Summary
我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。
Abstract
細菌の細胞分裂がmidcell 1,2で10以上必須タンパク質の協調アセンブリが必要です。このプロセスの中心には、分割計画3,4においてFtsZタンパク質によるリング状の上部構造（Z-リング）の形成である。 Z-リングは、複数の一本鎖FtsZのプロトフィラメントで構成されており、Z-リングの内側プロトフィラメントの配置を理解する力発生器5,6のように、Z-リングアセンブリとその機能のメカニズムへの洞察を提供します。この情報は、従来の蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で起因する電流制限にとらえどころのない推移している。従来の蛍光顕微鏡は、光の回折限界（〜200 nm）に起因し、Z-リングの高解像度の画像を提供することができません。電子cryotomographicイメージングは小さなCに散在FtsZのプロトフィラメントが検出されましたcrescentusセル 7が、そのようなのようなより大きなセルに適用することは困難である大腸菌または B 枯草 。ここでは、定量的にEの構造組織を特徴づけるために超解像蛍光顕微鏡法、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）のアプリケーションを記述する大腸菌 、Z-リング8。
PALMイメージングは、高空間分解能（〜35 nm）と標的タンパク質の明確な識別を可能にするために、特定のラベルの両方を提供しています。我々は405nmの9時に起動したときに赤色蛍光（励起= 561 nm）に緑色蛍光（励起= 488 nm）から切り替える光活性化蛍光タンパク質mEos2とFtsZのラベルが付いた。やし実験中、シングルFtsZ-mEos2分子は確率的に活性化され、単一分子の対応する重心位置が<20 nmの精度で決定されます。 Z-リングの超解像は、すべての検出されたFtsZ-mEos2分子の重心位置を重ね合わせて再構築されます。
<Pクラス= "jove_content">この方法を用いて、我々は、Z-リングが〜100nmの固定幅を持っており、三次元的に互いに重ならFtsZのプロトフィラメントの緩い束で構成されていることがわかった。これらのデータは、Z-リング10の細胞周期依存性の変化のさらなる調査のための足がかりを提供し、関心のある他のタンパク質に適用することができます。Protocol
1。試料調製
- ひずみJB281の単一コロニーをLB培地に接種[BW25113 / pJB042（P ラック ：FtsZ-mEos2）]。 37℃で振とう機で一晩増殖℃、
- M9 +最少培地[M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO 4を 、0.1 mMのCaCl 2、MEMアミノ酸やビタミン]に文化1:1,000希釈し、中期対数期（OD 600 = 0.2から0.3）に成長室温（RT）でクロラムフェニコール（150μg/ ml）をプレゼンスインチ
- 20μMのは、（注1を参照）2時間IPTGで文化を誘導する。
- ペレットのマイクロ遠心（8,000 rpmで、1分）の文化とM9 +等量の再懸濁する。繰り返し。第二再懸濁した後、2時間室温で成長を続けています。
- 40分間室温でPBS中4％パラホルムアルデヒド液（pH = 7.4）で誘導した培養を修正しました。等容量のPBSでペレット培養再懸濁し、リピート。ライブセルイメージングする場合、等量の固定、ペレット培養、再懸濁しをスキップM9の- [M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO 4を 、0.1 mMのCaCl 2、MEMアミノ酸];繰り返し。
- 再懸濁培養で1:10にゴールドビーズを希釈します。 （ステップ2.4を参照）準備イメージング室にサンプルをアプライ。
[1]注：上記の誘導プロトコール（ステップ1.1から1.3までは）株JB281の発現系に最適化されています。詳細な誘導条件は、関心のある他の発現系またはタンパク質によって異なる場合があります。
2。イメージング会議所の組立
- M9の3％（w / v）のアガロース溶液を作る- 。 40分間ベンチトップヒートブロックで70℃アガロース°Cを溶かす。ストアは、最大5時間までを50℃でアガロースを溶かし。
- 下向きに電極を有するイメージング室の上半分にきれいmicroaqueductスライドを配置します。灌流チャンネルを覆うようにmicroaqueductスライド上下部ガスケットの位置を合わせます。
- ガラスの中央に溶けたアガロースの〜50μlをスライド。清潔で乾燥したカバースリップと直ちにトップアガロースゲル滴。ゲルは室温で30分間凝固させる。
- カバーガラスをきれいにするには：セラミックホルダーでカバーガラスを手配し、アセトン、エタノール、ガラスジャーに1M KOHの浴場を回転させることで20分間超音波洗浄します。のdH 2 Oに単一の超音波処理し、続いて9 sonicationsの合計のため、サイクルを3回繰り返す新鮮なのdH 2 Oで洗浄カバースリップを保管使用前に、ろ過された空気と乾いたカバーガラスを吹く。
- 慎重microaqueductスライドにゲルパッドを残して、カバースリップを削除します。直ちにゲルパッドの上部に細胞培養サンプルを1μl（ステップ1.6を参照）を追加します。溶液がゲルパッドで吸収されるように、約2分間待ちます。新しい、きれいな乾いたカバースリップを持つトップゲルパッド。製造元の指示に従って、全体のイメージングチャンバーを組み立てます。
3。画像収集
- 顕微鏡、カメラとレーザーの電源をオンにします。 MetaMorphソフトを開く陶器（Molecular Devices社）。
- イメージングパスの適切な励起/発光フィルタ（ 図1）を配置します。
- それに応じてレーザーパワーおよび取得の設定を行います。
- 488 nmのレーザー= 15 MW（注2を参照）
- 561 nmのレーザー= 75 mWの
- 405 nmのレーザー= 2 mWで±減光フィルター （注3を参照）
- 補完的なステージアダプタを介してステージにイメージング室をロックします。
- 均一にすべての3つのレーザーで照らされている適切な撮像領域（100×100ピクセル）を指定します。
- 近接セルと基準マーカー（ゴールドビーズ）の両方が含まれていますが、重複しないサンプル領域を識別します。
- カバーガラスに最も近い細胞の表面に焦点を当てています。 50ミリ秒の積分時間で1明視野画像を取得します（ 図3AI）のサンプルに焦点を0.5μmに移動します。
- 488-nから励起によるアンサンブル緑色蛍光画像を取得メートルレーザーは、50ミリ秒の積分時間（ 図3Aii）を使用。
- 405 nmおよび561 nmのレーザーからの連続的な照明と赤のチャンネルでストリーミングビデオを取得します。固定した細胞では、50ミリ秒のフレームレートは1,000フレーム〜10％上昇させ405 nmのレーザーパワーで20,000フレーム（〜17分の合計）の合計（注＃4を参照）のために使用されます。生きている細胞は、10ミリ秒のフレームレートを一定に405 nmのレーザーパワーで3000フレーム（約30秒合計）の合計のために使用されます。
- 細胞の下面にフォーカスを移動し、ステップ3.7のような別の明視野画像を取得する。
[2]注：セルの緑色蛍光の積分強度は、細胞内で発現FtsZ-mEos2分子の総数に正比例します。 488 nmの励起パワーとアンサンブル蛍光買収の設定が異なるセル内の相対FtsZ-mEos2発現レベルを比較することができるように、すべての細胞のための一定に保たれるべきです。
ontent "> [3]注：固定セルは、個々の分子を正確に識別することができるように遅い活性化率を達成するために所定の位置にニュートラルデンシティ（ND）フィルター（ 図1、光コンポーネント＃5）で撮像する。回折限界の領域で同時にアクティブにされて2分子の低確率を維持しながら、イメージング、細胞が活性化率を高めるために生きるときにNDフィルターが除去された。速い速度は、ライブセルイメージングに適用総取得時間を短縮するために必要とされる、それによって時間にZ-リングを "凍結"とセルに光損傷の効果を制限する。[4]注：取得したフレームの数が当社のシステムに最適化されており、特定の細胞構造に依存していた、密度のラベリング活性化率と蛍光団のプール全体を排気するかどうかは、分析のために重要である。生きた細胞では、TIのように短期間でローカライズ十分な数を得ることが重要である私はできるだけ細胞構造の動きによる画像のブレを防ぐことができます。
4。 PALM画像構築
- 検出された各スポットの重心位置を決定します。
- MATLAB（MathWorks社、株式会社）に画像スタックをロードします。
- すべての基準ビーズを除いた1セルの周囲の領域に画像スタックをトリミング。
- バックグラウンドレベルを超えるが、平均スポット強度を下回っているスポットの検出のために強度のしきい値を選択します。我々は、150フレームウィンドウを使用して最大強度の平均値を算出することで、実験を通じてバックグラウンドレベルの変動を考慮する。各フレームの強度のしきい値は、実行中の平均値から補間されます。
- 各フレームからそれぞれのしきい値を減算します。将来のスポットがしきい値以上の強度を持つ3つの隣接するピクセルとして識別されます。
- 二次元Gaussiaにそれぞれの将来のスポットの蛍光強度を合わせるn個の関数[式＃1]非線形最小二乗アルゴリズム（ 図2）を使って 。各スポットのローカライズ精度が検出された光子の総数[式＃2]を使用して計算されます。 20nmの（固定された細胞）または45ナノメートル（生きた細胞）を超えるローカリゼーション精度で任意の悪いフィットスポットは（ノート＃5を参照）は破棄されます。重複エミッタが原因の可能性平均強度の2倍以上の強度を持つ任意のスポットが、また廃棄されます。
- 固定した細胞は、その重心位置の45 nm以内で任意の場所を無視して同じ分子の繰り返し観測を削除 6フレーム以下でそれに先行した他のスポットの。生きている細胞は、全てのスポットは保持されます。
- 基準マーカの動きを使用して、サンプル·ドリフトをキャリブレーションします。
- 基準マーカの周りに10×10画素領域外作物。
- 各フレームから4.1.3で求めたそれぞれのしきい値を減算します。
- それぞれの強度プロファイルに適合最小二乗フィッティングアルゴリズムを介してフレームには2次元ガウス形を仮定。
- フレーム1に対して相対的に重心位置のずれを計算します。
- 4.2で計算された適切な試料ドリフトを4.1で識別された各ユニークな分子の重心位置を修正してください。 3.7と3.10で取得明視野画像を比較してください。細胞は基準マーカーに対して相対的に移動することが観察されている場合、データは放り出されます。
- 15x15 nmの画素で構成される単一のイメージ上のすべての補正された重心位置を重ね合わせる。ローカライズの精度[式＃2]に等しい標準偏差が重心位置を中心と単位面積、2次元ガウスプロファイルとしてそれぞれユニークな分子をプロットします。画素の強度は、そのピクセルに分子を見つける可能性（ 図3Aiv）に比例した確率密度マップ、この結果。
- アンサンブル画像にPALM画像を比較。
- それから再セントロ4.4のようですが、150×150 nmの画素と250nmに等しい標準偏差を持つ平面上のID位置。これは回折限界、3.8（ 図3Aiii）で取得アンサンブル画像と比較するために使用することができ、回折限界像を模倣PALM画像を生成する。
- 検出された分子は、全人口の代表的なものであることを確認するには、両方のイメージが同じような形状の構造を示していることを確認するために実験的なアンサンブル蛍光画像（ 図3Aii、ステップ3.8）を用いて再構成されたアンサンブル画像（ 図3Aiii、ステップ4.5.1）を比較、向きや相対強度。
[5]注意：最低限必要なローカリゼーションの精度が指定されているサンプルのためにすべての分子の精度をプロットして、適切なカットオフを選択することにより、各撮像法について経験的に決定した。
5。 PALM画像解析
- Z-リングWidtを測定hと直径。
- なるように垂直に配向し、細胞の長軸方向（ 図4A）にPALM画像を回転させます。
- Z-リングを含む細胞外領域の作物。
- 細胞の長軸に沿った強度分布を投影することによって累積強度を計算します。
- ガウス分布に強度プロファイルに適合。リング幅はフィットガウス分布（ 図4B）の半値全幅（FWHM）として定義されています。
- セルの短軸に沿って5.1.2の累積強度プロファイルを投影。リング径は強度プロファイルの全長（ 図4C）として定義されています。
- （注＃6を参照）FtsZ密度をプロットする。
- （4.4）のように重心位置を再プロットが、それぞれのユニークな分子が1の値を与えられ、その重心位置に対応する単一の画素に割り当てられるようガウシアンプロファイルなし。このように、各々の強度のピクセルは、そのピクセルで検出分子の総数を表します。密度PALM画像も等高線図（ 図5E）として可視化することができる。
- 空間分解能を決定する。
- 理論的に達成可能な空間分解能：検出されたすべての分子の平均決定ローカリゼーション精度を使用して、すべてのサンプルで代表PSFを作成し、半値幅（式第3）を計算します。
- 実験的に達成された空間分解能：同じ分子の繰り返し観測間の平均変位を計算します。
[6]注：我々は、細胞/ガラス界面上記の薄層（〜200 nm）の活性化と励起を制限するために、内部全反射パーム（TIR-PALM、 図1および図5）を用いた。カバースリップに近い膜に関連付けられている唯一のFtsZ分子が検出されるようにします。
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Representative Results
図3Aivに示すが、上述のPALMイメージング法から生成Z-リングの二次元、超解像レンダリングです。以下では、私たちがそれらから得られる定性的および定量的な情報を要約したものです。
定性的には、我々は、Z-リング（ 図3A-DIIと iv を比較）従来の蛍光画像では区別できないので、複数の構成（シングルバンドまたはヘリカル円弧）を採用しており不規則な構造であることを観察した。このような観察は、特定の構造構成が表示された細胞集団の割合を決定するために用いることができる。
また、定量的に、Z-リングの寸法を測定することができます。リングの幅と直径を決定するための我々のアプローチは、ステップ5.1に記載されており、 図4に示されている。 図4Bから、年輪幅がDETだった113のnm（FWHM）であることが王侯にされた。この値は、単一のFtsZのプロトフィラメント（ インビトロ EM 11 に基づいて5から10 nm）の予想幅よりも広い。 図4Cは、リング径は1050 nmで測定されます。この直径を定量的に細胞分裂時の収縮の度合いを記述するために使用することができます。
別の定量的なアプローチは、定義された領域内に局在する分子の数をカウントすることにより、分子の密度を計算することです。密度測定は、分子構造中にパックされている方法をしっかりに関する情報を提供します。分子密度は、相対的と絶対的の両方に記載することができます。相対密度（全細胞対Z-リングなどの分子の分率）とは異なる細胞領域に分子の分布に関する情報を提供します。絶対密度測定は、ヤシの画像（ 図3Aiv）が実際に 2D投影であるという事実によって複雑になる3Dオブジェクトの。この合併症を回避するために、我々は、Z-リングの片側に検出面を制限するTIR-PALMを採用。結果のデータは、図5（e）に示されている。プロットされた分子が合計FtsZ集団のサブセットを表すため、決定された密度は、実際の密度の下限値である。 Z-リングのTIR画像で観察された最大濃度は、いくつかのセクションでは、プロトフィラメント10を重複して含まれていることを示唆している。
図1当社の顕微鏡のセットアップの概略図。すべての3つのレーザーが適切な励起波長を正確に制御することが可能にMetaMorphで開発されたカスタムイメージングプログラムによって制御されます。ライトグレーのラインが排出経路を示しながら、濃い灰色の線は、励起光の経路を示している。全内部リフレ用ction（TIR）顕微鏡検査、調節可能プラットフォームは、入射角を変化させるように光路に垂直に変換されます。
図2：PALM方法の概要。最初は、すべてのFtsZ-mEos2分子が緑色蛍光状態になっています。 405と561レーザーによる連続照明にさらされると、単一の分子が確率的に赤色蛍光状態に変換されます。退色速度が405と561のレーザーの両方の力によって決定されるが、このプロセスの速度は、405レーザーのパワーによって決定されます。理想的には、活性化と退色率は1分子のみがフレームごとに検出されるようにバランスが取れています。フレームの十分な数が取得されると、画像は、手順4.1で説明されるように識別された各スポットを当てはめることにより、MATLABで処理されます。各uniqのUE分子は次にここに擬似赤色で示されているように、こうしてPALM画像を生成する、単一の平面上で（ステップ4.4）プロットされます。赤枠で囲まれたフレームは前のフレームと同じ分子から繰り返しスポットが含まれていると判断されたため、PALMイメージの構築時に含まれていませんでした。
図3 FtsZ-mEos2を表明（CとD）固定（AとB）と生細胞の代表画像。すべてのセルに対して、アウトラインと一般的な形状は、明視野像（i）で可視化することができる。アンサンブル蛍光画像（ii）は 488レーザー（ステップ3.8）からの励起で取得したとFtsZ-mEos2のプール全体の分布を表しています。 PALMデータ（ⅲ、ステップ5.4）から再構成されたアンサンブル·イメージは、メソッドの忠実なために定性的なチェックを提供真のアンサンブル構造の表現。生成されたPALM画像（iv）はすべてユニークFtsZ-mEos2ローカライゼーションの総和であるとFtsZ-mEos2の確率密度マップを表します。セルのアウトラインは、イメージIIIおよびIVでの黄色の点線で表されます。細胞は単一バンドのコンフォメーションとCショーFtsZ、セルBとDは回折限界のアンサンブル画像（iii）で検出されない螺旋状のアークコンフォメーションを採用するFtsZを示している。スケールバーは500nmである。
図4。 Z-リング幅（赤色）とZリング径（グリーン）B.リング幅の概略図を示すA. PALM画像（青のX）は、細胞の長軸に沿ってで投影強度プロファイルをフィッティングすることにより算出されガウス関数（GRAYライン）、次に半値幅（赤点線）を決定する。ここで、リングの幅は113 nmであることが決定された℃のリング径は最初のセルの短軸方向の強度プロファイルを投影してから、ゼロ以上の強度プロファイルの全長（緑点線）を計算することによって決定される。 Z-リングの直径は1050 nmであることが決定された。
図5 TIR-Palmは分子の正確なカウントが可能になります。 図3に示すように、明視野像（）、アンサンブル蛍光画像（B）は、再構築されたアンサンブル蛍光イメージ（C）とPALM画像は、（D）はFtsZ-mEos2を発現している与えられたセルのために示されている。 Dを構築するために使用される同じデータが分子denの等高線図として再プロットされているEのsity（ピクセル当たりの分子）。この密度解析から、FtsZ-mEos2はピクセルあたり8分子で最大限に存在することが決定した。 FtsZのプロトフィラメントの単層は、画素10あたり5分子の最大密度をもたらすので この分析は、Z-リングはFtsZのプロトフィラメントの複数の層で構成されていることを示唆している。
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Discussion
PALMのイメージは、他の手段によって達成することは困難である標的タンパク質分子の分布および配置の詳細な分析を可能にする、セル内の分子数と位置に関する情報が含まれています。以下では、PALM画像の生物学的関連性を維持しながら、正確な定量的情報を抽出するために取られるべきである注意事項を概説しています。我々はまた、最高のライブ対固定された細胞を用いて得ることができる情報を探る。最後に、我々は細胞分裂機械に関する追加超解像情報を取得するための道を示唆している。
上記の方法は、次の方法で正確やし画像を生成するために最適化された。まず、特徴、それは、Z-リング構造10の信頼できるマーカーとして機能することを確実にするために、融合タンパク質の機能を最適化しました。両方過剰と過少発現の結果から、融合タンパク質の第二に、我々は微調整された表現異常な構造形成10,12,13インチ第三に、我々は、蛍光photoblinking特性14に基づいてユニークな分子判定（ステップ4.1.5）のしきい値を選択しました。 Photoblinkingユニークな分子の決定を複雑にして、無視した場合、単一分子の過大につながる。過大に寸法測定には影響しませんが、それは絶対的な密度測定を増幅ず、誤ってクラスタの外観を作成することがあります。関心のある他のタンパク質にこの方法を適用するときに、これらのすべての要因を慎重に検討すべきである。
イメージングのためのライブまたは固定された細胞の選択は、所望の情報やスループットに依存します。ライブセルイメージングは、ローカライズ（ つまり、動きの遅い）分子上に（30秒）、高速が、唯一のレポートです。これは、通常、その固定された細胞は、すべての標識分子の情報を提供している間のみ、膜関連分子は、生きた細胞で観察されることを意味します。ライブセルイメージングPR高解像度の構造寸法および形態をovidesが、個々の分子の動きによる正確分子密度測定を提供することができません。固定した細胞のイメージはこの情報のすべてを提供していますが、ユニークな分子を同定することができるように、低UV活性化レベルを必要とすることができます。これは、拡張された撮影時間（> 15分）につながる。加えて、固定は構造異常を引き起こす可能性があります。例示するサンプル·タイプを使用するかを選ぶとき、これらの要因のすべてがバランスを保つ必要があります。
我々が説明したPALM法は異なる株、細胞周期の状態、および成長条件間で比較することができ、Z-リング構造の超解像の詳細を提供します。最近の技術の進歩の実装では、Z-リングの細胞質分裂のメカニズムで追加された洞察力を提供することがあります。例えば、検出経路に乱視を導入する光学セットアップイラストに3次元機能を（〜100 nmのz軸分解能）を追加する最も簡単な方法です図1に 15で評価した。また、同時に2つ以上のタンパク質の同時イメージングはスペクトル的に異なる光活性化蛍光タンパク質の急速な出現と現実的な選択肢となっています。最後に、UV-Aに依存しない方法でphotoactivates蛍光タンパク質の開発には405 nmの照射によって誘発されるDNA損傷を発生させることなく、単一細胞の長期的なモニタリングを可能にするであろう。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
グラント：5RO1GM086447-02。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
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