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Neuroscience

इमेजिंग प्राथमिक संवर्धित माउस न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर निवेशन pHluorin टैग

Published: November 20, 2012 doi: 10.3791/4450
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

टैगिंग द्वारा superecliptic pHluorin साथ झिल्ली रिसेप्टर्स की कोशिकी डोमेन, और सभ्य माउस न्यूरॉन्स में इमेजिंग द्वारा इन संलयन रिसेप्टर्स, हम सीधे व्यक्ति vesicular प्रविष्टि घटनाओं प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स की कल्पना कर सकते हैं. इस तकनीक के elucidating आणविक प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर प्रविष्टि संचालन तंत्र में सहायक होगा.

Protocol

1. Neuronal संस्कृति कंडीशनिंग के लिए माउस Glia संस्कृति की तैयारी

  1. T75 बोतल कोलेजन समाधान (DDH 2 हे में 01:03) Purecol के कमजोर पड़ने के साथ लेपित हैं. बोतल सीधे सेट कर रहे हैं और एक टिशू कल्चर हुड में रातोंरात सूखी छोड़ दिया.
  2. विच्छेदन (: aCSF 119 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 30 मिमी dextrose, 25 मिमी HEPES, पीएच 7.4 कैल्शियम के बिना) बफर और glia मीडिया (DMEM 10% FBS, 10 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 10 के साथ पूरक / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, और Glutamax) तैयार कर रहे हैं और 4 में संग्रहीत ° C उपयोग के लिए तक तैयार है.
  3. Glia संस्कृति के दिन, glia मीडिया माउस दिमाग के विच्छेदन से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कम से कम 30 मिनट के लिए गर्म है. भ्रूण या नवजात चूहों तेजी कत्ल द्वारा euthanized हैं. सेरेब्रल cortexes बाहर एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे dissected हैं.
  4. Dissected मस्तिष्क के ऊतकों papain समाधान (100 मिलीलीटर papain और 20 μl 2 मिलीलीटर विच्छेदन बफर में 1% DNase मैं) में 37 में पच जाता है डिग्री सेल्सियस के लिएr 20 मिनट.
  5. Papain पाचन के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों को 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म glia मीडिया के साथ rinsed कर रहे हैं. ताजा glia मीडिया (2 मिलीलीटर) तो पचा मस्तिष्क के ऊतकों को जोड़ा है, और ऊतकों एक आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक के साथ triturated हैं.
  6. ताजा glia मीडिया (8 मिलीग्राम) dissociated ऊतकों को जोड़ा है. एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी dissociated ऊतक निलंबन फिल्टर किया जाता है. कोशिकाओं तो T75 बोतल (आमतौर पर 2-3 भ्रूण बीज एक T75 फ्लास्क) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और एक 37 ° C सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखा गया है.
  7. अगले दिन, T75 बोतल से मीडिया aspirated है. बोतल 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ rinsed हैं. ताजा glia मीडिया (10-15 मिलीग्राम) तो प्रत्येक कुप्पी में जोड़ा जाता है.
  8. 10-12 दिनों के भीतर, T75 बोतल में glia मिला हुआ होना चाहिए. Glial कोशिकाओं पीबीएस के साथ rinsed कर रहे हैं, और 0.05% trypsin के 5 मिलीलीटर प्रत्येक T75 फ्लास्क को जोड़ा जाता है.
  9. ट्रिप्सिन ऊष्मायन के बाद 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, glial कोशिकाओं प्रत्येक T75 फ्लास्क से अलग और glial कोशिकाओं को दो भागों में विभाजित कर रहे हैंअलग कोलेजन लेपित T75 बोतल.
  10. संस्कृति आवेषण (PICM03050 Millipore) उन्हें 6 अच्छी तरह प्लेटें, कोलेजन के साथ उन्हें कोटिंग, और रात में हवा सुखाने में रखकर तैयार कर रहे हैं. Glia मीडिया (2 मिलीलीटर प्रत्येक) प्रत्येक संस्कृति डालने के नीचे रखा गया है.
  11. संगामी T75 बोतल से Glia trypsinized और संस्कृति आवेषण पर वरीयता प्राप्त (6 अच्छी तरह से थाली प्रति एक T75 फ्लास्क, 2 मिलीलीटर प्रत्येक डालने). इन glia संस्कृति आवेषण neuronal संस्कृतियों हालत के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

2. Neuronal संस्कृति

  1. neuronal संस्कृति के लिए कांच coverslips 70% में कम से कम 3 रातोंरात HNO भिगोने से साफ कर रहे हैं. DDH 2 हे कम से कम 3 बार के साथ Coverslips तो धो रहे हैं, और एक Isotemp ओवन में सूख (> 200 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात.
  2. साफ coverslips 6 अच्छी तरह से एक थाली, एक अच्छी तरह से प्रति coverslip में रखा जाता है. पाली - एल Lysine (2 मिलीग्राम, 100 मिमी बोरिक एसिड में 0.1%, 8.5 पीएच =) एक ° इनक्यूबेटर सी 37 में रातोंरात समाधान के साथ Coverslips लेपित हैं.
  3. पाली एल Lysine समाधान coverslips से निकाल दिया जाता है और coverslips autoclaved DDH 2 ओ के साथ 3 बार धोया जाता है तो Coverslips एक 37 में incubated डिग्री सेल्सियस चढ़ाना मीडिया में रातोंरात (5% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 10 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 10 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, Glutamax साथ पूरक Neurobasal इनक्यूबेटर, 2% B27 पूरक चढ़ाना मध्यम करने के लिए जोड़ा है दिन पर यह प्रयोग किया जाता है).
  4. अगले दिन, चढ़ाना मीडिया हटा दिया है और B-27 के साथ ताजा चढ़ाना मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से है कि एक गिलास coverslip जोड़ा जाता है.
  5. सीओ 2 के साथ गर्भवती चूहों (E15-18) euthanized हैं, और भ्रूण चूहों शिरच्छेद द्वारा euthanized हैं. हिप्पोकैम्पस या स्ट्रिएटम मस्तिष्क के ऊतकों से dissected है और बर्फ ठंड hippocampal न्यूरॉन्स या striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की संस्कृति के लिए विच्छेदन बफर, क्रमशः के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखा.
  6. Dissected मस्तिष्क के ऊतकों papain साथ अलग कर रहे हैं, के रूप में 1.4 कदम) और 1.5) में वर्णित है.
  7. एफहदबंदी ollowing, प्रत्येक neuronal निलंबन में कोशिकाओं के संख्या एक hemocytometer के साथ गिना जाता है. न्यूरॉन्स तो 0.4 x 10 6 कोशिकाओं के एक एक 6-अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह घनत्व प्रत्येक coverslip पर वरीयता दी गई, और एक रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संवर्धित (न्यूरॉन्स DIV 0) कर रहे हैं.
  8. Glia संस्कृति आवेषण neuronal संस्कृतियों कंडीशनिंग के लिए तैयार करते हैं, glia मीडिया glia संस्कृति आवेषण से निकाल दिया जाता है और ताजा चढ़ाना मध्यम जोड़ा जाता है (और डालने के नीचे डालने और 2 मिलीलीटर में 2 मिलीलीटर).
  9. अगले दिन (1 DIV), न्यूरॉन्स के साथ coverslips glia संस्कृति आवेषण, प्रत्येक कुएं में एक coverslip के नीचे रखा जाता है.
  10. न्यूरॉन्स ताजा पूर्व गर्म खिला मीडिया (B-27 के साथ) हर 3-4 दिनों की आधी मात्रा के साथ खिलाया जाता है, जब तक वे अभिकर्मक और इमेजिंग प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं.

3. अभिकर्मक

  1. Neuronal अभिकर्मक Lipofectamine 2000 का उपयोग किया जाता है. प्रत्येक neuronal संस्कृति के लिए (coverslip प्रति एक संस्कृति), 2 μlLipofectamine 2000 और डीएनए की 1 ग्राम का उपयोग किया जाता है. कोई पूरक के साथ ताजा Neurobasal मध्यम लिए Lipofectamine और डीएनए जलमिश्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. डीएनए और Lipofectamine कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण के बाद incubated हैं.
  3. प्रत्येक डालने के अंदर से मीडिया के प्रत्येक glia संस्कृति डालने के नीचे से 1 मिलीग्राम और 1 मिलीग्राम सहेजें, और एक शंक्वाकार ट्यूब के लिए मीडिया स्थानांतरण. बचाया मध्यम और 37 पर सेते ° सी. खिला मीडिया का एक ही मात्रा + B27 जोड़ें इस माध्यम neuronal संस्कृति के लिए अभिकर्मक के बाद किया जाता है.
  4. 20 मिनट ऊष्मायन / Lipofectamine डीएनए के बाद, glia संस्कृति आवेषण क्षण भर के छह अच्छी तरह प्लेटें से हटा रहे हैं. 200 μl मिश्रण / Lipofectamine डीएनए न्यूरॉन्स के साथ प्रत्येक coverslip जोड़ा जाता है. glia संस्कृति आवेषण तो एक अच्छी तरह से करने के लिए लौट रहे हैं, न्यूरॉन्स ऊपर. संस्कृति आवेषण की झिल्ली के तहत बुलबुले के सृजन से बचा जाना चाहिए. न्यूरॉन्स मिश्रण / Lipofectamine डीएनए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में 2-4 घंटे के लिए incubated रहे हैं.
  5. वीं के बादई 2-4 घंटा ऊष्मायन अवधि, glia आवेषण फिर से हटा रहे हैं. मिश्रण / Lipofectamine डीएनए के साथ संस्कृति मीडिया प्रत्येक अच्छी तरह से हटा दिया जाता है. 3.3 कदम) में बचाया मीडिया न्यूरॉन्स (2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) करने के लिए जोड़ा है. Glia संस्कृति आवेषण एक अच्छी तरह से वापस आ रहे हैं, और प्रत्येक डालने से glia मीडिया निकाल दिया जाता है, और 3.3 कदम) से मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक डालने में जोड़ा जाता है.
  6. न्यूरॉन्स TIRF इमेजिंग पहले ट्रांसफ़ेक्ट सीडीएनए की अभिव्यक्ति इन न्यूरॉन्स पर किया जाता है की अनुमति के लिए एक अतिरिक्त 24-72 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं.

4. TIRF इमेजिंग

  1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF: 119 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 30 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी CACL 2, 1 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी HEPES, पीएच = 7.4) रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. हमारे TIRF इमेजिंग प्रणाली उत्तेजना के लिए एक 100 मेगावाट सियान लेजर के साथ कस्टम सेट अप है, और एक इलेक्ट्रॉन को गुणा प्रभार एक डिटेक्टर के लिए डिवाइस कैमरा (EMCCD) युग्मित.
  2. इमेजिंग प्रयोगों से पहले aCSF एक 37 और घ में चेतावनी दी हैसी कम से कम 30 मिनट के लिए पानी का स्नान, उदा. रहते इमेजिंग के लिए हीटिंग डालने खुर्दबीन मंच पर रखा गया है, और हीटिंग डालने, लेजर, कैमरा और इमेजिंग प्रयोगों के शुरू होने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए गरम कर रहे हैं.
  3. ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के साथ एक coverslip रहते इमेजिंग कक्ष में इकट्ठा किया है. aCSF पूर्व गर्म कक्ष में रखा है चैम्बर के बाद इकट्ठा किया जाता है, इस कदम के रूप में संभव के रूप में तेजी से पूरा किया जाना चाहिए.
  4. एक बार चैम्बर खुर्दबीन मंच पर हीटिंग डालने पर रखा गया है, ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स महामारी फ्लोरोसेंट इमेजिंग मोड के तहत नेत्रहीन की पहचान कर रहे हैं.
  5. बाद स्वस्थ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स (आंकड़े 1 और 2 के लिए देखें) की पहचान कर रहे हैं, हम आम तौर पर तस्वीर ब्लीच के 1 मिनट प्रदर्शन प्लाज्मा झिल्ली पर पूर्व मौजूदा pHluorin प्रतिदीप्ति खत्म करने, के रूप में प्लाज्मा झिल्ली पर pHluorin रिसेप्टर्स बहुत उच्च प्रतिदीप्ति जब स्तर TIRF इमेजिंग पहली बार शुरू किया जा रहा है, जो व्यक्ति भारतीय नौसेना पोत के दृश्य के साथ हस्तक्षेपertion घटनाओं.
  6. बाद photobleach EMCCD कैमरे पर इलेक्ट्रॉन गुणक का लाभ सेटिंग को अधिकतम करने के लिए सेट कर दिया जाता है, और रिकॉर्डिंग 10 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए किया जाता है.
  7. प्रत्येक रिकॉर्डिंग 600 चित्र शामिल होंगे. व्यक्तिगत प्रविष्टि घटनाओं रिकॉर्डिंग ImageJ का उपयोग कर वापस खेल के द्वारा की पहचान कर रहे हैं. व्यक्तिगत प्रविष्टि घटनाओं मैन्युअल ImageJ का विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

अनुरूप neuronal संस्कृति सफल रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण चित्रा 1 है. पता चलता है कि माउस hippocampal न्यूरॉन्स DIV 11 से हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए 18 div सुसंस्कृत. यह स्पष्ट है कि न्यूरॉन्स व्यापक प्रक्रियाओं को विकसित किया है और कहा कि छवियों से वृक्ष के समान प्रक्रियाओं घनी वृक्ष के समान spines, संकेत मिले हैं कि इन न्यूरॉन्स संस्कृति में स्वस्थ हैं के साथ आते हैं. हमारी संस्कृति प्रोटोकॉल भी दिमाग में न्यूरॉन्स की अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम हाल ही में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया संस्कृति कोstriatal एक अध्ययन में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स सभ्य माउस striatal मध्यम काँटेदार 9 न्यूरॉन्स में डोपामाइन D2 रिसेप्टर (DRD2) प्रविष्टि की जांच चित्रा 2 से पता चलता है कि माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स 8 DIV में हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर सुसंस्कृत. हम भी सफलतापूर्वक न्यूरॉन के इस प्रकार में superecliptic pHluorin टैग DRD2s TIRF इमेजिंग चित्रा 3 प्रदर्शन की अभिव्यक्ति से पता चलता है pHluorin टैग एक मध्यम काँटेदार और पीएच DRD2 इस न्यूरॉन में प्रविष्टि के न्यूरॉन दृश्य में DRD2 (पीएच DRD2).

चित्रा 1
चित्रा 1. माउस hippocampal संस्कृति इंटरफ़ेस संस्कृति विधि का उपयोग. DIV: इन विट्रो दिनों में, संस्कृति का दिन 0 DIV के रूप में माना जाता है. छवियों से, यह स्पष्ट है कि 11 DIV और 15 DIV के बीच संस्कृति के इस प्रकार में परिपक्व hippocampal न्यूरॉन्स. DIV 11 और 13, neuronal dendrites filipodia और अपरिपक्व कांटा के साथ आते हैं. 15 DIV और18, neuronal dendrites बड़े spines के साथ कवर किया जाता है, और अधिक परिपक्व न्यूरॉन्स की एक संकेत है. माउस hippocampal न्यूरॉन्स के अलग अलग उम्र में कम बढ़ाई छवियों वाम पैनल:. सही पैनल: उच्च बढ़ाई (बाएं पैनल के neuronal dendrites पर ज़ूम) छवियों को अलग अलग उम्र में वृक्ष के समान spines के साथ neuronal वृक्ष के समान प्रक्रियाओं के.

चित्रा 2
चित्रा 2 माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन इंटरफ़ेस संस्कृति विधि का उपयोग संस्कृति. छवियों में न्यूरॉन्स 8 DIV पर हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 एक माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन सुपर क्रांतिवृत्त pHluorin टैग dopamine D2 रिसेप्टर (पीएच DRD2) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. बाईं तरफ छवि रिकॉर्डिंग समय चूक की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (600 छवियों, छवि प्रति 100 मिसे) है. व्हाइट arrowheads पीएच - डी की व्यक्तिगत vesicular प्रविष्टि का संकेत मिलता हैRD2. इस छवि को xy आयाम में प्रविष्टि जानकारी बरकरार रखती है, लेकिन समय की जानकारी खो देता है. सही पर छवि yt अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण से पता चलता है, जो में xyt ढेर y-अक्ष के चारों ओर घुमाया 90 डिग्री है, और प्रत्येक पंक्ति x-अक्ष पर अधिकतम पिक्सेल एक एकल पिक्सेल y-अक्ष पर पेश किया है. इस छवि को yt अक्ष के साथ सम्मिलन जानकारी बरकरार रखती है, लेकिन जानकारी x-अक्ष खो देता है.

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Discussion

अज्ञात कारणों के लिए, माउस न्यूरॉन्स हमेशा चूहा न्यूरॉन्स से अधिक संस्कृति के लिए मुश्किल है. हमारे अनुभव में, न्यूरॉन्स और glia की एक मिश्रित संस्कृति प्राथमिक सभ्य माउस न्यूरॉन्स के लिए अच्छी तरह से काम करता है. हालांकि, इस तरह के एक मिश्रित संस्कृति TIRF इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है, संस्कृति न्यूरॉन्स और उनकी प्रक्रियाओं के इस प्रकार के रूप में glia कोशिकाओं के शीर्ष पर विकसित करने के लिए, neuronal somata और TIRF माइक्रोस्कोपी की पहुंच से परे वृक्ष के समान प्रक्रियाओं situating करते हैं. इसलिए, एक कम घनत्व coverslip पर कुछ glia साथ neuronal संस्कृति TIRF इमेजिंग के लिए आदर्श है. 20, जिसमें एक संस्कृति डिश के नीचे glia साथ वरीयता दी गई है, और न्यूरॉन्स एक coverslip पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और संस्कृति डिश में ऊपर से नीचे रखा है, हम पहले बैंकर 19 विधि का परीक्षण किया. coverslip और glia परत coverslip पर मोम की तीन छोटी बूंदों से अलग हो रहे हैं. इस विधि छोटे आकार coverslips (15-मिमी या 18 मिमी coverslips जैसे) के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन जब हम 25 मिमी सह के प्रयोग का परीक्षण कियाverslips coverslips के केंद्र के पास न्यूरॉन्स के रूप coverslip किनारों के पास उन लोगों के रूप में स्वस्थ नहीं थे.

जबकि न्यूरॉन स्वास्थ्य में इस अंतर के कारण हमारे लिए स्पष्ट नहीं था, हम तर्क है कि यह coverslip क्षेत्र के केंद्र के लिए पोषक तत्वों की सीमित प्रसार के कारण हो सकता है. इसलिए हम इंटरफ़ेस संस्कृति इस पांडुलिपि में वर्णित विधि के लिए बदल गया है, के रूप में संस्कृति डालने की झिल्ली coverslips पर न्यूरॉन्स के लिए पोषक तत्वों से मुक्त प्रसार की अनुमति देता है. हम 25 मिमी coverslips पर वरीय न्यूरॉन्स के साथ ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा न्यूरॉन्स. हम एक संस्कृति डालने पर glia वरीयता प्राप्त है, और glia फीडर प्रविष्टि coverslip के शीर्ष पर रखा है. हमने निर्धारित किया है कि अंतरफलक संस्कृति विधि अन्य तरीके हम परीक्षण किया है जब कम घनत्व माउस neuronal संस्कृति के लिए 25 मिमी coverslips का उपयोग करने के लिए बेहतर है, और TIRF इमेजिंग के लिए पैदावार अनुरूप परिणाम. W ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के साथ रिसेप्टर प्रविष्टि के गुण (आवृत्ति, आयाम), एक समूह के नियंत्रण योंith wildtype pHluorin टैग रिसेप्टर्स हमेशा शामिल किया जाना चाहिए. यह नियंत्रण समूह में भी neuronal संस्कृति के लिए एक गुणवत्ता की जांच के रूप में कार्य करता है.

हमारे TIRFM एक मैनुअल Zeiss AxioObserver माइक्रोस्कोप (कार्ल Zeiss MicroImaging, इंक, Thornwood, एनवाई) पर आधारित प्रणाली का निर्माण किया है. उत्तेजना लेजर एक न्यूपोर्ट 488nm 100mW सियान लेजर प्रणाली (न्यूपोर्ट निगम, Irvine, CA) है. लेजर KineFLEX-P-2-S-488-640-0.7 FCP P2 ऑप्टिकल फाइबर (प्वाइंट स्रोत, मिशेल प्वाइंट, Hamble, ब्रिटेन) के माध्यम से एक Zeiss TIRF स्लाइडर युग्मित है. एक Z488RDC dichroic दर्पण (Chroma प्रौद्योगिकी निगम, Falls, VT धौंकनी) एक Zeiss α योजना 100X उद्देश्य लेंस (NA = 1.46, कार्ल Zeiss) पर आने वाली लेजर को प्रतिबिंबित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक ET525/50 उत्सर्जन फिल्टर (Chroma प्रौद्योगिकी निगम) GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक विकसित EMCCD कैमरा डिटेक्टर (Photometrics, Tucson, AZ) के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक 2.5X रिले लेंस माइक्रोस्कोप कैमरा बंदरगाह और अभियान के बीच में डाला गया थायुग के क्रम में इष्टतम स्थानिक संकल्प प्राप्त (पिक्सेल प्रति 0.064 सुक्ष्ममापी जब 100X NA = 1.46 उद्देश्य का उपयोग). कैमरा -80 डिग्री सेल्सियस पर इमेजिंग प्रयोगों के दौरान बनाए रखा गया था. एक Uniblitz LS6 एक VMM-D3 नियंत्रक (विन्सेन्ट एसोसिएट्स, रोचेस्टर, एनवाई) द्वारा नियंत्रित शटर लेजर सिर और फाइबर लांचर के बीच एकीकृत किया गया. डेटा का उपयोग कर हासिल किया गया μManager सॉफ्टवेयर ( http://www.micro / manager.org ).

सभी प्रयोगों इमेजिंग aCSF युक्त 2 मिमी 2 CACL समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया. यह कमरे के तापमान पर 7.4 पीएच = aCSF समाधान निकाला जाता है. जब 37 के लिए गरम डिग्री सेल्सियस, इस aCSF के पीएच 7.2, हो जाता है जो संस्कृति में न्यूरॉन्स के लिए इष्टतम है. अधिग्रहण के दौरान, लेसर शक्ति अधिकतम पर सेट कर दिया जाता है, दोनों के लिए तस्वीर ब्लीच और डाटा अधिग्रहण के लिए,. कैमरा जोखिम मिसे 100 में स्थापित किया गया था, और अधिग्रहण की दर प्रति सेकंड 10 छवियों (10 हर्ट्ज) थी. EMCCD लाभ स्थापित किया गया थाटी अधिकतम. रिकॉर्डिंग ImageJ सॉफ्टवेयर (Rasband, था, एनआईएच, का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012), और प्रविष्टि घटनाओं पंजीकृत किया गया और मैन्युअल विश्लेषण. यूनिट सतह क्षेत्र प्रति प्रति मिनट कुल घटनाओं प्रविष्टि की आवृत्ति के रूप में ले जाया गया, और थे के रूप में 100% नियंत्रण समूह की सामान्यीकृत. Yt गाया छवियों ImageJ में y-अक्ष के साथ मूल xyt ढेर 90 ° घूर्णन द्वारा उत्पन्न किया गया है, और प्रत्येक x लाइन की अधिकतम तीव्रता y अक्ष के एक एकल पिक्सेल ImageJ में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म का उपयोग पर पेश किया गया था.

9, निवेशन घटनाओं आम तौर पर फ्लोरोसेंट (तेजी से बढ़ चरण) पुंटा, एक खस्ताहाल चरण कि प्लाज्मा 7 झिल्ली पर रिसेप्टर प्रसार का प्रतिनिधित्व करता है के द्वारा पीछा के अचानक उपस्थिति के रूप में मनाया जाता है. एक धीमी गति से बढ़ती चरण या एक स्पष्ट क्षय चरण के बिना उन लोगों के साथ फ्लोरोसेंट पुंटा उपस्थिति (अचानक disappe) Arance डेटा विश्लेषण से बाहर रखा गया है, के रूप में इन घटनाओं की संभावना intracellular vesicles कि एक कम अम्लीय लुमेन (जैसे endoplasmic जालिका से उन लोगों के रूप में) की तस्करी का प्रतिनिधित्व करते हैं. पूर्व मौजूदा सतह रिसेप्टर आबादी के Photobleach भी प्लाज्मा झिल्ली पर पूर्व मौजूदा सतह रिसेप्टर क्लस्टरिंग के योगदान को कम कर देंगे. तिथि करने के लिए, हमारे सभी डेटा मैन्युअल रूप से विश्लेषण कर रहे हैं ImageJ का उपयोग कर. स्वचालित घटना का पता लगाने और डेटा विश्लेषण के लिए कंप्यूटर एल्गोरिदम के भविष्य के विकास के प्लाज्मा झिल्ली और रिसेप्टर प्रविष्टि की परीक्षा के लिए इस विधि इमेजिंग के अनुकूलन आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण होगा.

आदेश में व्यक्ति pHluorin लेबल रिसेप्टर्स की vesicular प्रविष्टि घटनाओं कल्पना करने के लिए, कई महत्वपूर्ण मापदंडों को ध्यान में रखा जाना चाहिए. सबसे पहले, लेजर उत्तेजना काफी मजबूत करने के लिए एक vesicles से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए सक्षम होने की जरूरत है. हमारे कस्टम डिजाइन प्रणाली में, हम एक 10 0-मेगावाट हमारे उत्तेजना स्रोत के रूप में 488 एनएम लेजर. दूसरा, इमेजिंग प्रणाली की डिटेक्टर दोनों संवेदनशीलता और गति के लिए वास्तविक समय, गतिशील रिसेप्टर प्रविष्टि से डेटा प्राप्त करने की जरूरत है. इन कारणों के लिए, हम अपने सिस्टम में एक EMCCD का उपयोग करें. एक मजबूत उत्तेजना लेजर और एक EMCCD डिटेक्टर के संयोजन हमारे इमेजिंग प्रणाली में एकल GFP अणु का पता लगाने की क्षमता प्रदान करता है. एक कस्टम डिजाइन TIRF प्रणाली के हमारे विकल्प सीमित उपलब्ध संसाधनों से अधिकतम प्रदर्शन प्राप्त करने पर आधारित है. यह ध्यान देने योग्य बात है कि पर्याप्त लेजर उत्तेजना शक्ति के साथ किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TIRF प्रणाली (एक सौ मेगावाट 488 एनएम लेजर हमारे उद्देश्यों के लिए पर्याप्त है, और सबसे वाणिज्यिक प्लेटफार्मों पर आसानी से उपलब्ध है) और एक EMCCD कैमरे भी ऐसे इमेजिंग के लिए उपयुक्त होना चाहिए अध्ययन करता है. इसलिए, न्यूरॉन्स के लिए इस तरह के इमेजिंग अध्ययन के अनुकूलन TIRFM प्रणाली के प्रदर्शन के द्वारा ही सीमित नहीं है, लेकिन neuronal संस्कृति और neuronal संस्कृतियों की निरंतरता की गुणवत्ता के द्वारा.

"> तीसरा, से प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के कारण ove_content मौजूदा pHluorin टैग प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स TIRF मोड के तहत photobleach आम तौर पर एक एकल पुटिका से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक है. हम आम तौर पर एक मिनट के अधिकतम पर TIRF इमेजिंग मोड का उपयोग photobleach प्रदर्शन लेसर शक्ति एक बार एक न्यूरॉन नेत्रहीन की पहचान की है, जो पूर्व मौजूदा सतह pHluorin प्रतिदीप्ति के बहुमत के उन्मूलन में परिणाम यह भी महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि उच्च लेजर उत्तेजना शक्ति भी लेजर क्षति और phototoxicity की संभावना बढ़ जाती है. हमारे अनुभव में. , 100 मेगावाट की 488 मेगावाट लेजर का उपयोग कर के रूप में उत्तेजना स्रोत डाटा अधिग्रहण की अवधि के भीतर न्यूरॉन्स के लिए ध्यान देने योग्य नुकसान शुरू के जबकि एकल में vesicles रिसेप्टर्स दृश्यमान करने के लिए पर्याप्त लेजर शक्ति प्रदान करने के लिए प्रकट नहीं होता. एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विचार है कि मतभेद प्रकार प्रत्येक पुटिका में रिसेप्टर्स की संख्या भी लेजर उत्तेजना की आवश्यकता को प्रभावित करेगा.उदाहरण के लिए, हम पहले प्लाज्मा झिल्ली का उपयोग कर एक 50 मेगावाट उत्तेजना 7 लेजर ग्लूटामेट रिसेप्टर GluA1 सबयूनिट प्रविष्टि के विनियमन की जांच करने में सक्षम थे. हम अनुमान है कि प्रत्येक है कि अध्ययन में जांच पुटिका 56 GluA1 ± 6 अणु, एक और इसी तरह के तरीकों का 12 का उपयोग समूह द्वारा किए गए अनुमान के समान होता है. हमारे DRD2 के हाल के एक अध्ययन में, हम अनुमान है कि प्रत्येक पुटिका 30 ± 1 अणुओं निहित, और एक लेजर 100 मेगावाट है कि अध्ययन के लिए पर्याप्त था. हालांकि, क्योंकि जीवित कोशिकाओं, एक पुटिका की परीक्षा केवल कई रिसेप्टर अणु (उदाहरण के लिए, 5-10) एक लेजर 100 मेगावाट से अधिक बिजली की आवश्यकता के क्रम में एक पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं युक्त में पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर के कारण रिसेप्टर प्रविष्टि के न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली दृश्य के लिए शोर अनुपात. संवेदनशीलता और उत्तेजना शक्ति का सही संतुलन ढूँढना एक सफल अध्ययन की योजना बनाने के लिए महत्वपूर्ण है.

TIRFM मैं उपयोगदाना superecliptic pHluorin टैग रिसेप्टर्स neuronal 7-17 रिसेप्टर्स के कई अलग अलग प्रकार के लिए लागू किया गया है. हालांकि, यह बहुत महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि हमारे वर्तमान पद्धति GFP और टैग रिसेप्टर्स की अणु overexpression साथ टैगिंग रिसेप्टर्स पर निर्भर करता है. एक GFP अणु एक झिल्ली प्रोटीन की कोशिकी डोमेन संलग्न प्रोटीन समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और यह इसलिए महत्वपूर्ण है सत्यापित करने के लिए कि इस टैगिंग रणनीति में काफी जांच के तहत 9 प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. इसके अलावा, एक overexpressed रिसेप्टर या नियामक तंत्र है कि अंतर्जात रिसेप्टर्स की तस्करी को नियंत्रित करने के लिए विषय नहीं हो सकता है. स्वतंत्र विधियों इसलिए करने के लिए इमेजिंग overexpressed pHluorin टैग रिसेप्टर्स से प्राप्त परिणामों को मान्य करने की जरूरत हैं. उदाहरण के लिए, 7 प्रविष्टि GluA1 के हमारे अध्ययन में, सतह अभिव्यक्ति और अंतर्जात GluA1 रिसेप्टर्स की synaptic की तस्करी मान्य थे यूमानक immunostaining / जैव रासायनिक तरीकों या electrophysiological दृष्टिकोण गाते हैं. संक्षेप में, हमारे इमेजिंग दृष्टिकोण, झिल्ली प्रोटीन तस्करी के लिए अन्य मानक तरीकों के साथ संयोजन में विस्तृत आणविक और सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि न्यूरॉन्स में अन्य झिल्ली प्रोटीन के संचालन तंत्र विदारक में सहायक होने की संभावना है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम जैक्सन प्रयोगशाला से स्टार्टअप धन के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
purified bovine collagen solution (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
sodium pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360-070
DMEM High Glucose GIBCO, by Life Technologies 10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX GIBCO, by Life Technologies 35050-061
papain Worthington Biochemical Corp. LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
0.05% trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300-054
poly-l-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636-1G
boric acid Fisher Scientific BP 168-500
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
heat inactive horse serum GIBCO, by Life Technologies 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Culture Insert EMD Millipore PICM03050

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References

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Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Sampson, S. B., Lin, D. T. Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (69), e4450, doi:10.3791/4450 (2012).

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