Summary
En metode til å intranasalt administrere legemidler til våken mus for den hensikt målretting hjernen er beskrevet. Denne metoden gjør det mulig for gjentatt dosering over lengre perioder med intranasal administrering av narkotika uten bedøvelse, og nesen til hjernen levering med minimal systemisk eksponering.
Abstract
Intranasal administrering er en metode for å levere terapeutiske midler til det sentrale nervesystemet (CNS). Det er ikke-invasiv og tillater store molekyler som ikke krysser blod-hjerne barrieren tilgang til sentralnervesystemet. Narkotika direkte rettet til CNS med intranasal produksjonstid, redusere systemisk eksponering og således uønskede systemiske bivirkninger 1. Produksjonstid fra nesen til CNS forekommer innen minutter langs både olfactory og trigeminal nervebaner via en ekstracellulær ruten, og krever ikke stoff å bindes til ethvert reseptor eller aksonal transport to. Intranasal levering er en bredt omtalt metode og blir nå brukt i kliniske studier 3.
Intranasal levering av legemidler i dyremodeller gir innledende evaluering av farmakokinetiske distribusjon og effekt. Med mus, er det mulig å administrere legemidler til våken (ikke-bedøvet) dyr på en regelmessig basis ved hjelp av en specialized intranasal grep. Awake levering er gunstig fordi det gir mulighet for langvarig kronisk dosering uten bedøvelse, tar det kortere tid enn med anestesi, og kan læres og gjøres av mange mennesker, slik at grupper av teknikere kan dose stort antall mus i korte perioder. Effekt av legemiddelselskap administreres intranasalt på denne måten til mus har blitt vist i en rekke studier, inkludert insulin hos diabetikere musemodeller 4-6 og deferoksamin i Alzheimers musemodeller. 7,8
Den intranasale grep for mus kan læres, men er ikke lett og krever øvelse, dyktighet, og en presis grep å effektivt levere medikament til hjernen og unngå drenering til lungen og magen. Mus sikres for hånd med en modifisert scruff i den ikke-dominante hånd med halsen holdt parallelt med gulvet, mens stoffet er levert med en pipetten med den dominerende hånd. Det tar vanligvis 3-4 uker acclimating håndtering før muskan holdes med dette grepet uten en stressrespons. Vi har forberedt dette Jove video for å gjøre dette intranasal levering teknikken mer tilgjengelig.
Protocol
1. Akklimatisering til Håndtering for Intranasal Dosering til Awake Mus
Innledning
Mus må acclimated håndtering for en periode på 2-4 uker før start av intranasal dosering. Akklimatisering til håndtering er viktig, ettersom det bidrar til å sikre en korrekt kroppsstilling for maksimal effektivitet våken intranasal levering av legemidler. I tillegg, kan mus som ikke er korrekt vant til denne prosessen har en alvorlig angst reaksjon etter dosering. Mus bør bruke ca 2-3 dager på hver av ni trinn før du går videre til neste trinn, avhengig av dyrets komfort til håndtering. Musens stressnivå bør brukes som et mål på fremgang. Dette betyr overvåking musens bevegelser, mengden / hyppigheten av vannlating, avføring, skjelving, og biting. Hvis en mus har en høy stressrespons, opphold på dette trinnet før du går videre til neste inntil responsen er redusert. En prøve tilvenning schedule kan sees i tabell 1.. Akklimatisering av musene bør gå frem gjennom følgende gang-en-dag trinn. Utfører disse trinnene mer enn én gang per dag, i et forsøk på å akselerere akklimatisering, anbefales ikke.
- Plassere musen i håndflaten for en periode på 2-3 minutter, ikke mer enn en fot over buret toppen, som dyr ofte hoppe under denne innledende trinnet. Dersom musen forsøker å krype ut av hånden og opp en arm, bare løfte musen ved haleroten og legg den tilbake i en hånd.
- Plasser musen i hånden, for tre minutter og pet dyret forsiktig. Pet musen retningsbores fra hodet til halen, mens du lar dyret til å bevege seg fritt omkring.
- Plasser musen i hånden, for tre minutter mens masserer bak ørene (lett å klemme sammen huden på baksiden av halsen ved hjelp av tommelen og pekefingeren).
- Hold / lift musen ved nakkeskinnet i 30 sek, la musen hvile på buret toppen i 30 sek før du gjentar hold igjen.
- Hold musen med intranasal grep, som er beskrevet i kapittel 2, men ikke snu dyret (komplett opp til trinn 2.4). Hold dyret som dette for en periode på 30 sek, og slippes tilbake til buret toppen. Gjenta en gang til etter ett minutts pause.
- Hold musen med intranasal grep som beskrevet i kapittel 2, inkludert snu dyret så det ventral side vender opp mot taket. Kontroller at dyrets nakke er parallelt med gulvet. Hold denne posisjonen i 30 sekunder. Gjenta dette en gang til etter ett minutts pause. Noen mus vil motstå den intranasale grep mer enn andre, spesielt når de brukes for første gang med invertering på dette trinnet i akklimatisering. Dersom musen frigjør seg fra grepet, la musemarkøren tilbake på buret toppen og re-grep. Gjenta re-grep om nødvendig, Men overvåke stressnivået av musen og returnere det til buret om nødvendig. En annen faktor som kan spille en rolle i å miste grepet på dette punktet i akklimatisering prosessen er uerfarenhet av Dyretemmere med intranasal levering teknikk.
- Hold musen med intranasal grep, invertere, kort plassere en pipetten med en tom velter hvert nesebor, og hold dyrene stilling i 30 sek. Gjenta dette etter ett minutts pause.
- Hold musen med intranasal grep, snu det, og intranasalt administrere 6 pl saltvann inn i venstre og høyre nblir som beskrevet i § 3 (gjennom trinn 3.7).
- Hold musen med intranasal grep, invertsukker det og intranasalt administrere 6 pl saltvann inn i venstre og høyre nblir dobbelt plassere dyret tilbake på buret toppen i mellom, som beskrevet i avsnitt 3.
2. Den Intranasal Grip til Immobilize Awake Mus
- Plasser musen on buret toppen.
- Med tommelen og pekefingeren på din dominante hånd, hold musen ved halen. Bruke midten, ring, og pinky fingrene, lett pin den nedre delen av kroppen til buret toppen (figur 1A). La musen ta tak stolpene som du lett strekke musen ut og bedre grip scruff.
- Med tommelen og langfingeren på din ikke-dominant hånd, klemme musen fast på Scruff (overflødig hud) bak nakke og skuldre. Trekker opp på den løse huden å foreta et telt av huden over skulderbladene (figur 1B). Ta så mye hud som mulig, men vær forsiktig med å trekke opp muskel som dette vil medføre ubehag for musen. Utvise forsiktighet for ikke å bruke for mye press til dyrets brystkasse eller ryggraden. Overtrykk eller trekking av huden kan føre til hemming av respirasjon i noen tilfeller.
- Raskt plassere pekefingeren på ikke-dominant hånd på musen hode somnær nesen som mulig og trekke tilbake på huden (figur 1C, 1D). Samtidig, skyv tommelen og langfingeren mot hodet for optimal posisjon. Ideelt bør musen ikke kunne flytte hodet vertikalt eller horisontalt.
- Samtidig opprettholde grep på Scruff, slår musen over på ryggen. Musens tilbake bør være i håndflaten. Hold fast musens hale (nesten nederst) mot håndflaten med siste to fingre (ring og pinky) for å stabilisere musen, eller du kan klemme fingrene over underkroppen (Figur 1E, 1F).
- På dette punktet kontrollere at musens hals og hake er flate og parallelt med gulvet. Haken skal være nær en 180 graders vinkel med halsen så mye som mulig for å hjelpe til med intranasal levering. Små endringer i vinkelen kan føre til at stoffet til å ende opp i feil område. Kontroller at mus er i stand til å puste ved å se på magen. Musen should ikke kunne bevege seg, men bør være komfortable og ikke i noen smerte. Hvis du ser musens halsen og haken gjør en "V", så må du re-grep.
3. Intranasal Levering av Drug til Awake Mus
Innledning
Bruke intranasal grep, blir hver mus behersket to ganger og holdt med deres hals parallell med gulvet mens et volum på 20-30 pl væske administreres. Dette volumet er trygt og effektivt for små store mus, vi bruker vanligvis 24 ul, og som er beskrevet i denne protokollen. Den våken intranasal metoden kan brukes i mus i alle aldre, for eksempel hos nyfødte mus for utviklingsbiologi nevrovitenskapelig forskning. I nyfødte mus, bør en mindre totale volum (8 pl) og dråpestørrelse (1 ul) brukes til å betjene den mindre volum av nesehulen. Stoffet er vanligvis leveres til to mus på en gang, vekslende hvileperioder å få mest mulig effektiv bruk av tid og holde on planen. Set-up vil være litt forskjellig avhengig av om du dosering gruppe huset mus eller individuelt plassert mus. Med de individuelt huset mus, er det nyttig å plassere alle dine materialer i mellom merdene for å hindre mus fra krysset over til den andre buret toppen. Med gruppen-huset mus, dose fra at buret bare. Det er viktig at hver mus i en gruppe-huset buret mottar den samme intranasal behandling, da potensialet for krysskontaminering av to forskjellige behandlinger eksisterer på grunn av narkotika utviste i luften eller med hudkontakt. Det anbefales sterkt at en dosering ark skrives på forhånd, for å minne teknikere behandlingsmetoder oppdrag, å spille inn noen notater av tapte dråper, å merke generell helse for hvert dyr, etc.
Trinn
- Sett opp merder der de bør være for dosering, og sette opp en dosering stasjon (Figur 2).
- Fjern mus fra buret og holde på buret toppen under dosering.
- Plukk opp musen med intranasal grep beskrevet i kapittel 2.
- Bruke din dominerende hånd, legger pipetten med 6 ul av narkotika eller kjøretøy. Plasser tuppen av den fylte pipetten nær musens venstre nesebor, vanligvis ved en 45 graders vinkel (figur 1G, 1H). Hvis du har en tyktflytende løsning må du kanskje øke ditt vinkel til 90 grader fordi stoffet kan kjøre opp på siden av pipettespissen stedet for å lage en dråpe. Hvis det er veldig viskøs, kan tørke pipettespissen med en vev før utvise væske hjelpe. Langsomt mate stoffet for å danne en liten dråpe med omtrent halvparten av volumet (3 pl).
- Dråpen bør plasseres nær nok til musens nesebor slik at musen kan inhalere dråpe. Umiddelbart etter at musa inhales denne liten dråpe, mate resten av legemiddelet i pipettespissen å danne en annen liten dråpe for musen til å inhalere gjennom samme nesebor ca 2-3 sek senere. Pass på å se munnen. Hvis det jegs væske i munnen, gjorde fallet ikke gjøre det helt inn i nesen, og dette bør bemerkes.
- Hold musen i denne posisjonen i 15 sekunder. Det anbefales sterkt at en tidtaker brukes til å standardisere dette 15 sek hold.
- Gjenta trinn 03.03 til 03.06 for høyre nesebor. Hvis noen dråper er sniffet ut, bør det dråpe byttes ut og noteres.
- Plassere musen tilbake på toppen av buret i 2 min. Gjenta hele prosessen starter 2 min. etter levering av den første dråpen. Dette gir musen fire dråper 6 pl hver sammen 24 ul oppløsning. En prøve tidsplan for dosering en eller to mus på en gang kan sees i Tabell 2.
- Etter at musa har mottatt alle dråper, returnere musen til buret sitt.
4. Generelle Animal Handling Teknikker for Akklimatisering og Intranasal levering av stoff til Awake Mus
Etter hvert akklimatisering eller intranasal dosering økten, bør mus være gina behandle, for eksempel en Cheerio eller skrelt solsikkefrø som positiv forsterkning. Behandler er gitt som en belønning og for å distrahere dem fra å skrape nesen, og potensielt forårsake skade på dem selv. Når du arbeider med gruppen huset mus, bør nok godbiter bli droppet for hver mus. Før du returnerer dyr til burene være sikker på å gjenopprette reir til sine opprinnelige statene for å redusere stress. Når dosering gruppe plassert dyr, må hansker endres mellom dosering av merder for ikke å overføre lukt fra buret koloni til merd koloni, som de vil bli aggressive mot hverandre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er flere måter å bestemme effekten av levering av legemidler. Den første er å intranasalt administrere et fargestoff, som India blekk eller metylenblått og visualisere fargestoffet etter eutanasi av dyret innenfor lukteepitelet og etter hjernen fjernes, inn sentralnervesystemet via cribriform plate. Det andre er å måle medikament enten ved hjelp av en radio-merket tag eller hjelp av ELISA påvisning av den umerkede molekylet. Et godt eksempel på medikament-distribusjon i CNS etter administrering til våken mus kan bli funnet i Hanson et al. 2012 7. Vi forventer luktelappen og trigeminusnerven å inneholde en høy konsentrasjon av medikamentet levert. 30 minutter etter intranasal administrasjon av 3,65 mikromol deferoksamin, var konsentrasjonene i trigeminusnerven og luktenerven 29 uM og 13 uM hhv. Legemiddelkonsentrasjoner vil være tydelig i alle regioner av hjernen (i dette eksempelet en range på 0,6 pM til 4,1 mikrometer ble målt) med høyere konsentrasjoner i områder som får innspill fra olfactory og trigeminal nerver. For eksempel vil rostral regioner av hjernebarken inneholde høyere konsentrasjoner enn Caudal cortex og pons vil inneholde høyere konsentrasjoner enn midbrain eller medulla. I ryggmargen synkende konsentrasjonsgradient fra cervical til lumbalcolumna sees vanligvis (i dette eksempelet en gradient av 1,5 pM til 2,0 pM). Intranasal administrasjon resulterer også i høye konsentrasjoner av stoffet nådde hjernehinnene og livmorhalskreft lymfeknuter. Den tredje måten for å påvise effekten av produksjonstid er å måle en atferdsmessig eller biokjemisk reaksjon på stoffet administreres. For eksempel, resulterte intranasal deferoksamin behandling av transgene Alzheimers mus i forbedret ytelse i en romlig hukommelse oppgave 7 og fosforylering av glykogensyntasekinase 3 beta 9.
| Dag | Handling | |
| 1 | M | Hold for ~ 2-3 min |
| 2 | Tu | Hold for ~ 2-3 min |
| 3 | W | Hold og kjæledyr ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Hold og kjæledyr ~ 2-3 min |
| 5 | F | Lett klype eller scruff |
| 6 | M | Lett klype eller scruff |
| 7 | Tu | Scruff og heis |
| 8 | W | Scruff og heis |
| 9 | Th | Intranasal Grip |
| 10 | F | Intranasal Grip |
| 11 | M </ Td> | Intranasal (IN) Grip og Invert |
| 12 | Tu | Intranasal (IN) Grip og Invert |
| 13 | W | I Grip, Inverter, plasserer pipettespiss nær nesen |
| 14 | Th | I Grip, Inverter, plasserer pipettespiss nær nesen |
| 15 | F | I Grip, Inverter, levere en runde saltvann til hver nblir |
| 16 | M | I Grip, Inverter, levere en runde saltvann til hver nblir |
| 17 | Tu | I Grip, Inverter, levere to runder saltvann til hver nblir |
| 18 | W | I Grip, Inverter, levere to runder saltvann til hver nblir |
Tabell 1. Eksempel Tidsplan for akklimatisering til Vedlikehold Til Intranasal Dosering til Awake Mus.
* Den pipetten er lastet gang med 6 ul, men administrert til mus som 2 x 3 pl dråper.
Tabell 2. Eksempel Tidslinje for Dosering En eller to mus.
Figur 1. Bilder av ulike stadier og vinkler holder en mus for våken intranasal levering av narkotika. 1a) Hold musen hardt ned på buret toppen med den dominerende hånd forlater skuldrene utsatt å gripe huden. 1B) Bruk tommelen og langfingerenav den ikke-dominante hånd for å gripe og trekke opp huden like bak skulderbladene. 1C) Bruk pekefingeren til å trekke huden tilbake fra mellom øynene mot tommelen og langfingeren (sett forfra). 1D) Samme som 1C (side vis). 1E) Hold musen opp ned ved hjelp av ringfingeren og / eller pinky å sikre haleroten til håndflaten. Halsen på musen skal være vannrett. 1F) Samme som E, fra andre siden. 1G) Administrere medikament med en 20 pl pipetten og gel lasting pipettespissen. 1H) Samme som 1G, nærbilde.
Figur 2. Et bilde av en komplett dosering stasjon for to individuelt huset mus. Inkludert er de to mus bur med nok avstand mellom å holde mus separat, en pipettetor med tips, en beholder for brukte tips, et tidsur, dosering ark, en post-dosering godbit (som solsikkefrø eller cheerios), sanitære servietter, en P20 (eller P10) pipetten, og stoffet skal leveres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden viser hvordan mus kan gis regelmessige doser intranasal stoff å målrette hjernen uten bruk av anestesi. Intranasal stoffet kan leveres til store grupper av mus i lengre perioder med minimal innsats. En enkelt gruppe på opptil 20 mus kan intranasalt behandles av en enkelt person på mindre enn en time. Et stort utvalg av molekyler, alt fra små jern chelatorer til vekstfaktorer til stamceller, har vist seg å raskt målrette CNS og har vist effekt i gnagere modeller. Forslag mekanismer for direkte levering fra nesen til hjernen er ekstracellulære transport langs olfactory og trigeminal nerver og bulk flyt innenfor perivaskulære mellomrom 1,10. Intranasal levering til CNS er en spesielt nyttig teknikk fordi ikke bare er det rask, men det er rettet mot CNS redusere systemisk eksponering. For eksempel, resulterte intranasal administrasjon av deferoksamin til rotter i 3-19 ganger høyere concentrations i hjernen regioner med 28 ganger lavere konsentrasjoner i blodet 11. I et annet eksempel, forbedrer intranasalt administrert insulin minne i Alzheimers-pasienter innen 15 minutter uten å endre plasmanivåene av insulin eller glukose 12. En ytterligere fordel er den ikke-invasivitet av intranasal levering teknikk.
Det er flere begrensninger i denne metoden. Først, er levering av legemidler begrenset til ca 20-30 pl i en enkelt administrasjon, så oppløselighet av terapeutiske vil spille en rolle i å bestemme dosegrenser. Også, er medikamentformuleringen viktig som faktorer som pH og saltholdighet kan påvirke produksjonstid. Store avvik fra naturgitte forhold, som for eksempel ekstrem pH og saltholdighet, kan skade luftveiene og olfactory epitel av mus. 13,14 Videre kan intranasal dosering av unanesthetized mus være vanskelig å mestre, og kan ta flere uker med trening for intranasal "dosers "å være i stand til å minimize "head-slingringsmonn" og oppnå optimal intranasal dosering av narkotika. Med feil dosering teknikken, kan stoffet renne inn i lungene eller magen, noe som kan introdusere variasjon i medikament når hjernen. Tegn på at dette har funnet sted pustevansker eller visualisering av væske i munnen etter administrering. Hvis det er mulig, er det tilrådelig å begrense nye intranasal "dosers" til å levere saltvann / kjøretøy for å kontrollere grupper i flere uker eller måneder før de er godkjent til dose narkotika av ekspert trenere. Endelig er denne våken intranasal metoden begrenset til mus, som våken rotter og større dyr er ikke like lett gripes, og kan være altfor stresset når holdes opp-ned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke HealthPartners Institusjonell Animal Care og bruk komité på regioner Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
