Abstract
لا تزال أمراض القلب والشرايين السبب الرئيسي للوفاة في العالم 1. هندسة الأنسجة القلبية يحمل الكثير من الأمل لتقديم الاكتشافات الطبية الرائدة مع أهداف تطوير أنسجة وظيفية لتجديد القلب، وكذلك في فحوصات المختبر فحص. ومع ذلك، فقد ثبت القدرة على خلق نماذج عالية الدقة من أنسجة القلب صعبة. القلب المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو بنية معقدة تتألف من إشارات البيوكيميائية والنشاط الحيوي بدءا من الدقيقة لمقياس متناهي الصغر 2. ظروف التحميل الميكانيكية والتفاعلات خلية ECM المحلية في الآونة الأخيرة تم الاعتراف بها باعتبارها مكونات حيوية في هندسة الأنسجة القلبية 3-5.
ويتألف جزء كبير من ECM القلب من ألياف الكولاجين الانحياز بأقطار نانو النطاق الذي يؤثر بشكل كبير العمارة الأنسجة واقتران الكهروميكانيكية 2. للأسف، عدد قليل من الطرق هفه كان قادرا على تقليد تنظيم ألياف ECM وصولا الى مقياس متناهي الصغر. التطورات الأخيرة في تقنيات nanofabrication، ومع ذلك، مكنت تصميم وتصنيع السقالات تحجيم التي تحاكي في الجسم الحي العظة صلابة الهيكلية والركيزة للECM في قلب 6-9.
هنا نقدم تطوير اثنين من استنساخه، والعمليات nanopatterning قابلة للمحاذاة الوظيفية للخلايا القلب باستخدام البوليمر بولي حيويا (lactide-CO-glycolide) (PLGA) 8 والبولي يوريثان (PU) البوليمر المستندة فعالة من حيث التكلفة، و. هذه الطبقات التحتية nanofabricated anisotropically (ANFS) تحاكي ECM الكامنة وراء والأنسجة الانحياز منظمة تنظيما جيدا، ويمكن استخدامها للتحقيق في دور nanotopography على مورفولوجيا الخلايا وظيفة 10-14.
باستخدام nanopatterned (NP) سيد السيليكون كقالب، ولفق اكريليت البولي يوريثين (بوا) العفن. ثم يتم استخدام هذا القالب لبوا سنوياttern بو أو PLGA هيدروجيل عبر بمساعدة الأشعة فوق البنفسجية أو المذيبات بوساطة الطباعة الحجرية القوة الشعرية (كفل)، على التوالي 15،16. لفترة وجيزة، بو أو PLGA قبل البوليمر هو انخفاض الاستغناء على ساترة الزجاج ويوضع القالب بوا على القمة. لبمساعدة الأشعة فوق البنفسجية كفل، ومن ثم يتعرض بو للأشعة فوق البنفسجية (λ = 250-400 نانومتر) لعلاج. لبوساطة المذيبات كفل، هو منقوش على PLGA باستخدام الحرارة (120 درجة مئوية) وضغط (100 كيلو باسكال). بعد المعالجة، ومقشر القالب بوا قبالة، مخلفا وراءه ANFS للثقافة الخلية. الخلايا الأولية، مثل حديثي الولادة myocytes البطين الفئران، وكذلك الجذعية المشتقة من الخلايا العضلية المحفزة الإنسان، يمكن الحفاظ على ANFS 2.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم، وتقديم عبئا الاجتماعية والاقتصادية ذات الثقل على 1،17 النظام الصحي العالمي المتوترة بالفعل. هندسة الأنسجة القلبية لديه هدفين مختلفين: (1) لتجديد عضلة القلب التالفة بعد مرض نقص تروية عضلة القلب أو أو (2) لإنشاء نموذج عالي الدقة من القلب في المختبر لفحص المخدرات أو النمذجة المرض.
القلب هو جهاز معقد التي يجب أن تعمل باستمرار لتزويد الدم للجسم. يتم ترتيب الهياكل الصفحي المكتظ العضلية والأنسجة الداعمة في أنماط حلزونية في جميع أنحاء جدار القلب 18،19. كما يقترن قلب الكتروميكانيكية 20 بطريقة منسقة للغاية لإخراج الدم بكفاءة إلى الجسم 21. لا تزال العديد من العقبات الرئيسية التي يتعين معالجتها، ومع ذلك، قبل أن موثوق تلخيصها تصميم الطبيعة معقدة في المختبر.أولا، على الرغم من أن وسائل قوية cardiomyocyte التمايز مواصلة تطوير 22، hPSC-مضادة يزال يحمل الظواهر غير ناضجة إلى حد ما. هذه الخصائص الكهروميكانيكية والتشكل أكثرها توافقا مع مستويات الجنين 23. الثانية، عندما يوضع في ظروف الثقافة التقليدية، وفشل كل الجذعية المشتقة الخلايا العضلية الأولية وإلى التجمع في وهياكل الأنسجة مثل الأم. بدلا من ذلك، تصبح الخلايا موجهة بشكل عشوائي ولا يحمل تجمعت على شكل قضيب ظهور عضلة القلب الكبار 24.
وخارج الخلية المصفوفة (ECM) البيئة التي تتفاعل الخلايا تلعب دورا هاما في العديد من العمليات الخلوية 11،13،25. يتكون من ECM واضحة المعالم العظة معقدة، الجزيئية والطوبوغرافية التي تؤثر بشكل كبير على بنية ووظيفة خلايا 6،26. داخل القلب، والمحاذاة الخلوية تتابع عن كثب الألياف ECM مقياس متناهي الصغر الكامنة 2. تأثير هذه nanotopographالعظة كال على الخلايا والأنسجة وظيفة، ومع ذلك، لا يزال بعيدا عن المفهوم تماما. الدراسات الأولية للتفاعل خلايا بيولوجية مقياس متناهي الصغر تشير إلى الأهمية المحتملة وتأثير الفرعية ميكرون العظة الطبوغرافية للخلية مما يشير 27، التصاق 28-30، والنمو 31، والتمايز 32،33. ولكن نظرا لصعوبة في تطوير ركائز nanofabricated استنساخه وقابلة للتطوير، مثل هذه الدراسات لا يمكن أن تتكاثر آثار الخلوية متعددة على نطاق المجمع في بيئة ECM الجسم الحي. في هذا البروتوكول، وصفت تقنية nanofabrication واضحة وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج السقالات خلية ثقافة محاكاة الأم محاذاة الألياف ECM القلب، مما يسمح لمجموعة واسعة من التحقيقات الرواية من التفاعلات cardiomyocyte مادة بيولوجية. يمكن فهم كيفية تفاعل العضلية مع البيئة ECM النانو تسمح القدرة على التحكم في السلوك الخلوية إلى أكثر من تقليد كثب ظائفه الأنسجة الأمنشوئها. علاوة على ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية هي نظام تجريبية مبسطة مقارنة مع هياكل 3D ولكن لا يزال سلوكا متعددة الخلايا المعقدة للتحقيقات الثاقبة والفرز وظيفية 2،34-36. أخيرا، يمكن أن تستخدم مثل هذه السقالات لتحسين وظيفة الخلوية الكسب غير المشروع عندما زرعت في قلب لأغراض التجدد 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتجرى جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) ما لم يذكر خلاف ذلك.
1. تلفيق سيليكون ماستر
- رقاقة السيليكون نظيفة مع الإيثانول بنسبة 100٪ أو الزيلين والجافة تحت O 2/2 N الغاز.
- وضع رقاقة السيليكون في المغطي تدور بسرعات دوران 2،000-4،000 دورة في الدقيقة لإنتاج فيلم سميكة 0.3-0.5 ميكرومتر.
- نمط الفيلم مقاوم الضوء مع أبعاد الصحيح باستخدام نظام ضوئيه
- تزج تماما رقائق السليكون مغلفة مقاومة للضوء منقوشة في حجم مناسب من حل مقاوم الضوء النامية.
- شطف رقائق السليكون مغلفة مقاومة للضوء وضعها مع الماء منزوع الأيونات.
- لتشكيل صفائف ميكرون الفرعي التلال النطاق مع قرب الجدران الجانبية العمودي، عميق رد الفعل ايون حفر السيليكون يتعرض باستخدام نظام الحفر.
- إزالة مقاوم الضوء المتبقية عن طريق وضع رقاقة السيليكون في نظام آشر البلازما.
- قطع السيليكون ثAFERS مع قطع الماس ذات الرؤوس في الماجستير السيليكون بحجم مناسب لاحقة صب متماثلة.
2. تلفيق بوا قالب من السيليكون ماستر
ملاحظة: سوف حجم تضاف إلى سيد السيليكون لnanofabrication تختلف تبعا للمنطقة للسيد nanopatterned لتكرارها وكذلك لزوجة اكريليت البولي يوريثين (بوا) حل.
- نظيفة سطح سيد السيليكون مع الإيثانول بنسبة 100٪ أو الزيلين والجافة تحت O 2/2 N الغاز.
- وضع نمط الماجستير السيليكون الجانب حتى في طبق بتري.
- للسيد السيليكون مع 2 سم × 2 سم نمط السطح، ماصة 40 ميكرولتر من PUA إلى سطح النمط.
- وضع ورقة من 4 سم × 4 سم شفافة البوليستر (PET) الفيلم على الاستغناء بوا.
- اضغط لأسفل على ورقة PET ونشر بوا تحت ورقة عبر مواجهة نمط باستخدام الأسطوانة أو سطح مستو ارتفع (مثل بطاقة) بحيث بأكملهتتناول نمط من prepolymer بوا.
- وضع سيد السيليكون، prepolymer، وPET حوالي 10 سم تحت ضوء 20 واط (115 V) والأشعة فوق البنفسجية (λ = 365 نانومتر) لمدة 50 ثانية. لكي تكون فعالة، لا يمكن للضوء الأشعة فوق البنفسجية الطول الموجي يكون في أي مكان بين 310-400 نانومتر. شدة الضوء 10-15 ميغاواط / سم 2 على سطح الركيزة.
- بعد علاج، إزالة الفيلم PET ببطء مع ملقط. بوا يجب نعلق على الفيلم PET مع السلبية للnanopattern الماجستير السيليكون.
- علاج nanopatterns بوا / PET تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 12 ساعة على الأقل قبل استخدامها. التعرض المفرط ليست قضية.
- لتنظيف سادة السيليكون، ووضع فيلم آخر من الدائرة على رأس سيد بدون إضافة بوا وفضح لضوء الأشعة فوق البنفسجية (λ = 365 نانومتر) لمدة 50 ثانية وإزالة الفيلم PET. سيؤدي هذا إلى إزالة أي مونومرات غير المتفاعل.
- شطف سيد السيليكون مع الإيثانول بنسبة 100٪ أو الزيلين والجافة تحت O 2/2 N الغاز.
3A. Nanopatterning من مادة البولي يوريثين البوليمر
3B. Nanopatterning بولي (Lactide المشارك-Glycolide) هيدروجيل
- إنشاء قالب PDMS شقة عن طريق خلط بقوة سيليكون قاعدة المطاط الصناعي والمطاط الصناعي سيليكون كيل علاج في نسبة 10:1.
- صب PDMS مختلطة السلائف الحل في طبق بتري بحيث السلائف PDMS تصل إلى 5 مم حتى حافة الطبق (أي بحيث PDMS هو 5 مم).
- وضع طبق بتري وPDMS السلائف في مجفف لمدة 1 ساعة لديغا.
- نقل طبق بتري وPDMS السلائف في الفرن 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل لعلاج.
- بعد الشفاء PDMS، استخدم شفرة حلاقة لقطع PDMS شقة في 3 سم × 3 سم أقسام مربع. وسوف تكون هذه القوالب PDMS شقة تستخدم لاحقا في عملية الزخرفة.
- نظيفة 25 مم الشرائح الزجاجية الدائرية التي كتبها plالتفوق في ايزوبروبيل لمدة 30 دقيقة في sonicator المياه.
- الجافة الشرائح الزجاجية تنظيفها تحت O 2/2 N الغاز.
- إسقاط الاستغناء 100 ميكرولتر من حل PLGA (15٪ ث / ت PLGA في الكلوروفورم) على شريحة زجاجية.
- وضع قالب PDMS شقة على أعلى PLGA الاستغناء لامتصاص المذيبات والحصول على سطح مستو PLGA. تطبيق الضغط الخفيف (~ 10 كيلو باسكال) عن طريق وضع 200 غرام من الوزن على الجزء العلوي من PDMS لمدة 5 دقائق.
- قشر ببطء بعيدا العفن PDMS شقة ووضع غطاء زجاجي على طبق مسخن (120 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لإزالة المذيبات المتبقية وزيادة التصاق بين PLGA وغطاء زجاجي.
- وضع القالب NP بوا على رأس PLGA مسطحة وتطبيق الضغط المستمر (~ 100 كيلو باسكال) والحرارة (120 درجة مئوية) من خلال وضع 1 كجم الوزن على الجزء العلوي من العفن بوا بينما على لوحة التسخين لمدة 15 دقيقة.
- إزالة الوزن من PLGA غطاء الشريحة والسماح للالطبقات التحتية لتبريد إلى درجة حرارة الغرفة. لا تقم بإزالة العفن بوا حتى كانت الطبقات التحتيةتبريده.
- بمجرد أن يبرد الطبقات التحتية بما فيه الكفاية، قشر بعناية بعيدا عن العفن NP بوا، وكشف عن التحتية NP PLGA. يجب أن يكون قوام NP PLGA مظهر براق.
- وضع العينات في الانتهاء مجفف للتخزين لفترة طويلة كما في الشهر.
4. البذر الخليوي والثقافة
ملاحظة: هذا البروتوكول يصف ثقافة الأطفال حديثي الولادة myocytes البطين الفئران (NRVMs) والعضلية H7 الإنسان الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا (HESC-CMS) ولكن مصادر خلية أخرى يمكن استخدامها.
- نعلق لل coverslips ANFS (PU أو PLGA) إلى 35 ملم زراعة الأنسجة طبق البوليسترين. ماصة 20 ميكرولتر من نورلاند البصرية لاصق (NOA83H) إلى الجزء السفلي من الطبق وبلطف ضع ساترة ANFS على رأس NOA. تسمح الغراء لنشر وتغطية كامل أسفل ساترة. علاج NOA من خلال تعريض طبق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
- تعقيم ANFS قبل الشطف مع 2 مل من محلول الإيثانول 70٪ مائي لمدة 5 دقائق، مرتين. إزالة البريدthanol بواسطة الشفط. السماح لANFS تماما الجافة الهواء ل~ 1 ساعة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية التعقيم (λ = 200-290 نانومتر) في خزانة السلامة البيولوجية.
- ومما يعزز التصاق الخلوية بواسطة طلاء ANFS في فبرونيكتين بين عشية وضحاها. تمييع فبرونيكتين في الماء DI إلى 5 ميكروغرام / مل. ماصة 2 مل من محلول فبرونيكتين في الطبق. وضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها (لا يقل عن 6 ساعة).
- الحصول NRVMs، HESC-CMS، أو خلايا القلب وغيرها من الفائدة وفقا لبروتوكولات السابقة 22.
- عينة خلية الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه.
- إزالة بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- الخلايا resuspend في وسائل الإعلام ثقافة مناسبة لتركيز 4.6 × 10 6 خلية / مل.
- ماصة بعناية 200 ميكرولتر من تعليق خلية على ANFS تعقيمها. تأكد من يبقى تعليق الخلية على ساترة.
- وضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪CO 2 لمدة 4 ساعة للسماح للخلايا لنعلق على ANFS.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الحارة إلى طبق واستبدال الخلايا في الحاضنة تحت نفس الظروف.
- بعد 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام، ويغسل مع 2 مل من DPBS مرتين لإزالة الخلايا الزائدة.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الحارة إلى طبق واستبدال الخلايا في الحاضنة تحت نفس الظروف. ثقافة الخلايا لنقطة التقاء. استبدال وسائل الإعلام كل يوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 1 هو لمحة التخطيطي لعملية الإنتاج لأساليب تلفيق اثنين. بسبب حيود الضوء الناجم عن تضاريس النانو، ينبغي أن يؤدي nanopatterning في سطح قزحي الألوان إلى ANFS الشكل 2 يصور هذا السطح قزحي الألوان على منقوشة جيدا 25 ملم NP-PU ساترة (الشكل 2A) مع التلال 800 نانومتر والأخدود عرض (الشكل 2B). وظهور قزحي الألوان من ANFS تختلف قليلا اعتمادا على التلال والأخدود الاعراض.
بعد البذر الخلايا على ANFS، ينبغي أن الخلايا تبدأ في محاذاة في اتجاه مواز مع التلال الركيزة. ينبغي أن تصبح المحاذاة واضحة داخل ساعة 24 الأولى بعد البذر وينبغي أن تظل لمجمل الفترة زراعة. الشكل 3 يبين الصور مجال مشرق ممثل NRVMs بعد 7 أيام من الثقافة وHESC-مضادة بعد 48 ساعة من الثقافة. NRVMs لالثانية HESC-مضادة على السطوح NP تظهر تباين هيكلية واضحة والمحاذاة (أرقام 3B و 3D) في حين العضلية على السطوح unpatterned موجهة عشوائيا (أرقام 3A و 3C). تحليل المناعى يسلط الضوء على تأثير nanotopography على محاذاة هيكل الخلية الخلية. microfilaments الأكتين (F-الأكتين) وactinin-α الساركومير في الخلايا المستزرعة على ANFS تصبح الانحياز على طول نانو التلال ولكن تبقى موزعة بشكل عشوائي في الخلايا على الطبقات التحتية unpatterned (الشكل 4). خلايا القلب يحمل الضرب العفوي بعد 24-48 ساعة من الثقافة.
الشكل 1. Nanofabrication التخطيطي - الرسم التخطيطي للبروك اثنين nanofabrication esses. (B - D) تصوير الأشعة فوق البنفسجية بمساعدة القوة الشعرية الطباعة الحجرية (كفل)، في حين أن (E - H) تصور المذيب بوساطة CFL. (أ) يتم بوا السلبية من الماجستير السيليكون. (B) بو قبل البوليمر هو يتم وضعها على شريحة زجاجية والعفن بوا-الاستغناء انخفاض على القمة. ثم يتم كشفها (C) A بوا بو العفن وساترة لضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاج بو. حل البوليمر (E) PLGA هو على شريحة زجاجية الاستغناء قطرة ويستخدم قالب PDMS شقة لخلق سطح PLGA مسطحة. (F) يتم وضع القالب بوا على رأس PLGA شقة ويتم تطبيقها (G) الحرارة والضغط المستمر على الساخن من زخرف NP في PLGA. (D، H) بعد تقشير بعيدا عن العفن بوا، يتم ترك NP-PU أو PLGA الركيزة خلف. ويمكن بعد ذلك أن خلايا القلب المصنفة على هذا السطح NP لإنشاء صفائف الانحياز من الخلايا.
رقيقة الصفحة = "دائما"> 
الشكل 2. الركيزة NP-PU. (A) صورة من مساحة كبيرة NP السطح. ويتسبب مظهر براق وساترة من قبل nanotopography. (B) SEM صورة المقطع العرضي للnanotopography الأساسية.
الرقم 3. العضلية الانحياز. 10X الصور مجال مشرق من NRVMs بعد 7 أيام من الثقافة (A، B) وHESC-مضادة بعد 2 أيام الثقافة (C، D). مثقف على ركائز NRVMs NP-PU (B) يحمل المواءمة الهيكلية واضحة في حين NRVMs على ركائز بو شقة (A) هي الانحياز عشوائيا. السهام في (B) و (D) يشير إلى اتجاه NP تباين. مقياس شريط = 100 ميكرون.
. الرقم 4 التصوير متحد البؤر مناعي المحاذاة هيكل الخلية الخليوي والتصدعات؛ actinin α-الساركومير (الحمراء)، نواة الخلية (الأزرق)، وF-الأكتين (الخضراء). الخلايا المستزرعة على ركائز NP والانحياز α actinin الساركومير والألياف F-الأكتين بينما الخلايا المستزرعة على الطبقات التحتية مسطحة وموجهة بشكل عشوائي الألياف. أقحم على الحمراء α الساركومير قناة actinin تظهر بوضوح sarcomeres مخططة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنسجة القلب ناضجة وظيفيا التي يفتقر إليها سواء في الجسم الحي والتطبيقات في المختبر من هندسة الأنسجة القلبية. الأساليب nanofabrication كفل الموصوفة هنا هي تقنيات قوية لتحقيق المواءمة الخلوية والتأثير على وظيفة الأنسجة العيانية نظرا لقابلية النظام. ويمكن بسهولة أن مناطق واسعة منقوشة وتستخدم لزراعة الخلايا. محاذاة الخلوية العيانية أمر أساسي في هندسة الأنسجة القلبية من أجل خلق بيوميمتيك، الأنسجة وظيفية كما أنها تؤثر الخصائص الميكانيكية والكهربائية على حد سواء من عضلة القلب 38.
الطرق هنا يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من التطبيقات في هندسة الأنسجة القلبية. وقد سبق أن ثبت أن العظة النانو تساعد على خلق مكانة الخلايا الجذعية القلبية وتشجيع تجديد 14. وبالتالي باستخدام البوليمرات القابلة للتحلل مثل PLGA، "بقع" nanopatterned يمكن المبذولة لتعزيزالشفاء بعد إهانة القلب. بدلا من ذلك، باستخدام الهلاميات المائية مع معاملات الرجوعية مرونة مماثلة لقلب الأم، التفاعلات cardiomyocyte-ECM يمكن دراستها في نظام استنساخه مبسطة.
طرق أخرى مختلفة، مثل microcontact الطباعة، electrospinning، وmicrotopography، سبق لها أن استخدمت للسيطرة على هيكل هندسيا أنسجة القلب على الميكروسكيل 39-41. في حين أثبتت هذه التقنيات ناجحة في الحصول على محاذاة الخلوية، فمن المرجح أن هيكل ووظيفة الأنسجة القلبية في الجسم الحي يحكمها، العظة أصغر بكثير nanotopographical من ECM وبالتالي لدينا الركيزة NP يجب أن تثبت فائدة. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات الزخرفة الميكروسكيل لها عيوب المتأصلة مقارنة ركائز لدينا nanofabricated anisotropically. على سبيل المثال، طريقة nanopatterning لدينا هو أكثر فعالية من حيث التكلفة ويمكن السيطرة عليها من electrospinning. microcontact الطباعة، من ناحية أخرى، يختلطعلى خلايا المنشأ التمسك ممرات محددة للحصول على تباين الهيكلية. من أجل خلق أحادي الطبقة الوظيفية، يجب أن الخلايا تتكاثر ثم إما الهجرة أو الخروج من هذه الممرات لتشكيل منعطفات ضيقة. هذا هو أكثر صعوبة للخلايا مع قليل من دون القدرة التكاثري مثل العضلية حديثي الولادة. Microtopography يقتصر أيضا من عدم القدرة على خلق الطبقات الوحيدة الخلية إلى جانب بإحكام. ونظرا لحجم الخلايا مقارنة microtopography، والخلايا الموجودة في أعلى أو داخل microridges. وهذا يحد من كمية التفاعل خلية خلية والنقصان اقتران خلية خلية. مع أسلوبنا، تصبح الخلايا الانحياز عن طريق bioinspired تضاريس نانو النطاق ويمكن أن تتفاعل بحرية مع الخلايا المجاورة كما أحجام ميزة ما لا يقل عن أمر من حجم أصغر من الخلايا نفسها. وهذا يسمح لأكثر بيوميمتيك، المقرونة بإحكام خلايا الطبقات الوحيدة المراد إنشاؤه.
لأفضل النتائج مع NP-PU نقترح بشدة عقب زساترة معشوقة خطوات ما قبل العلاج. فإن هذه الخطوات زيادة البوليمر التصاق على سطح الزجاج. هذا وليس فقط المساعدات في إزالة نظيفة للسيد بوا خلال تلفيق ولكن أيضا منع البوليمر نمط من فصل من الزجاج خلال التجارب. لاختبار فعالية الخطوات ما قبل العلاج، مكان واحد NP-PU الركيزة في مجال المياه ومراقبة ما إذا كان لا يزال البوليمر انضمت إلى الزجاج.
PLGA هو المشارك البوليمر من حمض الجليكوليك وحمض اللبنيك التي تم تطويرها لكلا الجهاز وتسليم المخدرات في الجسم الحي. وبالتالي، توفر هذه التحتية جيدة، ECM حيويا للخلايا. جمود PLGA يمكن عن طريق التضمين إما ضبط نسبة حمض الجليكوليك لحمض اللبنيك أو عن طريق تغيير انكماش PLGA في الكلوروفورم.
ويمكن بسهولة أن تختلف معايير مختلفة وتعديلها في هذا النظام لتحسين أو لأغراض الفحص. العديد البوليمرات استنادا بو المتاحة مع مجموعة واسعة منالخواص الميكانيكية. وبالتالي باستخدام مختلف بو قبل البوليمرات، ويمكن أن تكون ملفقة مختلف الجمود الركيزة قبل نفس البروتوكول. يمكن للمستخدم أيضا تغيير تضاريس الركيزة. وnanotopography الركيزة يعتمد على تصميم سيد السيليكون. لذلك، مجموعة متنوعة من التلال والأخدود الاعراض، فضلا عن مختلف هندستها، ويمكن عن طريق تغيير نمط تصميم سيد السيليكون لتلبية المواصفات.
فإن حجم النانو التلال تؤثر أيضا على الخلايا والأنسجة السلوك. الاعراض الأخدود أصغر تسمح لاختراق الخلية أقل في الأخاديد والحد من تفاعل الخلايا مع nanotopography الهندسة 2. وهذا بدوره سوف يغير مدى سلوك متباين الخواص من أحادي الطبقة خلية في القلب. بالإضافة إلى ذلك، قدمت بروتوكول يقتصر على ثنائي الأبعاد (2D) خلية ثقافة والمحاذاة. من الواضح، أن تكون بيوميمتيك حقا، أنسجة القلب الهندسة سوف تحتاج إلى أن تكون 3D. هناك حاجة إلى العمل في المستقبل لdesigninز كثيفة والانحياز functional3D أنسجة القلب. بروتوكول المعروضة هنا، ومع ذلك، يوفر سيطرة متفوقة من مورفولوجيا الخلايا القلبية ويسمح للسيطرة على وظيفة العيانية أنسجة القلب بناء على الأدلة النانو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J.
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. , McGraw Hill Medical. (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
