Abstract
La enfermedad cardiovascular sigue siendo la causa principal de muerte en todo el mundo 1. Ingeniería de tejidos cardíacos es muy prometedora para entregar los descubrimientos médicos innovadores con los objetivos de desarrollo de tejidos funcionales para la regeneración cardiaca, así como ensayos de cribado in vitro. Sin embargo, la capacidad de crear modelos de alta fidelidad de tejido del corazón ha demostrado ser difícil. Matriz extracelular del corazón (ECM) es una estructura compleja que consta de dos señales bioquímicas y biomecánicas que van desde la micro-a la escala del nanómetro 2. Local condiciones de carga mecánica y las interacciones célula-ECM han sido recientemente reconocida como componentes vitales en la ingeniería de tejido cardíaco 3-5.
Una gran parte de la MEC cardiaca se compone de fibras de colágeno alineados con diámetros de nano-escala que influye significativamente en la arquitectura del tejido y el acoplamiento electromecánico 2. Por desgracia, algunos métodos VHAe sido capaz de imitar la organización de las fibras de ECM a la escala nanométrica. Los recientes avances en las técnicas de nanofabricación, sin embargo, han permitido el diseño y la fabricación de andamios escalables que imitan las señales in vivo de rigidez estructural y del sustrato en del ECM en el corazón de 6-9.
Aquí se presenta el desarrollo de dos reproducible, procesos nanoestampación escalables para la alineación funcional de las células cardiacas utilizando el poli biocompatible de polímero (láctico-co-glicólico) (PLGA) 8 y una de poliuretano (PU) de polímero a base rentable y. Estos sustratos anisotrópicamente nanofabricados (ANF) imitan el ECM subyacente de tejidos, alineados bien organizadas y se puede utilizar para investigar el papel de nanotopografía sobre la morfología celular y la función 10-14.
El uso de un nanoestructurada (NP) maestro de silicio como una plantilla, un acrilato de poliuretano (PUA) de molde se fabrica. Este molde PUA se utiliza entonces para PAttern hidrogel PU o PLGA mediante UV-asistida o fuerza capilar litografía-solvente mediada (CFL), respectivamente 15,16. Brevemente, PU o PLGA de pre-polímero es gota dispensado sobre un cubreobjetos de vidrio y el molde PUA se coloca en la parte superior. Para CFL UV asistida, la PU se expone entonces a la radiación UV (λ = 250-400 nm) para el curado. Para disolvente mediada CFL, el PLGA se graba en relieve el uso de calor (120 ° C) y presión (100 kPa). Después del curado, el molde PUA se despega, dejando atrás un ANF para el cultivo celular. Las células primarias, como los miocitos ventriculares de rata neonatal, así como los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas, se pueden mantener en la ANF 2.
Introduction
La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo y presenta una carga socioeconómica de peso en un 1,17 sistema mundial de salud ya tensas. Ingeniería de tejidos cardíacos tiene dos objetivos distintos: (1) para regenerar el miocardio dañado después de la enfermedad isquémica o miocardiopatía o (2) para crear un modelo de alta fidelidad del corazón para la detección in vitro de drogas o la modelización de enfermedades.
El corazón es un órgano complejo que se debe trabajar constantemente para suministrar sangre al cuerpo. Estructuras laminares densamente poblado de cardiomiocitos y tejidos de soporte están dispuestos en patrones helicoidales a lo largo de la pared del corazón 18,19. El corazón también se acopla electromecánicamente 20 de una manera muy coordinada para expulsar de manera eficiente la sangre al cuerpo 21. Varios obstáculos importantes siguen pendientes de resolución, sin embargo, antes de que el intrincado diseño de la naturaleza de forma fiable puede ser recapitulado in vitro.En primer lugar, aunque los métodos de diferenciación de los cardiomiocitos robustos siguen elaborando 22, HPSC-CM, aún subsisten algunos fenotipos más inmaduros. Sus propiedades electromecánicas y morfología coincide más estrechamente los niveles fetales 23. En segundo lugar, cuando se mantienen en condiciones de cultivo tradicionales, tanto derivado de células madre y cardiomiocitos primarios logran ensamblarse en estructuras como tejidos nativos. Por el contrario, las células se vuelven orientados al azar y no presentan la apariencia en forma de barra con banda de miocardio adulto 24.
La matriz (ECM) entorno extracelular con la que interactúan las células juega un papel importante en numerosos procesos celulares 11,13,25. El ECM consiste en señales moleculares y topográficas complejas, bien definidos que influyen significativamente en la estructura y función de las células 6,26. Dentro del corazón, alineación celular sigue de cerca las fibras de ECM escala nanométrica subyacente 2. El impacto de estos nanotopographseñales iCal en la célula y la función del tejido, sin embargo, está lejos de ser completamente entendido. Los estudios preliminares de la interacción célula-biomaterial escala nanométrica indican la importancia potencial y el impacto de sub-micrones señales topográficas para la señalización celular 27, la adhesión 28-30, un crecimiento del 31, y la diferenciación 32,33. Sin embargo, debido a la dificultad en el desarrollo de sustratos nanofabricados reproducibles y escalables, tales estudios podrían no reproducir los efectos celulares a escala múltiple del complejo ambiente de ECM en vivo. En este protocolo, una técnica de nanofabricación sencillo y rentable para producir andamios de cultivo de células que imitan la alineación de la fibra nativa ECM cardiaca se describe, lo que permite una amplia gama de nuevas investigaciones de las interacciones-cardiomiocitos biomaterial. La comprensión de cómo los cardiomiocitos interactúan con el ambiente de ECM nanoescala podría permitir la capacidad de controlar el comportamiento celular para reproducir con mayor fidelidad función tejido nativoción. Por otra parte, las monocapas celulares son un sistema experimental simplificado en comparación con las estructuras en 3D, pero todavía exhiben un comportamiento multicelular complejo para investigaciones profundas y selección funcional 2,34-36. Finalmente, tales andamios se podrían utilizar para mejorar la función celular del injerto cuando se implanta en el corazón para propósitos de regeneración 37.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que se indique lo contrario.
1. Fabricación de Silicon Maestro
- Limpio oblea de silicio con etanol al 100% o xileno y se seca a O 2 / N 2 de gas.
- Coloque oblea de silicio en Spin-revestidor a velocidades de rotación de 2.000-4.000 rpm para producir una película de espesor de 0,3-0,5 micras.
- Patrón de la película fotorresistente con las dimensiones correctas mediante el uso de un sistema de fotolitografía
- Sumergir completamente las obleas de silicio fotorresistentes recubiertos con dibujos en un volumen apropiado de solución fotosensible en desarrollo.
- Enjuague las obleas de silicio recubiertas de resina fotosensible desarrollados con agua desionizada.
- Para formar conjuntos de crestas escala inferior a la micra con paredes laterales casi verticales, profundidad de grabado iónico reactivo del silicio expuesta mediante un sistema de grabado.
- Retire el fotoprotector restante mediante la colocación de la oblea de silicio en un sistema de Asher de plasma.
- Cortar el silicio wAfers con un cortador de punta de diamante en los amos de silicio de tamaño adecuado para el moldeo réplica posterior.
2. Fabricación de PUA Molde de Silicon Maestro
Nota: Volumen para ser añadido a maestro de silicio para la nanofabricación variará dependiendo de la zona del maestro nanoestructurada a ser replicado, así como la viscosidad de la solución de acrilato de poliuretano (PUA).
- Limpie la superficie de maestro de silicio con 100% de etanol o xileno y seco bajo O 2 / N 2 gas.
- Coloque el lado patrón maestro de silicio en una placa de Petri.
- Para un maestro de silicio con unos 2 cm x 2 cm de superficie, patrón de la pipeta 40 l de PUA a la superficie de diseño.
- Coloque una hoja de 4 cm x 4 cm de poliéster (PET) de la película transparente sobre la PUA dispensado.
- Presione hacia abajo sobre la lámina de PET y se extendió la PUA debajo de la hoja a través de la cara patrón usando un rodillo o una superficie plana filo (tal como una tarjeta) de modo que la totalidadpatrón está cubierto por el prepolímero PUA.
- Coloque maestro de silicio, prepolímero, y PET de aproximadamente 10 cm por debajo de una luz de 20 vatios (115 V) UV (λ = 365 nm) durante 50 seg. Para ser efectiva, la longitud de onda de la luz UV puede ser en cualquier lugar entre 310-400 nm. La intensidad de la luz es de 10-15 mW / cm 2 en la superficie del sustrato.
- Después del curado, retire la película de PET lentamente con fórceps. PUA debe adjuntar a la película de PET con un negativo de la maestra nanopattern silicio.
- Curar nanopatterns PUA / PET bajo UV durante al menos 12 horas antes de su uso. La exposición excesiva no es un problema.
- Para limpiar los maestros de silicio, coloque otra película de PET en la parte superior del maestro sin la adición de PUA y exponer a la luz UV (λ = 365 nm) durante 50 segundos y retirar la película de PET. Esto eliminará cualquier monómero sin reaccionar.
- Enjuague maestro de silicio con 100% de etanol o xileno y seco bajo O 2 / N 2 gas.
3a. Polímero de poliuretano nanoestampación
3b. Nanoestampación poli (lactida-co-glicolida) Hidrogel
- Crear un molde de PDMS plana mezclando vigorosamente base de elastómero de silicona y silicona agente de curado de elastómero en una proporción de 10:1.
- Pour PDMS mixtos precursor de solución en una placa de Petri de modo que el precursor de PDMS llega a 5 mm hasta el borde del plato (es decir, de modo que el PDMS es 5 mm de espesor).
- Coloque el plato de Petri y PDMS precursor en un desecador durante 1 hora para desgasificar.
- Mueva placa de Petri y PDMS precursor en un horno de 65 ° C durante al menos 2 horas para curar.
- Después de PDMS es curado, utilizar una navaja de afeitar para cortar el PDMS planas en 3 cm x 3 cm secciones cuadradas. Estos serán los moldes de PDMS planas utilizadas más adelante en el proceso de modelado.
- Clean diámetro 25 mm portaobjetos de vidrio circular por plsobresalir en alcohol isopropílico durante 30 minutos en un sonicador de agua.
- Diapositivas lavados en seco de vidrio bajo O 2 / N 2 gas.
- Gota dispensar 100 l de solución de PLGA (15% w / v de PLGA en cloroformo) en portaobjetos de vidrio.
- Coloque un molde de PDMS plana en la parte superior de la dispensado de PLGA para absorber el disolvente y obtener una superficie plana de PLGA. Aplique una ligera presión (~ 10 kPa) mediante la colocación de un peso de 200 g en la parte superior de los PDMS durante 5 min.
- Lentamente retire del molde de PDMS plana y colocar el vidrio de cubierta en una placa precalentado (120 ° C) durante 5 min para eliminar el disolvente residual y aumentar la adhesión entre el PLGA y el vidrio de cubierta.
- Coloque el molde NP PUA en la parte superior de la plana de PLGA y aplicar presión constante (~ 100 kPa) y calor (120 ° C) mediante la colocación de un peso de 1 kg en la parte superior del molde PUA, mientras que en la placa de calentamiento durante 15 min.
- Retire el peso de PLGA tapa deslizante y deje que el sustrato se enfríe a temperatura ambiente. No quitar el moho PUA hasta los sustratos han sidoenfriado.
- Una vez que los sustratos se hayan enfriado lo suficiente, cuidado, retire el molde NP PUA, revelando el sustrato NP PLGA. El sustrato NP PLGA debe tener un aspecto iridiscente.
- Coloque las muestras de acabados en desecador para almacenarlo durante todo el tiempo como un mes.
4. Siembra de células y Cultura
NOTA: Este protocolo describe la cultura de los miocitos ventriculares de rata neonatal (NRVMs) y cardiomiocitos H7 humanos madre embrionarias de células derivadas de células madre (CMS), pero otras fuentes de células puede ser utilizado.
- Coloque el cubreobjetos ANF (PU o PLGA) a un 35 mm de cultivo de tejidos plato de poliestireno. Pipetear 20 l de Norland Optical Adhesive (NOA83H) a la parte inferior del plato y coloque suavemente el cubreobjetos ANF sobre el NOA. Deje que el pegamento hacia fuera y cubre toda la parte inferior cubreobjetos. Curar NOA exponiendo plato a los rayos UV durante 10 min.
- Esterilizar ANF mediante aclarado con 2 ml de solución acuosa de etanol al 70% durante 5 minutos, dos veces. Retire eTHANOL por aspiración. Permitir ANF se seque por completo el aire durante aproximadamente 1 hora bajo la lámpara de esterilización UV (λ = 200-290 nm) en la cabina de seguridad biológica.
- La adhesión celular se ve reforzada por el recubrimiento de la ANF en fibronectina durante la noche. Diluir la fibronectina en agua DI a 5 g / ml. Pipeta 2 ml de solución de fibronectina en el plato. Coloque en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la noche (por lo menos 6 horas).
- Obtener NRVMs, hESC-CM, u otras células cardiacas de interés de acuerdo con los protocolos anteriores 22.
- Muestra de células Centrifugar a 1000 rpm durante 3 min para sedimentar las células.
- Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
- Resuspender las células en medios de cultivo apropiados a una concentración de 4,6 x 10 6 células / ml.
- Cuidadoso pipeteado 200 l de suspensión celular a ANF esterilizados. Asegúrese de que la suspensión de células se mantiene en el cubreobjetos.
- Coloque las células en una incubadora a 37 ° C y 5%CO 2 durante 4 horas para permitir que las células se unan a la ANF.
- Añadir 2 ml de medio de cultivo caliente al plato y reemplazar las células en una incubadora en las mismas condiciones.
- Después de 24 horas, retirar el medio y lavar con 2 ml de DPBS dos veces para eliminar el exceso de células.
- Añadir 2 ml de medio de cultivo caliente al plato y reemplazar las células en una incubadora en las mismas condiciones. Cultivar las células hasta confluencia. Vuelva a colocar los medios de comunicación todos los días.
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Representative Results
La figura 1 es una vista general esquemática del proceso de producción para los dos métodos de fabricación. Debido a la difracción de la luz causada por la topografía a escala nanométrica, nanoestampación debe resultar en una superficie iridiscente a la ANF. Figura 2 representa esta superficie iridiscente en un 25 mm NP-PU cubreobjetos bien modelada (Figura 2A) con cresta 800 nm y la ranura ancho (Figura 2B). El aspecto iridiscente de la ANF variará ligeramente dependiendo de la cresta y surco ancho.
Después de la siembra de las células sobre la ANF, las células deben comenzar a alinear en la dirección paralela con los cantos del sustrato. La alineación debe ser evidentes en las primeras 24 horas después de la siembra y debe seguir siendo para la totalidad del período de cultivo. Figura 3 muestra las imágenes de campo claro representativas de NRVMs después de 7 días de cultivo y hESC-CM después de 48 horas de cultivo. NRVMs unnd hESC-CM en las superficies NP muestran anisotropía estructural obvio y (Figuras 3B y 3D) la alineación mientras que los cardiomiocitos en superficies sin patrón están orientados al azar (figuras 3A y 3C). El análisis inmunohistoquímico destaca el impacto de la nanotopografía en la alineación del citoesqueleto celular. Microfilamentos de actina (F-actina) y actinina-α sarcoméricas en células cultivadas en las ANF se alinean a lo largo de los nano-crestas pero permanecen distribuidos al azar en las células en sustratos no pautada (Figura 4). Las células cardíacas presentan latidos espontáneos después de 24-48 horas de cultivo.
Figura 1. Esquemática Nanofabrication - diagrama del proc dos nanofabricacióneses. (B - D) Representar UV asistida por fuerza capilar litografía (CFL), mientras que (E - H) representan-solvente mediada CFL. (A) PUA negativo está hecho de un maestro de silicio. (B) de la PU de pre-polímero es se coloca abandono dispensada en un portaobjetos de vidrio y el molde de PUA en la parte superior. (C) Un PUA molde y PU cubreobjetos se exponen a la luz ultravioleta para curar la PU. Solución de polímero (E) de PLGA es-caída dispensado sobre un portaobjetos de vidrio y un molde de PDMS plana se utiliza para crear una superficie plana de PLGA. (F) Un molde PUA se coloca en la parte superior de la vivienda y PLGA (G) el calor y la presión constante se aplican a hot-relieve la NP en el PLGA. (D, A) Después de separar el molde PUA, un sustrato NP-PU o PLGA se quede atrás. Las células cardíacas pueden ser sembradas en esta superficie NP para crear matrices alineadas de las células.
Figura 2. Sustrato NP-PU. (A) Fotografía de gran superficie NP. La apariencia iridiscente del cubreobjetos es causada por la nanotopografía. (B) Imagen SEM de la sección transversal de la nanotopografía subyacente.
Figura 3. Cardiomiocitos Alineados. 10X imágenes de campo claro de NRVMs después de 7 días de cultivo (A, B) y hESC-CM después de 2 días de cultivo (C, D). NRVMs cultivadas en sustratos NP-PU (B) muestran la alineación estructural obvio mientras NRVMs sobre sustratos planos de la PU (A) son al azar Alineados. Las flechas en (B) y (D) indica la dirección de NP anisotropía. Barra de escala = 100 micras.
.. Figura 4 imagen confocal de inmunofluorescencia alineación del citoesqueleto celular y estrías; actinina α-sarcomérica (rojo), los núcleos celulares (azules), y F-actina (verde). Las células cultivadas sobre sustratos NP han alineado actinina-α sarcomérica y las fibras de actina F, mientras que las células cultivadas sobre sustratos planos han fibras orientadas al azar. El recuadro en rojo canal actinina-α sarcomérica mostrar claramente sarcómeros estriados.
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Discussion
Tejidos cardíacos Funcionalmente maduros carecen de tanto in vivo como in vitro en aplicaciones de ingeniería de tejido cardíaco. Los métodos de nanofabricación CFL descritos aquí son técnicas robustas para lograr la alineación celular e influir en la función del tejido macroscópico debido a la escalabilidad del sistema. Grandes áreas pueden ser fácilmente modelados y se utilizan para el cultivo de células. Alineación celular macroscópico es esencial en la ingeniería de tejido cardiaco con el fin de crear biomimético, tejido funcional ya que influye en las propiedades tanto mecánicas y eléctricas del miocardio 38.
Los métodos aquí se pueden aplicar a una amplia gama de aplicaciones dentro de la ingeniería de tejido cardíaco. Previamente se ha demostrado que las señales a nanoescala ayudan a crear un nicho de células madre cardiacas y promover la regeneración 14. Así, mediante el uso de polímeros biodegradables tales como PLGA, "parches" nanoestructurada se podrían hacer para promovercuración después de insulto cardiaca. Alternativamente, mediante el uso de hidrogeles con módulos de elasticidad similares a las del corazón nativo, las interacciones de los cardiomiocitos-ECM se pueden estudiar en un sistema simplificado, reproducibles.
Varios otros métodos, tales como la impresión por microcontacto, de electrospinning, y microtopografía, previamente se han empleado para controlar la estructura de tejido cardiaco de ingeniería en la microescala 39-41. Si bien estas técnicas han tenido éxito en la obtención de la alineación celular, es probable que la estructura y la función del tejido cardíaco in vivo se rige por las señales, nanotopographical mucho más pequeñas de la ECM y por lo tanto nuestra sustrato NP deben resultar ventajoso. Además, estas técnicas de modelado microescala tienen desventajas inherentes en comparación con nuestros sustratos anisotrópicamente nanofabricado. Por ejemplo, nuestro método nanoestampación es más rentable y controlable que electrospinning. La impresión por microcontacto, por otro lado, RELIES sobre las células que se adhieren a carriles específicos para obtener anisotropía estructural. Con el fin de crear una monocapa funcional, las células deben entonces o bien proliferar o migrar fuera de estos carriles para formar uniones estrechas. Esto es mucho más difícil para las células con poca o ninguna capacidad de proliferación, tales como los cardiomiocitos neonatales. Microtopografía también está limitada por la incapacidad para crear monocapas de células estrechamente acoplados. Debido a la escala de las células en comparación con el microtopografia, las células residen en la parte superior o en el interior de los microcrestas. Esto limita la cantidad de interacción célula-célula y disminuye el acoplamiento célula-célula. Con nuestro método, las células se alinean a través de la topografía Bioinspirada nano-escala y pueden interactuar libremente con las células vecinas como los tamaños de las características son al menos un orden de magnitud más pequeño que las propias células. Esto permite más biomimético, monocapas de células estrechamente acoplados a ser creados.
Para obtener resultados óptimos con la NP-PU le recomendamos el siguiente gcubreobjetos lass etapas de pretratamiento. Estos pasos aumentar la adhesión del polímero a la superficie del vidrio. Esto no sólo ayuda en la eliminación limpia de la maestría PUA durante la fabricación, sino también evitar que el polímero con dibujos se separe de la copa durante los experimentos. Para probar la eficacia de los pasos de pre-tratamiento, colocar un sustrato NP-PU en agua y observar si el polímero permanece adherido al vidrio.
PLGA es un copolímero de ácido glicólico y ácido láctico que se desarrolló para ambos dispositivos y la administración de fármacos in vivo. Por lo tanto, este substrato proporciona un buen, ECM biocompatible para las células. La rigidez de PLGA puede ser modulada por ajuste de la relación de ácido glicólico a ácido láctico o mediante la alteración de la contracción de PLGA en cloroformo.
Varios parámetros pueden variarse fácilmente y se ajustan en este sistema para la optimización o los propósitos de investigación. Varios polímeros a base de PU están disponibles con una amplia gama depropiedades mecánicas. Por lo tanto mediante el uso de diferentes prepolímeros de PU, diversas rigideces de sustrato pueden ser fabricados por el mismo protocolo. El usuario también puede alterar la topografía del sustrato. El nanotopografía del sustrato es depende del diseño del maestro de silicio. Por lo tanto, una variedad de la cresta y ranura anchos, así como diversas geometrías, puede ser modelado por alterar el diseño maestro de silicio para cumplir las especificaciones.
El tamaño de las nano-crestas también influirá en el comportamiento celular y de tejido. Más pequeñas anchuras de acanaladura permiten por menos penetración celular en las ranuras y limitar la interacción de la célula con el nanotopografía ingeniería 2. Esto a su vez alterará la medida de comportamiento anisotrópico de la monocapa celular cardiaca. Además, el protocolo presentado se limita a dos dimensiones (2D) de cultivo celular y alineación. Obviamente, para ser verdaderamente biomimético, el tejido cardíaco de ingeniería tendría que ser 3D. Se requerirán nuevos trabajos para diseño propiog densa y alineado functional3D tejido cardíaco. El protocolo que se presenta aquí, sin embargo, ofrece un control superior de la morfología celular cardiaca y permite el control de la función del tejido cardiaco macroscópica sobre la base de las señales a nanoescala.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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