Summary
Un método para administrar por vía intranasal a ratones despiertos medicamentos para el fin de dirigir el cerebro se describe. Este método permite la administración repetida durante largos períodos con la administración intranasal de drogas sin anestesia, y la nariz al cerebro de entrega con una exposición sistémica mínima.
Abstract
La administración intranasal es un método de suministro de agentes terapéuticos para el sistema nervioso central (SNC). Es no invasiva y permite que las moléculas grandes que no atraviesan el acceso barrera hematoencefálica en el SNC. Las drogas son dirigidas directamente al SNC con la administración intranasal, reducir la exposición sistémica y los efectos sistémicos secundarios no deseados así 1. Entrega de la nariz para el SNC se produce en cuestión de minutos a lo largo de tanto los caminos de los nervios olfativos y a través de una ruta trigémino extracelular y no requiere medicamentos para unirse a cualquier receptor o el transporte axonal 2. Administración intranasal es un método ampliamente difundido y se utiliza actualmente en ensayos clínicos humanos 3.
La administración intranasal de fármacos en modelos animales permite la evaluación inicial de distribución farmacocinética y la eficacia. Con los ratones, es posible administrar fármacos a animales despiertos (no anestesiado) sobre una base regular usando una especializado agarre intranasal. Entrega Awake es beneficioso porque permite que a largo plazo la administración crónica sin anestesia, se tarda menos tiempo que con la anestesia, y puede ser aprendido y hecho por muchas personas para que equipos de técnicos puedan números grandes dosis de ratones en períodos cortos. La eficacia de la terapéutica administrado por vía intranasal de esta manera a los ratones se ha demostrado en una serie de estudios que incluyen la insulina en modelos de ratones diabéticos 4-6 y deferoxamina en modelos de ratón de Alzheimer. 7,8
El agarre intranasal en ratones se pueden aprender, pero no es fácil y requiere práctica, habilidad y un agarre preciso para cumplir efectivamente con las drogas en el cerebro y evitar el drenaje de los pulmones y el estómago. Los ratones se restringen a mano usando un scruff modificada en la mano no dominante con el cuello mantiene paralela al suelo, mientras fármaco se suministra con una pipeta usando la mano dominante. Por lo general toma 3-4 semanas de aclimatación a la manipulación de los ratones antes dese hace con este agarre sin una respuesta de estrés. Hemos preparado este vídeo JoVE para hacer esta técnica de administración intranasal más accesible.
Protocol
1. Aclimatación de Manejo para la administración intranasal de ratones Awake
Introducción
Los ratones deben ser aclimatadas a la manipulación por un período de dos a cuatro semanas antes del inicio de la administración intranasal. Aclimatación a la manipulación es importante, ya que ayuda a asegurar una posición correcta del cuerpo para lograr la máxima eficacia de la entrega despierto fármaco intranasal. Además, los ratones que no han sido adecuadamente acostumbrados a este proceso puede tener una reacción de ansiedad grave después de la dosificación. Los ratones deben pasar cerca de 2-3 días en cada uno de nueve pasos antes de proceder al paso siguiente, dependiendo de la comodidad de los animales a la manipulación. El nivel de estrés de ratón debe ser utilizado como una medida del progreso. Esto significa controlar los movimientos del ratón, la cantidad / frecuencia de la micción, defecación, temblando, y morder. Si el ratón tiene una respuesta de estrés alto, permanezca en ese paso antes de pasar a la siguiente hasta que la respuesta se reduce. Una muestra de aclimatación schedule se puede ver en la Tabla 1. La aclimatación de los ratones deben progresar a través de los siguientes de una vez al día pasos. Realizar estos pasos más de una vez al día, en un intento de acelerar la aclimatación, no se recomienda.
- Coloque el ratón en la palma de la mano por un período de dos a tres minutos, no más de un pie por encima de la cima de la jaula, como animales frecuentemente saltar durante esta etapa introductoria. Si el ratón intenta arrastrarse fuera de la parte superior de su brazo, simplemente levante el ratón por la base de la cola y colocarlo de nuevo en la mano.
- Coloque el ratón en la palma de la mano durante tres minutos y acariciar al animal suavemente. Acepta el ratón direccionalmente desde la cabeza hasta la cola, mientras que permite que el animal se mueva libremente.
- Coloque el ratón en la palma de la mano durante tres minutos mientras que el masaje detrás de las orejas (ligeramente pellizcando juntos la piel en la parte posterior del cuello utilizando el pulgar y el dedo índice).
- Mantener / lift el ratón por la piel de su cuello durante 30 segundos, dejando que el resto del ratón en la cima de la jaula durante 30 segundos antes de repetir la bodega de nuevo.
- Mantenga el ratón usando el agarre intranasal, que se describe en la sección 2, pero no invertir el animal (completar hasta el paso 2.4). Sostenga el animal como este por un período de 30 segundos y suelte de nuevo a la cima de la jaula. Repetir una segunda vez después de un período de descanso de un minuto.
- Sujete el mouse con el agarre intranasal tal como se describe en la sección 2, que incluye la inversión del animal, por lo que su parte ventral es hacia arriba hacia el techo. Asegúrese de que el cuello del animal es paralelo al suelo. Mantenga esta posición durante 30 segundos. Repita este una segunda vez después de un período de descanso de un minuto. Algunos ratones se resistirá a la empuñadura intranasal más que otros, especialmente cuando se utiliza por primera vez con la inversión en esta etapa en la aclimatación. Si el ratón se libera del yugo, poner el ratón de nuevo en la cima de la jaula y volver a agarrar. Repita el re-grip si es necesario, Pero vigilar el nivel de estrés del ratón y devolverlo a la jaula si es necesario. Otro factor que puede desempeñar un papel en la pérdida de la adherencia en este punto en el proceso de aclimatación es la inexperiencia de los cuidadores de animales con la técnica de administración intranasal.
- Sujete el mouse con el agarre intranasal, invertir, brevemente colocar una pipeta con una punta vacía encima de cada ventana de la nariz y mantenga la posición de los animales durante 30 segundos. Repita este después de un período de descanso de un minuto.
- Sujete el mouse con el agarre intranasal, que invertir y administrar por vía intranasal 6 l de solución salina en el orificio nasal izquierdo y derecho como se describe en la sección 3 (a través de paso 3,7).
- Sujete el mouse con el agarre intranasal, invertir, y administrar por vía intranasal 6 l de solución salina en el orificio nasal izquierdo y derecho dos veces colocar al animal de nuevo en la cima de la jaula en el medio, como se describe en la sección 3.
2. El Grip intranasal para inmovilizar Ratones Awake
- Coloque el ratón on la jaula superior.
- Con el pulgar y el dedo índice de su mano dominante, sostenga el ratón por la cola. Uso de su corazón, anular y meñique, ligeramente pin de la parte inferior del cuerpo a la cima de la jaula (Figura 1A). Vamos a agarrar el ratón sobre las barras a medida que estirar ligeramente el ratón fuera y mejor agarrar la nuca.
- Con el pulgar y el dedo medio de su mano no dominante, apriete firmemente el ratón en la nuca (el exceso de piel) por detrás del cuello y los hombros. Tire hacia arriba de la piel suelta para hacer una tienda de piel a través de los hombros (fig. 1B). Tome tanta piel como sea posible, pero tenga cuidado de no tirar de músculo ya que esto causará molestias al ratón. Tenga cuidado para no aplicar demasiada presión a la caja torácica del animal o la columna vertebral. El exceso de presión o de tracción de la piel puede conducir a la inhibición de la respiración en algunos casos.
- Rápidamente coloque el dedo índice de la mano no dominante sobre la cabeza del ratón comocerca de la nariz como sea posible y tire hacia atrás la piel (Figura 1C, 1D). Al mismo tiempo, deslice el pulgar y el dedo medio hacia la cabeza de la posición óptima. Idealmente, el ratón no debería ser capaz de mover su cabeza vertical u horizontalmente.
- Mientras se mantiene el control sobre la nuca, gire el ratón sobre su espalda. La espalda del ratón debe estar en la palma de su mano. Sostenga firmemente la cola del ratón (cerca de la base) contra su palma con sus dos últimos dedos (anular y meñique) para estabilizar el ratón, o puede envolver sus dedos en la parte inferior del cuerpo (Figura 1E, 1F).
- En este punto, asegurarse de que el cuello del ratón y la barbilla son planos y paralelos al suelo. La barbilla debe estar cerca de un ángulo de 180 grados con el cuello tanto como sea posible para ayudar en la administración intranasal. Ligeros cambios en ángulo puede provocar que el medicamento terminan en el lugar equivocado. Asegúrese de que el ratón es capaz de respirar al ver el abdomen. El sho ratónuld no ser capaz de moverse, pero deben ser cómodos y no en ningún dolor. Si usted ve el cuello del ratón y la barbilla haciendo una "V", entonces usted necesita para volver a agarrar.
3. La administración intranasal de drogas a ratones Awake
Introducción
Utilizando la empuñadura intranasal, cada ratón se restringe dos veces y se mantuvo con su cuello paralelo al suelo, mientras que un volumen de 20-30 l de líquido se administra. Este volumen es segura y eficaz para los pequeños grandes ratones; usamos normalmente 24 l, y que se describe en este protocolo. El método intranasal despierto puede ser utilizado en ratones de cualquier edad, por ejemplo en ratones recién nacidos para la investigación en neurociencias de desarrollo. En los ratones recién nacidos, un menor volumen total (8 l) y tamaño de las gotas (1 l) se debe utilizar para acomodar el volumen más pequeño de la cavidad nasal. Drogas es típicamente de entregarse a dos ratones a la vez, alternando períodos de descanso para hacer el uso más eficiente del tiempo y mantener on horario. Set-up será un poco diferente en función de si va a dosificar ratones alojados en grupo o ratones alojados individualmente. Con los ratones alojados individualmente, es útil para colocar todo el material entre las jaulas para evitar que los ratones de cruzar a la cima de la jaula otro. Con el alojada en grupo los ratones, la dosis de la jaula sólo. Es importante que cada ratón en una jaula alojada en grupo recibe el tratamiento intranasal mismo, como potencial de contaminación cruzada de dos tratamientos diferentes existe debido a la expulsión de medicamento en el aire o con contacto con la piel. Se recomienda que una hoja de dosificación pueden imprimir con anticipación, para recordar a los técnicos de las asignaciones de tratamiento, para grabar las notas de las gotas perdidas, tener en cuenta la salud general de cada animal, etc
Pasos
- Configure las jaulas donde deben estar para la dosificación y configurar una estación de administración (Figura 2).
- Retire ratón de la jaula y mantenerse en la cima jaula durante la dosificación.
- Coge el ratón usando el agarre intranasal se describe en la sección 2.
- Con la mano dominante, cargar la pipeta con 6 l de fármaco o vehículo. Coloque la punta de la pipeta de llenado cerca de la fosa nasal izquierda del ratón, por lo general en un ángulo de 45 grados (Figura 1G, 1H). Si usted tiene una solución viscosa puede que tenga que aumentar el ángulo de 90 grados ya que el medicamento puede correr por el lado de la punta de la pipeta en vez de hacer una sola gota. Si es muy viscoso, limpiando la punta de la pipeta con un pañuelo antes de expulsar el líquido puede ayudar. Lentamente expulsar el fármaco para formar una pequeña gota con aproximadamente la mitad del volumen (3 l).
- La gotita debe ser colocado lo suficientemente cerca de la ventana de la nariz de ratón, de modo que el ratón se puede inhalar la gotita. Inmediatamente después el ratón inhala esta pequeña gota, expulsar el resto del fármaco en la punta de la pipeta para formar otra gotita pequeño para el ratón a inhalar a través de la fosa nasal mismo de 2-3 segundos más tarde. Asegúrese de ver la boca. Si hay is cualquier líquido en la boca, la gota no lo hacen completamente en la nariz y esto debe tenerse en cuenta.
- Mantenga el ratón en esta posición durante 15 segundos. Es altamente recomendable que un temporizador se utiliza para estandarizar esta espera 15 seg.
- Repita los pasos 3,3 a 3,6 por la fosa nasal derecha. Si las gotas son resopló fuera, que la caída debe ser reemplazado y señaló.
- Coloque el ratón de nuevo en la parte superior de su jaula durante 2 min. Repetir todo el proceso a partir del 2 min. después de la entrega de la primera gota. Esto le da al ratón cuatro gotas de 6 l cada uno un total de 24 l de solución. Un programa de muestreo para la dosificación de uno o dos ratones a la vez se puede ver en la Tabla 2.
- Después de que el ratón ha recibido todas las gotas, devuelva el ratón a su jaula.
4. Técnicas generales para el manejo de animales Aclimatación y la administración intranasal de drogas a los ratones Awake
Después de cada sesión de aclimatación o la administración intranasal, los ratones se deberá tomar enna tratar, tal como un Cheerio o semillas de girasol pelado como un refuerzo positivo. Treats se dan como una recompensa y para distraerlos de rascarse la nariz, que puede causar daño a sí mismos. Cuando se trabaja con los ratones alojados en grupo, golosinas suficientes deben ser dejados para cada ratón. Antes de devolver los animales a sus jaulas asegúrese de restaurar nidos a sus estados originales con el fin de reducir el estrés. Cuando la dosificación los animales alojados en grupo, los guantes deben ser cambiados entre la administración de las jaulas para no transferir olor de la colonia colonia jaula a jaula, ya que se vuelven agresivos uno hacia el otro.
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Representative Results
Hay varias formas de determinar la eficacia de la administración de fármacos. La primera es para administrar por vía intranasal un colorante, tal como tinta India o azul de metileno y de visualizar el colorante después de la eutanasia de los animales, en el epitelio olfativo y después se remueve el cerebro, entrando en el SNC a través de la lámina cribosa. El segundo es para medir el fármaco administrado ya sea mediante el uso de una etiqueta de radio-marcado o utilizando ELISA de detección de la molécula marcada. Un buen ejemplo de distribución de fármacos en el SNC después de la administración a los ratones despiertos pueden encontrar en Hanson et al. 2012 7. Esperamos que el bulbo olfativo y el nervio trigémino que contienen una alta concentración de la droga entregada. A los 30 minutos después de la administración intranasal de deferoxamina 3,65 mol, las concentraciones en el nervio trigémino y del nervio olfatorio era 29 micras y 13 mu M respectivamente. Las concentraciones de fármaco será evidente a través de todas las regiones del cerebro (en este ejemplo, un sonare de 0,6 mM a 4,1 mM se midió) con concentraciones más altas en las zonas beneficiarias de las aportaciones de los nervios olfatorio y trigémino. Por ejemplo, las regiones rostrales de la corteza se contienen concentraciones más altas que la corteza caudal y protuberancia se contienen concentraciones mayores que el mesencéfalo o médula. En la médula espinal de un gradiente de concentración descendiente de cervical a la columna lumbar se observa en general (en este ejemplo un gradiente de 1,5 M a 2,0 M). La administración intranasal también da como resultado altas concentraciones de fármaco que llega al meninges y los ganglios linfáticos cervicales. La tercera forma de demostrar la eficacia de la entrega es para medir una respuesta de comportamiento o bioquímica al fármaco administrado. Por ejemplo, el tratamiento de deferoxamina intranasal de ratones transgénicos de Alzheimer resultó en un rendimiento mejorado en una tarea de memoria espacial 7 y la fosforilación de la glucógeno sintasa quinasa 3 beta 9.
| Día | Acción | |
| 1 | M | Mantenga la posición durante 2-3 min ~ |
| 2 | Tu | Mantenga la posición durante 2-3 min ~ |
| 3 | W | Mantenga y mascota ~ 2-3 min |
| 4 | Th | Mantenga y mascota ~ 2-3 min |
| 5 | F | Ligeramente pellizco o scruff |
| 6 | M | Ligeramente pellizco o scruff |
| 7 | Tu | Scruff y ascensor |
| 8 | W | Scruff y ascensor |
| 9 | Th | Grip intranasal |
| 10 | F | Grip intranasal |
| 11 | M </ Td> | Intranasal (IN) Grip e Invertir |
| 12 | Tu | Intranasal (IN) Grip e Invertir |
| 13 | W | EN Grip, Invertir, coloque punta de la pipeta cerca de la nariz |
| 14 | Th | EN Grip, Invertir, coloque punta de la pipeta cerca de la nariz |
| 15 | F | EN Grip, Invertir, entregar una solución salina para cada ronda nare |
| 16 | M | EN Grip, Invertir, entregar una solución salina para cada ronda nare |
| 17 | Tu | EN Grip, Invertir, entregar dos rondas de solución salina en cada orificio nasal |
| 18 | W | EN Grip, Invertir, entregar dos rondas de solución salina en cada orificio nasal |
Tabla 1. Horario de muestra para Aclimatación de Manejo para la administración intranasal de ratones despiertos.
* La pipeta se carga una vez con 6 l, pero se administra al ratón como 2 x 3 gotas mu l.
Tabla 2. Ejemplo de línea de tiempo para la dosificación de uno o dos ratones.
Figura 1. Fotos de las diferentes etapas y los ángulos de la celebración de un ratón para la entrega despierto intranasal de drogas. 1A) Mantenga el ratón hacia abajo firmemente en la cima de la jaula con la mano dominante dejando los hombros expuestos a agarrar la piel. 1B) Utilice el pulgar y el dedo mediode la mano no dominante para agarrar y levantar la piel justo detrás de los omóplatos. 1C) Utilice el dedo índice para tirar de la piel de vuelta de entre los ojos hacia el pulgar y el dedo medio (vista de frente). 1D) Igual 1C (lado vista). 1E) Sujete el ratón boca abajo con el dedo anular y / o meñique para fijar la base de la cola a la palma de la mano. El cuello del ratón debe ser horizontal. 1F) Igual que E, de otro lado. 1G) Administrar fármaco con una pipeta de 20 l y la carga de gel punta de la pipeta. 1H) Igual 1G, vista de cerca.
Figura 2. Una foto de una estación de dosificación completa para 2 ratones alojados individualmente. Se incluyen las dos jaulas de ratón con la suficiente distancia entre los ratones para mantener separada, una pipetator con puntas, un recipiente para puntas usadas, un temporizador, hoja de dosificación, un tratamiento después de la dosificación (como semillas de girasol o Cheerios), toallitas sanitarias, un P20 (o P10) pipeta, y el fármaco a administrar.
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Discussion
Este método muestra cómo los ratones se pueden dar dosis regulares de medicamento intranasal para atacar el cerebro sin el uso de anestesia. Medicamento intranasal puede ser entregado a grandes grupos de ratones durante largos períodos de tiempo con el mínimo esfuerzo. Un único grupo de hasta 20 ratones por vía intranasal puede tratarse por una sola persona en menos de una hora. Una amplia gama de moléculas, que van desde los quelantes del hierro pequeños a factores de crecimiento a las células madre mesenquimales, se han demostrado para apuntar rápidamente el SNC y han demostrado eficacia en modelos de roedores. Los mecanismos propuestos de entrega directa desde la nariz hasta el cerebro incluyen el transporte extracelular a lo largo de los nervios olfatorio y trigémino y el flujo de masa dentro de los espacios perivasculares 1,10. Administración intranasal al SNC es una técnica especialmente útil porque no sólo es rápida, pero se dirige a los CNS reducir la exposición sistémica. Por ejemplo, la administración intranasal de la deferoxamina a ratas resultó en 3-19 veces mayor concentrations en regiones del cerebro con 28 veces las concentraciones más bajas en la sangre 11. En otro ejemplo, la insulina administrada por vía intranasal mejora la memoria en pacientes con Alzheimer en los 15 minutos sin cambiar los niveles plasmáticos de insulina o de glucosa 12. Una ventaja adicional es la no invasividad de la técnica de administración intranasal.
Existen varias limitaciones a este método. En primer lugar, la administración de fármacos está limitada a aproximadamente 20-30 l en una sola administración, por lo que la solubilidad del producto terapéutico tendrá un papel en la determinación de los límites de dosis. Además, la formulación del fármaco es importante como factores como el pH y la salinidad puede afectar a la entrega. Las grandes desviaciones de las condiciones naturales, tales como el pH y la salinidad extrema, pueden dañar el epitelio respiratorio y olfativo de los ratones. 13,14 Además, la administración intranasal de ratones no anestesiados puede ser difícil de dominar, y puede tomar varias semanas de entrenamiento para intranasales "dosificadores "para poder Minimize "cabeza-meneo habitación" y alcanzar la dosis óptima intranasal de drogas. Con la técnica de dosificación incorrecta, el fármaco puede drenar en el pulmón o en el estómago, lo que puede introducir variabilidad en fármaco que llega al cerebro. Las señales de que esto ha ocurrido de dificultades respiratorias o visualización de líquido en la boca después de la administración. Si es posible, es aconsejable limitar nuevas intranasales "dosificadores" a la entrega de solución salina / vehículo con grupos de control durante varias semanas o meses antes de su aprobación a la dosis de fármacos por instructores expertos. Finalmente, este método intranasal despierto se limita a los ratones, como ratas despiertas y animales más grandes no son tan fácilmente agarrado, y puede ser demasiado estresado cuando lo ponga boca abajo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la atención HealthPartners Animales institucional y el empleo Comisión en el Hospital Regions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
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