible pour aider à l'administration intranasale. De légères modifications dans l'angle peut causer le médicament à se retrouver dans le mauvais site. Assurez-vous que la souris est capable de respirer en regardant l'abdomen. Le sho sourisuld ne pas être en mesure de se déplacer, mais doit être confortable et pas du tout la douleur. Si vous voyez le cou de la souris et le menton de faire un "V", alors vous devez re-prise.
3. Livraison intranasale de drogues à des souris éveillées
Introduction
Intranasale en utilisant la poignée, chaque souris est retenu et maintenu avec deux fois leur cou parallèle au sol pendant que le volume de 20-30 l de liquide est administré. Ce volume est sûr et efficace pour les petites et grandes souris, nous utilisons généralement 24 ul, et qui est décrite dans ce protocole. La méthode éveillé intranasale peut être utilisé chez des souris de tout âge, par exemple chez des souris nouveau-nés pour la recherche en neurosciences du développement. Chez les souris nouveau-nés, un plus petit volume total (8 pi) et la taille des gouttelettes (1 pi) doit être utilisé pour recevoir le plus petit volume de la cavité nasale. Médicament est généralement livrés à deux souris à la fois, en alternant des périodes de repos pour rendre l'utilisation plus efficace du temps et de garder oannexe n. Set-up sera un peu différent selon si vous êtes logés en groupe de dosage souris ou souris logés individuellement. Avec les souris logés individuellement, il est utile de placer tous vos documents entre les cages pour empêcher les souris de la traversée vers le plafond de la cage d'autre part. Avec le groupe-logés souris, la dose de la cage uniquement. Il est important que chaque souris dans une cage logés en groupe reçoit le même traitement par voie intranasale, le potentiel de contamination croisée des deux traitements différents existe en raison de l'expulsion de drogues dans l'air ou par contact cutané. Il est fortement recommandé qu'une feuille de dosage est imprimé à l'avance, pour rappeler aux techniciens de missions de soins, d'enregistrer des notes de gouttes manqués, de noter état de santé général de chaque animal, etc
Mesures
- Mettre en place des cages où ils devraient être pour le dosage, et mettre en place une station de dosage (figure 2).
- Enlevez la souris de la cage et de garder le plafond de la cage pendant le dosage.
- Ramassez la souris en utilisant la poignée intranasale décrit dans la section 2.
- En utilisant votre main dominante, chargez la pipette avec 6 pl de médicament ou de véhicule. Placer l'embout de la pipette remplie près de la narine gauche de la souris, généralement à un angle de 45 degrés (figure 1G, 1H). Si vous avez une solution visqueuse, vous devrez peut-être augmenter votre angle de 90 degrés, car le médicament peut s'exécuter sur le côté de la pointe de pipette au lieu de faire une chute. S'il est très visqueux, essuyant la pointe de la pipette avec un mouchoir avant l'expulsion du liquide peut aider. Lentement éjecter le médicament pour former une petite goutte avec environ la moitié du volume (3 pi).
- La gouttelette doit être placé suffisamment près de narine de la souris pour que la souris peut inhaler la gouttelette. Immédiatement après que la souris inhale cette petite goutte, éjectez le reste du médicament dans l'embout de pipette pour former une autre petite goutte pour la souris à inhaler par la même narine environ 2-3 secondes plus tard. Soyez sûr de regarder la bouche. S'il ya is tout liquide dans la bouche, la baisse n'a pas réussi pleinement dans le nez et ceci doit être noté.
- Maintenez la souris dans cette position pendant 15 secondes. Il est fortement recommandé que la minuterie est utilisée pour normaliser cette attente 15 sec.
- Répétez les étapes 3,3 à 3,6 pour la narine droite. Si des gouttes sont sniffée sur, cette baisse doit être remplacé et il a noté.
- Placez la souris de retour au sommet de sa cage pendant 2 min. Répétez l'ensemble du processus à partir du 2 min. après la livraison de la première goutte. Cela donne la souris quatre gouttes de 6 pi chacun, totalisant 24 ul de solution. Un exemple d'horaire pour le dosage d'un ou deux souris à la fois peut être vu dans le tableau 2.
- Après la souris a reçu toutes les gouttes, retournez la souris dans sa cage.
4. Techniques générales de manipulation des animaux pour l'acclimatation et l'administration intranasale de drogues à des souris éveillées
Après chaque séance d'acclimatation ou de dosage par voie intranasale, les souris doivent être donnerna traiter, par exemple un Cheerio ou les graines de tournesol décortiquées comme renforcement positif. Treats sont donnés comme une récompense et de les détourner de gratter le nez, ce qui pourrait causer des blessures à eux-mêmes. Lorsque vous travaillez avec des souris logés en groupe, des friandises devraient être suffisamment baissé pour chaque souris. Avant de rentrer les animaux dans leurs cages n'oubliez pas de restaurer les nids à leur état original, afin de réduire le stress. Lors du dosage des animaux logés en groupe, les gants doivent être changés entre le dosage des cages afin de ne pas transférer odeur de la colonie cage à cage colonie, car ils deviennent agressifs les uns envers les autres.
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Representative Results
Il ya plusieurs façons de déterminer l'efficacité de l'administration de médicaments. La première consiste à administrer par voie intranasale un colorant, comme l'encre de Chine ou de bleu de méthylène et de visualiser le colorant après l'euthanasie de l'animal au sein de l'épithélium olfactif et après que le cerveau est retiré, l'entrée du SNC à travers la lame criblée. La seconde consiste à mesurer le médicament administré, soit en utilisant une étiquette radio-étiqueté ou en utilisant ELISA de détection de la molécule non marquée. Un bon exemple de la distribution des médicaments du système nerveux central après l'administration à des souris éveillées peuvent être trouvés dans Hanson et al. 2012 7. Nous prévoyons que le bulbe olfactif et du nerf trijumeau pour contenir une forte concentration de la substance inhalée. Au 30 min après l'administration intranasale de 3,65 pmol déféroxamine, les concentrations dans le nerf trijumeau et du nerf olfactif avait 29 uM et 13 uM respectivement. Concentrations de médicament sera évident dans toutes les régions du cerveau (dans cet exemple un range de 0,6 à 4,1 uM uM a été mesurée) avec des concentrations plus élevées dans les zones bénéficiant d'entrée des nerfs olfactifs et du trijumeau. Par exemple, les régions rostrales du cortex contient des concentrations plus élevées que caudale du cortex et de la protubérance contient des concentrations plus élevées que le mésencéphale ou médullaire. Dans la moelle épinière d'un gradient de concentration décroissant à partir du col de la colonne lombaire est généralement observé (dans cet exemple un gradient de 1,5 pM à 2,0 uM). L'administration intranasale entraîne également des concentrations élevées de médicament atteignant les méninges et des ganglions lymphatiques cervicaux. La troisième façon de démontrer l'efficacité de la prestation est de mesurer une réponse comportementale ou biochimique du médicament administré. Par exemple, le traitement déféroxamine intranasale chez des souris transgéniques Alzheimer a entraîné une amélioration des performances dans une tâche de mémoire spatiale 7 et la phosphorylation de la glycogène synthase kinase 3 bêta 9.
| Jour | Action | |
| 1 | M | Maintenez la position pendant ~ 2-3 min |
| 2 | Tu | Maintenez la position pendant ~ 2-3 min |
| 3 | W | Maintenir et animaux de compagnie ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Maintenir et animaux de compagnie ~ 2-3 min |
| 5 | Fa | Légèrement pincée ou nuque |
| 6 | M | Légèrement pincée ou nuque |
| 7 | Tu | Scruff et un ascenseur |
| 8 | W | Scruff et un ascenseur |
| 9 | Th | Grip intranasale |
| 10 | Fa | Grip intranasale |
| 11 | M </ Td> | Intranasale (IN) Grip et Inverser |
| 12 | Tu | Intranasale (IN) Grip et Inverser |
| 13 | W | EN Grip, Inverser, placez la pointe de pipette près du nez |
| 14 | Th | EN Grip, Inverser, placez la pointe de pipette près du nez |
| 15 | Fa | EN Grip, Inverser, 1 tour offrir une solution saline à chaque narine |
| 16 | M | EN Grip, Inverser, 1 tour offrir une solution saline à chaque narine |
| 17 | Tu | EN Grip, Inverser, offrir une solution saline 2 tours à chaque narine |
| 18 | W | EN Grip, Inverser, offrir une solution saline 2 tours à chaque narine |
Tableau 1. Exemple d'horaire pour l'acclimatation à la manipulation de dosage par voie intranasale à des souris éveillées.
* La pipette est chargé une fois avec 6 pi, mais administré à la souris comme 2 x 3 gouttes ul.
Tableau 2. Exemple de calendrier de dosage pour un ou deux souris.
Figure 1. Photos des différentes étapes et les angles de la tenue d'une souris pour administration intranasale éveillé de drogue. 1A) Maintenez la souris enfoncé fermement sur le plafond de la cage avec la main dominante en laissant les épaules exposées à saisir la peau. 1B) Utilisez le pouce et le majeurde la main non dominante pour saisir et tirer la peau juste derrière les omoplates. 1C) Utilisez l'index pour tirer la peau à partir entre les yeux vers le pouce et le majeur (vue de face). 1D) Idem 1C (côté vue). 1E) Maintenez la souris à l'envers en utilisant la bague au doigt et / ou rosé pour fixer la base de la queue à la paume de la main. Le cou de la souris doit être horizontal. 1F) Identique à E, de l'autre côté. 1G) Administrer des médicaments avec une pipette 20 ul et embout de pipette gel de chargement. 1H) Identique à 1G, close-up vue.
Figure 2. Une photo d'une station de dosage complet pour 2 souris logés individuellement. Inclus sont les deux cages à souris avec assez de distance entre pour garder les souris séparée, une pipetteteur avec des conseils, un conteneur pour les embouts utilisés, une minuterie, la feuille de dosage, un régal après l'administration (comme les graines de tournesol ou de Cheerios), lingettes hygiéniques, un P20 (ou P10) pipette, et le médicament à administrer.
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Discussion
Cette méthode montre comment souris peut être donné régulièrement des doses de médicaments par voie intranasale pour cibler le cerveau sans l'utilisation de l'anesthésie. De drogues par voie intranasale peuvent être livrés à de grands groupes de souris pendant de longues périodes de temps avec un minimum d'effort. Un seul groupe d'un maximum de 20 souris par voie intranasale peuvent être traitées par une seule personne en moins d'une heure. Une vaste gamme de molécules, allant de petites chélateurs du fer aux facteurs de croissance aux cellules souches mésenchymateuses, il a été démontré cibler rapidement le système nerveux central et ont démontré leur efficacité dans des modèles de rongeurs. Les mécanismes proposés de la livraison directe du nez au cerveau incluent le transport extracellulaire le long des nerfs olfactifs et du trijumeau et les flux de vrac dans les espaces périvasculaires 1,10. L'administration intranasale du SNC est une technique particulièrement utile car non seulement il est rapide, mais il vise le SNC réduire l'exposition systémique. Par exemple, l'administration intranasale de déféroxamine à des rats a entraîné 3-19 fois plus élevé concentrations dans les régions du cerveau avec 28 fois plus faibles concentrations dans le sang 11. Dans un autre exemple, l'insuline administré par voie intranasale améliore la mémoire chez les patients Alzheimer dans les 15 min sans modification des concentrations plasmatiques d'insuline ou de glucose 12. Un avantage supplémentaire est la non-invasif de la technique d'administration intranasale.
Il existe plusieurs limites à cette méthode. Tout d'abord, l'administration de médicaments est limitée à environ 20-30 pi dans une administration unique, donc la solubilité de la thérapeutique jouera un rôle dans la détermination des limites de dose. En outre, la formulation médicamenteuse est important que les facteurs tels que le pH et la salinité peut affecter la livraison. Grandes déviations par rapport aux conditions naturelles, telles que le pH et la salinité extrême, peut endommager l'épithélium respiratoire et olfactif de souris 13,14. De plus, le dosage intranasale chez des souris non anesthésiées peut être difficile à maîtriser, et peut prendre plusieurs semaines de formation pour intranasale "doseurs "pour être en mesure de Minimiser "tête de manœuvre room" et obtenir un fonctionnement optimal de dosage de médicament par voie intranasale. Avec la technique de dosage incorrect, le médicament peut s'écouler dans le poumon ou de l'estomac, ce qui peut introduire une variabilité dans la drogue d'atteindre le cerveau. Signes que cela a eu lieu, sont des difficultés respiratoires ou la visualisation de liquide dans la bouche après l'administration. Si possible, il est conseillé de limiter nouvelles intranasale "doseurs" à fournir une solution saline / véhicule pour contrôler les groupes pendant plusieurs semaines, voire des mois avant qu'ils soient approuvés à la drogue dose par des formateurs experts. Enfin, cette méthode éveillé intranasale est limitée à des souris, les rats éveillés et les grands animaux ne sont pas aussi facilement saisie, et peut être trop stressé lorsqu'il est maintenu à l'envers.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les soins des animaux HealthPartners institutionnel et l'utilisation à l'hôpital Comité des régions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
