Summary
Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.
Abstract
Glia etkileşim Uygun nöron merkezi sinir sistemi (MSS) fizyolojik fonksiyonu için önemlidir. Bu çift yönlü iletişim sophisticatedly nöron ve glia 1,2 arasında belirli sinyal yolakları aracılık etmektedir. Bu sinyal yollarının tanımlanması ve karakterizasyonu glia etkileşim şekilleri MSS fizyolojisi nasıl nöronun anlayışı esastır. Önceleri, nöron ve glia karışık kültürlerin yaygın nöron ve glia arasındaki sinyal yolları test ve karakterizasyonu için kullanılmıştır. In vivo araçları bu müstahzarlar ve diğer öğrendim Ne Ancak, nöron ve glia arasında karşılıklı sinyalleşme sıklıkla nöronlar (yani, akson, dendrit veya soma) 3 içinde belirli bölümlerinde meydana geldiğini öne sürdü. Bu önemli nöronal bölmeleri ayrılması olanak sağlayan yeni bir kültür sistemi geliştirmek için yapar ve özellikle glia ve nöro arasındaki etkileşimi inceliyornal akson / dendrit. Buna ek olarak, geleneksel bir karışık kültür sisteminde çözünür faktörler ve nöron ve glia arasında doğrudan bir kontak sinyali ayırıcı zar yeteneğine sahip değildir. Ayrıca, geleneksel ko-kültür sisteminde nöronların ve glial hücreler ve büyük miktarda, tek bir akson ve bir glial hücre arasındaki etkileşimi gözlemlemek için gerekli çözünürlüğü yoksundur.
Bu çalışmada, bir mikroakışkan kültür platformu (MCP) kullanılması ile bir yeni akson ve glia ko-kültür sistemi açıklanmaktadır. Bu ko-kültür sisteminde, nöronlar ve glial hücreler birden santral kanallar aracılığıyla bağlanan iki ayrı odalarında kültüre. Bu mikroakışkan kültür platformu, sadece nöronal süreçleri (özellikle aksonlar) merkezi kanallardan glial tarafında girebilirsiniz. Güçlü floresan protein etiketleme ile birlikte, bu sistem, böyle bir akson / dendrit ve glial etkileşimler arasındaki sinyal yolakları, direkt bakı sağlarnöronal terminalleri glia, glia-aracılı reseptör ticareti, ve glia-aracılı akson büyüme ler akson-aracılı transkripsiyonel düzenleme. Odasının çapı önemli derecede dar akson / dendrit ve glial yüzeyler arasındaki doğrudan zar protein etkileşimi kolaylaştırmak sondalama, glial odasına nöron-zenginleştirilmiş orta akışını engeller.
Protocol
1. Mikroakışkan Kültür Odası Meclisi (MCP)
- MCP (Şekil 1) hücreleri, 4 farklı bölmeli kültür için tasarlanan açık odaları vardır. Tipik olarak, merkezi kanal (çapı 3 um) ile bağlanmış iki bölmeden oluşmaktadır. Cam tabanlı yemekleri ile MCP Meclisi kültür ve sonraki görüntü analiz hazırlamak için gereklidir.
- İlk olarak, Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kat steril cam tabanlı bir bulaşık sodyum tetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8.5) içinde çözüldü ve 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edildi
- Ertesi gün, kaplanmış cam tabanlı bir bulaşık GKD 2 O ile üç kez yıkandı ve steril davlumbaz altında kurutulmuştur. Cam tabanlı tabaklar daha sonra daha fazla laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanır, 1 saat için UV ışık altında kurutulmuştur. Kaplanmış bulaşık kullanıma hazır veya kullanıma dek -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu kaplamaco-kültür kaplama nöronların ve astrositler için gerekli yeniden.
- Kültür platformu montajı için, mikroakışkan kültür platformları sıkı bir mühür oluşturmak için onun alt tarafında merkezi bağlayan kanalları ile kaplı cam zeminli yemeklerin üstüne yerleştirildi. Normal nöron veya astrosit kültür ortamlarda monte MCP her iki tarafı da (Şekil 1) (hücre kaplama alanlarından) eklendi ve 37 ° C'de 2-4 saat inkübe, MCP ve cam arasında hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için yapıldı dipli çanak. Biz hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak için kaplama hücreleri önce orta ile test ettik. Cam dipli çanak MCP montajı taze kullanılmadan önce hazırlanmalıdır.
2. Montajlı MCP nöronal Aksonlar nöronal Kültür ve İndüksiyon hazırlanması
- Kortikal nöronal hücre kültürleri taze embriyonik 14-16 günlük eski fare beyninden hazırlanmıştır. Nöron kültür ortamı neurobasal ortamı,% 2 B27 neurobasa oluşmaktadırl takviyesi, 100x GlutaMAX% 1 ve% 1 penisilin-streptomysin ekleyerek glutamin 2 mM. Fare beyin disseksiyon takiben, zarları mikroskop altında korteks çıkarıldı. Doku daha sonra tripsin ile maruz kalan yüzey alanını arttırmak için küçük doku blokları için bir jilet ile kıyılmış edildi. Doku blokları 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için (Sigma-Aldrich,% 0.05 tripsin) tripsinize ve bir ateş cilalı Pastör pipeti ile tritürasyon ile ayrılmış ve sonra yavaşça edildi. Disosiye berrak nöronal hücrelerin hücre süspansiyonu toplamak için bir 70 mikron filtre içinden filtre edildi.
- Nöronların hücre tutma alanı (Şekil 1) bağlamak ve böylece nöronların (2-3 x 10 6 / ml, 150 ul) toplandı MCP sağ tarafında (Şekil 1) hücre kaplama alanı üzerine ekildi. Taze hazırlanmış nöronlar düzenlemeler içine% 5 fetal sığır serumu (Hyclone) ile desteklenmiş nöron orta kaplama ile kaplanmıştırr nöron kültür ortamı. Hücre tutma alanında takmak sadece nöronlar merkezi kanaldan monte MCP diğer tarafına aksonlar büyümesi için gerekli olduğundan, yeterli nöron bağlı olan sağlamak için hücre kaplama alanında nöron plaka yüksek yoğunluk önemlidir hücre saklama alanı. Nöronal aksonların yüksek yoğunluklu bir temsilcisi, görüntü Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Ertesi gün, nöron kaplama orta düzenli nöron kültür ortamı ile değiştirildi. Değişen ortam dikkatlice odasının hücre kaplama alanından orta aspirasyon ile gerçekleştirilir, ancak monte MCP hücre tutma alanı, hücre tutma alanı ve merkezi bağlantı kanalı içinde hava kabarcıkları önlemek için. Edildi Hava kabarcıkları ciddi MCP merkez kanal içine akson akıbet ve izleyen girdi inhibe olacaktır. Glial-hücresi kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF, 10-20 ng / ml), aynı zamanda, diğer (sol) tarafında eklendimonte MCP (Şekil 2A) merkez kanalları aracılığıyla nöronal yan ve çapraz akson akıbet 5 indüksiyonu kolaylaştırmak için aynı gün odasından. GDNF olmadan spontan akson uzantısı rayiç miktarı da monte MCP merkezi kanallardan nöronal yan ve çapraz görülmektedir. Merkez kanal içine girmek Aksonlar genellikle 2-3 gün sonra kaplama görülür. Aksonlar merkez kanal içine girdikten sonra, genellikle bir gün içinde diğer tarafı girin. Aksonlar diğer yan girdikten sonra, en az bir hafta süreyle normal olarak sağlamdır.
3. Bir Bölümlere Co-kültür Sistemi Kurmak MCP için Kültürlü astrositlerin eklenmesi
Primer astrosit kültürleri, P1-3 pup fare beyninden hazırlandı. Beyin ayrışma işlem yukarıda tarif edilen nöronal hücre izolasyon prosedürü ile aynıdır. Astrositler ilk ön edildi 10 cm çanak içine ekildiPolyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ile kaplanmıştır. Astrosit besiyeri (DMEM,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomysin) enkaz kaldırmak için önümüzdeki iki gün boyunca her gün değiştirildi. Bundan sonra, ortam her üç günde bir değiştirildi.
- Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler tripsinize edildi ve akson yaklaşık girmek için olan ya da sadece sol tarafında içine girdikten sonra yeniden askıya alınmış astrositler (1x10 6 / ml) 150 ul monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi MCP toplandı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (d floresan ile belirlenirDaha önce 4,6 gösterildiği gibi evet), MCP bulundu.
- Astrositler 90% konfluent haline ve 7 gün sonra bir tek tabaka oluştururlar. Konfluent astrositler aksonlar yaklaşık girmek için veya sadece sol içine girmiş olduğu zaman monte MCP sol tarafında hücre kaplama alanı içine yeniden ekildi tripsinize ve yeniden asılı astrositler (1 x 10 6 / ml) 150 ul edildi monte MCP tarafı. Nöronlar kaplama vardı sonra astrositler genellikle 4-5 gün ekildi. GDNF birinci MCP sol tarafına astrositlerin yeniden kaplama önce çıkarıldı. Yeniden kaplama astrositler gibi immun GFAP (Şekil 1) gösterildiği gibi, hücre tutma bölgesinde bağlanmıştır. Daha önce gösterildiği gibi, 4,6 odacıkların her iki tarafı arasında orta sadece asgari akım (floresan boyalar ile belirlenen), MCP bulunmuştur.
- Astrositlerin yeniden kaplama sonra, bir araya MCP sol tarafında girilen aksonların doğrudan doğruya astr ile etkileşimeDoğrudan aksonal temas veya çözünebilir faktörlerin salınımını biri tarafından ocytes. Astroglial plazma membranı glutamat taşıyıcı GLT1 ve nöronal βIII-tubulin immün Şekil 2D-F gösterildiği gibi, aksonların ve astrositler arasındaki etkileşimi görselleştirmek için yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrositlerde akson indüklenen GLT1 organizatörü aktivasyon Time-lapse görüntüleme analizi
Bölmeli nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece nöronal süreçleri, özellikle aksonlar, seçici astrositler ile etkileşim sağlar. Monte MCP içinde akson ve astrosit (veya diğer glial hücreler) ko-kültür başarılı kurulmasını takiben, akson-glia etkileşimleri farklı tür olarak ele alınabilir; Astroglial gen promoter aktivasyonu, astrosit indüklenen akson rehberlik akson indüklenen aktivasyonu , akson indüklenen Astroglial Ca 2 oligodendrosit in + tepkisi ve akson indüklenen miyelin sentezi. Bu uygulamaların tüm glial hücreleri veya bu hücrelerin yüklenir boyalar kullanılabilir güçlü floresan gazetecilere durumu yararlanmak.
Burada bakteriyel yapay kromozom kullanılarak Astroglial glutamat taşıyıcısı 1 (GLT1) promotör akson indüklenen transkripsiyonel aktivasyon tarifBazı (BAC) GLT1 eGFP transgenik fareler ve bu bölümlere ko-kültür sistemi. BAC GLT1 eGFP transgenik fareler, bir flüoresan raportör eGFP GLT1 genomik promotör 7 kontrolü altında eksprese edildi. EGFP muhabirin ifadesi dolayısıyla yerinde tek Astrositlerde GLT1 organizatörü aktiviteyi değerlendirmek izin endojen GLT1 organizatörü aktivasyon protein ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite 7 ile ilişkilidir. Astroglial GLT1 ifade nöronal stimülasyon 6,8 üzerine son derece bağlıdır. Primer astrosit GLT1 minimum seviyeleri ifade etmedi, ancak, GLT1 ifade seviyeleri (mRNA ve proteinin her ikisi de) kuvvetle nöronlar 9 ile eş-kültür analizi astrositlerde indüklenir. Kanıtlar bölümlere ko-kültür sisteminde önemli ölçüde artmıştır GLT1 immünreaktivitesi (Şekil 3) burada gösterilir. Konvansiyonel nöron ve co-kültürler astrosit, nöron yüksek yoğunluklu gözlemlemek için daha az ideal haleGLT1 organizatörü transkripsiyonel aktivasyonu nöronal akson etkisi.
Vahşi tip nöronların monte MCP ve akson sağ tarafında ekildi akson bağımlı GLT1 organizatörü aktivasyonu, monte MCP sol tarafında GDNF uygulaması sonrasında oluşturuldu. Izlemek için Aksonlar monte MCP sol tarafında indüklenen ve sadece girildikten sonra BAC GLT1 eGFP farelerde elde astrositler monte MCP sol tarafında ekildi. 6 gün toplam (24 saat ila 140 saat) time-lapse görüntüler gerçek zamanlı olarak eGFP floresans şiddetindeki değişim ve MCP içinde akson büyüme izlemek için toplanmıştır. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, astrositler içinde çok az eGFP floresan ifade astrositlerin kaplama ardından 24 saat gözlendi. Aksonlar iyi astrosit yan ve etkileşim içine olduğunda eGFP yoğunluğunun belirgin artış (24 saat ila 68 saat kadar) ko-kültür alındıktan sonra 48 saat gözlendit doğrudan astrositler (Şekil 4 BC) ile temas. Aksonlar suni gübre (200 uM) monte MCP (Şekil 4D-F) nöronal (sağ) tarafında uyarılan nöronal hücre ölümü ile geri çekilir ve bir kere dejenere edildi Diğer taraftan, eGFP floresans şiddeti giderek azalmaktadır. Aksonlar yanıt eGFP floresans şiddetinin dinamik değişim açıkça Astroglial GLT1 promotör aktivitesi akson etkileşimlerinin modülasyonu olduğunu göstermiştir.
Şekil 1. Mikroakışkan nöron ve astrosit ko-kültür platformu şematik diyagramı. Mikroakışkan kültür platformu (MCP) santral kanallar aracılığıyla bağlanan iki bölmeden oluşmaktadır. Hücreler her bir yan üzerinde hücre kaplama alanından kaplama yapılabilir ve nöronal aksonlar ent için merkezi kanaldan hücre tutma alanı ve geçişte indüklenirer diğer tarafta (ölçek çubuğu 50 mikron ekleyin).
Şekil 2. Nöronal akson ve MCP MCP içinde astrosit ile akson etkileşim Endüksiyon. Monte MCP hücre saklama alanında nöron (A) Yüksek yoğunluklu, βIII-tübülin immün tarafından saptandı. Ölçek çubuğu: merkez kanal ve MCP diğer tarafında giren kapısı aksonların Büyütülmüş 50 mikron (B). Ölçek çubuğu: akson MCP diğer tarafında içine girerken BIII-tübülin boyama ile ortaya 100 mikron (C) Akson büyüme konisinin. Ölçek çubuğu: 100 mikron (D) merkez kanalıyla büyümeye ve MCP diğer tarafına girmek Akson demetleri. (E) astrositlerin MCP glial tarafında GLT1 immun tarafından saptandı. (F) Birleştirilmiş görüntü akson ve GLT1 pozitif astrosit arasında temas görüntüler. Ölçek çubuğu: 50 mikron.
Şekil 3,. Birincil Astrositlerde GLT1 ifade Nöron bağımlı indüksiyonu GLT1 immünreaktivitesi (A) primer astrosit kültürleri, Ölçek çubuğu:. 50 mikron (B) primer nöronal kültürlerin ve (C) primer nöron ve astrosit co-kültürler. Ölçek çubuğu: Nöronlar βIII-tubulin immünboyama gösterilir. GLT1 immünoreaktivitede belirgin artış nöron ve co-kültürler astrosit gözlendi.
Şekil 4. BAC GLT1 eGFP astrositler ve vahşi tip nöron MCP akson indüklenen GLT1 organizatörü aktivasyon Time-lapse görüntüler. EGFP yoğunluğu ve akson büyüme dinamik değişiklikler astrosit kaplama sonrasında 6d time-lapse kayıt yoluyla toplanmıştır. (A) 24 saat (B) 48h (C) 68h (D) 92H (E) 112H (F) 140H. Bir girişiastrosit tarafına Xons (sarı oklarla işaretli) 48h gelen artan eGFP floresans şiddeti ile korele 92H gözlendi. Kainite (200 uM) nöronal hücre ölümü ve akson dejenerasyonuna ikna etmek 92H de nöronal tarafında uygulandıktan sonra 112H gelen 140H oluştu eGFP floresans yoğunluğu azaltın. Ölçek çubuğu: 50 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP tabanlı nöron ve astrosit ko-kültür sistemi sadece aksonlar merkez kanalları geçmesine izin ve Astroglial hücreleri ile etkileşerek astroglial sinyal yolları ayrıntılı nöronun diseksiyon sağlar. Bu ko-kültür sistemi rahatlıkla konvansiyonel nöron ve astrosit kültürü prosedürleri ile kurulabilir. Biz de Astrositlerde akson bağımlı GLT1 organizatörü aktivasyonu gösteren bir eGFP tabanlı muhabiri istihdam ederek bu ko-kültür sistemi pratik bir uygulama nitelendirdi.
Bir de 1) yüksek çözünürlüklü mikroskopi 2 altında gerçek zamanlı olarak tek akson ve astrosit arasında açık morfolojik etkileşimi görselleştirmek ve tanımlamak için yeteneği): Bu MCP tabanlı nöron ve astroglial ko-kültür sistemi konvansiyonel ko-kültür yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sunmaktadır promotor aktivasyonu hücre-spesifik etkisi 3 Farmakolojik manipulasyon uygulamak için kontrollü bağımsız mikroçevrede) analizive protein ekspresyonu sadece indüklenen / aksonları temas ile modüle Astrositlerde up-regüle. Primer oligodendrosit mikroglia 10 ve 11 için kültür prosedürler iyi kurulmuş edilmiş olarak, bu MCP eş-kültür sistemine da ko-kültürler oligodendrosit göre mikroglia ve nöron için nöron için uygulanabilir. Bu arada, biz de bu ko-kültür sistemi, RNA veya protein analizi gibi hücreler, büyük miktarda analiz geleneksel yaklaşımları tamamlayıcı bir tek hücre düzeyinde hassas görüntü analizi için amaçlanan tanımıyor. Ayrıca, sistem tek hücre ve akson arasındaki örneklendirilmesi etkileşim nöronlar ve in vivo glial hücreler arasındaki muazzam etkileşimi kolaylaştırır. Bu eş-kültür sistemine gelen sonuçlar yorumlanırken Bütün bunlar dikkate alınmalıdır. MSS, akson ve farklı glial hücreler arasındaki etkileşimi yaygın olarak mevcut olan ve nöron ikisi için önem taşımaktadır veglial fonksiyonları 12,13. Bu ko-kültür sisteminin geliştirilmesi bu etkileşimlerin görüntüleme tabanlı diseksiyonu sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz BAC GLT1 eGFP fareler ve GLT1 antikor sağlamak için Dr Jeffrey Rothstein teşekkür etmek istiyorum; değerli çekirdek imkanları sağlamak için; Sinirbilim Araştırmaları Tufts Merkezi (PI, Rob Jackson NIH P30 NS047243); Yeni öğretim üye hibesi (NIH P30 5P30NS069254-02 ; Tufts Sinirbilim Anabilim PI, Phil Haydon).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
| Neuron culture medium for plating cell
|
|||
| Astrocyte culture medium
|
|||
| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
|||
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S.
