Summary
Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.
Abstract
Inmunoterapia del cáncer puede aprovechar la especificidad de la respuesta inmune para atacar y eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) sobre la base de la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mostrado una promesa considerable en los ensayos clínicos 1-4. Hay varias ventajas de utilizar CAR + células T para el tratamiento de cánceres, incluyendo la capacidad de apuntar no-MHC antígenos restringidos y para funcionalizar las células T para la supervivencia óptima, mensajeras y persistencia dentro del huésped, y finalmente para inducir la apoptosis de CAR + células T en el caso de toxicidad para el huésped 5.
La delineación de las funciones óptimas de CAR + células T asociados con un beneficio clínico es esencial para el diseño de la próxima generación de ensayos clínicos. Los recientes avances en imágenes de animales vivos como microscopía multifotónica han revolucionado el estudio de la función celular inmune in vivo 6,7. Aunque estos estudios han avanzado nuestra comprensión de las funciones de las células T in vivo, las células T ACT basada en ensayos clínicos, requiere la necesidad de vincular las características moleculares y funcionales de las células T preparaciones de pre-infusión con eficacia clínica después de la infusión, utilizando en ensayos in vitro de vigilancia de células T como las funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Estándar de citometría de flujo basados en ensayos han sido desarrollados que determinan el funcionamiento general de las poblaciones de células T a nivel de una sola célula, pero estos no son adecuados para el seguimiento de la formación de conjugado y tiempos de vida o la capacidad de la misma célula para matar múltiples objetivos 8.
Arrays microfabricados diseñado en polímeros biocompatibles, como el polidimetilsiloxano (PDMS) son un método particularmente atractivo para confinar espacialmente efectores y objetivos en volúmenes pequeños 9. En combinación con la microscopía de fluorescencia automatizado time-lapse, aunqueusands de interacciones efector-objetivo pueden ser controlados simultáneamente por los distintos pozos de imágenes de una gran nanowell. Se presenta aquí una metodología de alto rendimiento para el seguimiento de la citotoxicidad de células T mediada a nivel de una sola célula que puede aplicarse ampliamente para estudiar la funcionalidad de las células T citolítica.
Protocol
1. Reactivos Preparación
- Preparar RPMI-PLGH mediante la mezcla de 500 ml ml de RPMI-1640 y 5 de cada uno de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, y la solución de HEPES.
- Preparar R10 solución mediante la mezcla de RPMI-PLGH con suero fetal bovino al 10% (FBS). El FBS es inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min antes de la adición.
- Pre-caliente a 37 º C 50 ml de medio RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, y 15 de R10 en tubos cónicos estériles.
- Fabricación de matrices de nanowells en PDMS: El maestro de silicio se fabrica utilizando fotolitografía esencialmente como se describe anteriormente 10. Mezclar bien la base de Sylgard 184 kit elastómero y el agente endurecedor a una relación de peso de 10:1 en un vaso desechable usando un cuchillo de plástico. Desgasificar la mezcla en una cámara de vacío durante 1 hora. Vierta la mezcla sobre la matriz nanowell, selle con un portaobjetos de vidrio y se deja reposar durante 30 minutos. Transferir el conjunto en un horno a 80 ° C durante 2 horas y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 1 hr. El elastómero se acte durante este período y se adhiere a la placa de vidrio. La lámina de vidrio que contiene la matriz PDMS nanowell es cuidadosamente levantado del maestro de silicio, cubierta con cinta adhesiva y se almacena hasta su uso futuro.
2. Célula diana (T) Etiquetado
- Contar 5 millones de células diana de cultivo de células utilizando un hemocitómetro y sedimentar las células en un tubo estéril de 15 ml cónico por centrifugación a 340 xg durante 5 min. El cultivo celular se divide el día anterior en el volumen total de 5 ml (densidad = 1 millón / ml) y se cultivaron en matraz T-25 (VWR). Los protocolos para el recuento de células usando un hemocitómetro se han descrito en detalle previamente 11
- Aspirar el exceso de material dejando atrás aproximadamente 50 l de medios de comunicación.
- Preparar una solución de trabajo de Cell Tracker Red (CTR) mediante la mezcla de 0,5 l de stock CTR (1 mM) a 150 l de RPMI-PLGH (concentración final 2,5 mM). Añadir 150 l de la solución de trabajo a las células diana y mezclar cuidadosamente con una pipeta P200.Alternativamente, PKH 26 (concentración final de 2 mM) se pueden utilizar células de etiqueta de destino de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 20 min.
3. Efector (E) Cell etiquetado
- Contar 5 millones de células efectoras procedentes de cultivo de células utilizando un hemocitómetro y sedimentar las células en un tubo estéril de 15 ml cónico por centrifugación a 340 xg durante 5 min.
- Aspirar el exceso de material
- Preparar una solución de trabajo de Vybrant solución Stain DyeCycleViolet mediante la adición de 1 l de 5 mM de existencias Violet Vybrant a 1 ml de R10 medios (concentración final de 5 mM). Añadir la solución de trabajo a las células y resuspender usando P200 pipeta. Alternativamente, PKH 67 (concentración final de 2 mM) se pueden utilizar células de etiqueta de destino de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si PKH 67 se utiliza, a continuación, Sytox Green no debería utilizarse ya que están en el mismo canal de fluorescencia. La enumeración de los objetivos de apoptosis se realiza exclusivamente mediante unnnexinV tinción en este caso.
Nota: Si se realiza lapso de tiempo y no mediciones de punto final, como tintes UV Violet Vybrant debe ser evitado. - Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 20 min.
4. Separación de células vivas y muertas por gradiente de densidad
- Añadir 6,8 ml y 6,0 ml de RPMI-PLGH a diana y células efectoras, respectivamente, y mezclar pipeteando arriba y abajo suavemente.
- Capa de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus a fondo de cada tubo cónico que contenía diana y células efectoras. Capa de la Ficoll lentamente para asegurar una buena formación de capas entre Ficoll y medios de comunicación.
- Centrifugar ambos tubos a 340 xg durante 30 min. sin freno y aceleración.
- Durante la centrifugación, transferir 7 ml de PBS precalentado a una placa de 4 pocillos. Preparar matriz nanowell (fabricado en PDMS): parte inferior de la placa de vidrio limpia con etanol y oxidar el PDMS en ajuste alto de RF utilizando plasma oxidante durante 1 min. Este paso steRilize la matriz nanowell al mismo tiempo haciendo que el PDMS hidrófilo. Mueva inmediatamente la matriz nanowell en la placa que contiene PBS.
- Colocar la placa a una cabina de bioseguridad y aspirar el exceso de PBS. Hacer 10 ml 1% de agar noble por la adición de 100 mg de polvo de agar a 10 ml de agua desionizada y luego el microondas durante 30-45 segundos. Aplicar calentar 1% de agar noble en el borde superior e inferior del portaobjetos de vidrio que contiene la matriz de nanowell para inmovilizar la matriz y esperar 10 minutos para agar para solidificar. Añadir 3 ml de PBS y agar exceso de aspiración.
- Añadir 3 ml de R10 en la parte superior de la matriz nanowell y se deja equilibrar durante aproximadamente 10 minutos.
- Con posterioridad a la centrifugación de Ficoll, aspirar 5 ml de medio de la capa superior de cada tubo. Tenga cuidado de no aspirar la capa que contiene las células.
- Recoger las células (capa blanca) mediante la recuperación de 1-2 ml de la capa entre Ficoll y medios de comunicación con P1, 000 pipeta y se mueven a nuevos tubos cónicos estériles. Repita esto para los dos grupos de células mientras se asegura de que usted máximaize las células de recuperación.
- Añadir 3 ml de pre-calentado RPMI-PLGH a cada tubo, mezclar mediante pipeteo y sedimento por centrifugación a 340 xg durante 5 min en plena aceleración y freno.
- Aspirar el exceso de material, añadir 5 ml de pre-calentado RPMI-PLGH a cada tubo y repetir la centrifugación a 340 xg durante 5 min.
- Aspirar el exceso de material y resuspender el pellet celular en 500 l de R10.
- Contar las células vivas utilizando el método de exclusión de azul tripán en un hemocitómetro.
5. Célula de carga en matriz Nanowell
- Aspirar el exceso de material de la matriz nanowell y añadir 2 ml de R10 fresco a través de la matriz. Aspire de nuevo mientras se asegura la parte superior de la matriz nanowell no es demasiado húmedo / seco ya que afectará a la distribución de células.
- Depósito 1 x 10 5 células efectoras en 200 l de R10 sobre la superficie de matriz nanowell (densidad = 5 x 10 5 células / ml).
- Vamos células se asienten durante 5 min y utilizando un estándar de cultivo de tejido de verificación para microscopio enAsegúrese de que la distribución de las células es deseable. Agregar más celdas si es necesario.
- Depósito 1 x 10 5 células diana en 200 R10 l en la superficie de matriz nanowell (densidad = 5 x 10 5 células / ml).
- Vamos células se asienten durante 5 min y utilizando un estándar de cultivo de tejido de verificación microscopio para asegurarse de que la distribución de las células es deseable. Agregar más celdas si es necesario.
- Enjuagar cuidadosamente con arreglo nanowell 2 ml R10 y el exceso de material aspirado.
- Preparar 3 ml precalentado R10 en un tubo cónico de 15 ml estéril. Añadir 3 l de 0,5 mM Sytox Nucleic Acid Green Stain (mM concentración final de 0,5) y 60 l de Annexin V-Alexa Fluor 647 para preparar la solución de trabajo. Añadir la solución de trabajo sobre la placa de 4 pocillos cuidadosamente mientras se asegura que las células no son desplazados de los pocillos.
- Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 15 min.
6. Imagen 1
- Adquirir imágenes de la matriz nanowell utilizando un micr fluorescenciaoscope: En este ejemplo, se utiliza un Observador ZEISS Z-1 microscopio equipado con una platina motorizada y Lambda-DG4.
- Inicializar el software y el microscopio y comprobar la intensidad de señal en la luz transmitida y los otros canales fluorescentes. En general, habrá cinco canales correspondientes a: luz transmitida, Anexina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), Sytox Green (filtro FITC), y Vybrant Violet (DAPI filtro). Asegúrese de que el microscopio configurarlo para garantizar la máxima señal a ruido y evitar la saturación.
- Establecer ejes X e Y para la matriz nanowell. Comenzar el proceso de ajuste de la posición cero y la inicialización de enfoque en el centro de 7 x 7 nanowell bloque de matriz en la esquina superior izquierda de la marca de gama nanowell. Establecer los ejes X, Y puestos a coincidir con el centro de cada bloque y el valor z para reflejar con precisión la concentración en cada bloque.
- Una vez que la posición y el enfoque está todo listo, asegúrese de establecer la adquisición de imágenes en modo lineal y adquirir imágenes.
7. Mensaje de imágenes
Colocar la placa de 4 pocillos que contiene la matriz nanowell en una incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 6 horas.
8. Imagen 2
Adquirir las imágenes en el segundo punto de tiempo como se indica en el Paso 6.
9. Análisis de Imagen
- La ocupación de las células dentro de la nanowells se determina por el uso de los apropiados programas de segmentación de imágenes (por ejemplo ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) esencialmente como se describe previamente 9,12.
- Análisis del conjunto inicial de imágenes de microscopio (t = 0 h; t 0) se utiliza para generar una base de datos de los nanowells individuales que contienen exactamente una célula diana en vivo (identificadopor CellTracker Rojo, rojo) y no hay células muertas (identificados por tinción con Anexina V, verde) [T1t 0 nanowells].
- Análisis de la segunda serie de imágenes de microscopio (t = 6 h, t 6) se utiliza para determinar de forma independiente una segunda base de datos de nanowells que contienen 1 célula diana (rojo) [T1t 6 nanowells]. La comprobación de integridad (consulta de base de datos) se implementa para asegurar que todos los objetivos en vivo en t 0 se hacen coincidir con los objetivos en t 6 para producir un conjunto final de objetivos coincidentes (implementada como nanowells que tienen T1t 0 = T1t 6, designada como T1match)
- El número de células efectoras en nanowells se determina mediante tinción con violeta Vybrant en t 0 [nanowells E1]
- Una consulta de base de datos se lleva a cabo para identificar nanowells que contienen efectores individuales co-incubadas con objetivos individuales (definidas como nanowells que tienen partido E1 y T1, designados como E1T1)
- Apoptosis inducida Effector es calificada por i DENTIFICACIÓN objetivos que son Anexina V negativo en t 0 y Anexina V positivo en t 4 (E1T1 con tinción Anexina V en blanco t 6).
10. Opcional Time-lapse de imágenes de la matanza Uso BioStation Nikon IM
- Tome una cápsula de Petri con fondo cubreobjetos y cortar un pedazo pequeño de la gama de chips nanowell (preparado en el paso 5) que se ajuste exactamente en el cubreobjetos. Asegúrese de que el chip se mantiene húmeda durante el corte.
- Mezclar 1 x 10 6 dianas y 1 x 10 6 células T en 100 medios de comunicación, y mu l pipeta que en el cubreobjetos.
- Espere unos 15-30 minutos a que las células se asiente.
- Rápidamente invertir el pequeño chip nanowell matriz y colóquela sobre el cubreobjetos.
- Con el fin de asegurar que el chip no será capaz de moverse durante la formación de imágenes, el lugar de una o dos cubreobjetos de 20 mm x 20 mm sobre la parte superior del chip. Aplicar presión para empujar suavemente el chip a la parte inferior del plato.
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Representative Results
Un ejemplo de la aplicación del ensayo citolítico de alto rendimiento se demuestra en la Figura 2. Brevemente, etiquetado específico CD19-CAR + células T se co-incubaron con células diana marcadas ratón EL4 en los pocillos individuales de una matriz de nanowell (Secciones 1-5). Una imagen inicial se registró en el microscopio fluorescente automatizada para identificar la ocupación (efectores y / o metas) de todos y cada uno nanowell en la matriz (Sección 6). El procesamiento de imágenes se utilizó para identificar a todos los nanowells contienen exactamente un único objetivo y un único efector y excluir nanowells contienen objetivos muertos (Sección 9). El chip se transfirió a una incubadora durante 6 horas y luego una segunda imagen de la viruta se registró (Secciones 7-8). La capacidad de efector para inducir la apoptosis en las células diana se midió mediante tinción con anexina V, en nanowells que contienen exactamente un objetivo y un efector. Dos experimentos se llevaron a cabo en paralelo con los mismos efectores y dos juegos of células diana (EL4-CD19 + y CD19-EL4-(control negativo)) para determinar la frecuencia de antígenos específicos de lisis (Figura 2). Es deseable conseguir frecuencias bajas de no específica de lisis (~ 2-4%). La metodología es dependiente de la disponibilidad de las células diana apropiadas y experimentos paralelos se ejecutan para determinar la apoptosis en objetivos independientes de efectores. Altas frecuencias de apoptosis diana en ausencia de efectores durante el período de 6 h (> 8%) indica una necesidad de optimizar el cultivo y condiciones de ensayo. La matriz nanowell se puede adaptar para formación de imágenes de lapso de tiempo cuando se necesita supervisión continua (Película 1) y esto permite la observación de la conjugación efector-diana y posterior muerte celular.
Figura 1. A. Esquema de la matriz de ensayo basado en nanowell citolítica. Etiquetado CAR +Células T (azul) y las células objetivo (rojo) se incuban en una matriz de nanowells. Microscopía se utiliza para supervisar la citolisis mediada por efector objetivo. B. micrografías representativas compuestas de CD19 específico CAR + células T que inducen apoptosis en EL4-CD19 + células diana y los que no lo hacen.
Figura 2. Antígeno específico de la actividad citolítica de células CD19 + específicos de las células T CAR. Parcelas de células diana histograma de los pozos que contienen un efector único y un solo objetivo después de las 6 h de co-incubación. Histogramas emparejados de células diana sin efectores se muestran para informar de la frecuencia de la muerte celular de fondo.
Película 1. Time-lapse microscopía de CAR + T-cell citolisis mediada. CAR + células T (sin etiqueta) fueron co-incubadas con NALM-6-GFP células diana + (verde) en una nanowell y las imágenes fueron tomadas cada 2 minutos durante un total de 12 horas para permitir el monitoreo dinámico. Anexina V fue añadido al medio de cultivo y las células apoptóticas se vuelven marcado rojo.
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Discussion
Hemos esbozado el protocolo para un alto rendimiento de una sola célula ensayo citolítico habilitado a través de co-incubación de los efectores y metas en las matrices de nanowells (Figura 1). Además de rendimiento de una de las principales ventajas de la técnica es la capacidad de controlar efectora mediada por la citotoxicidad contra células diana deseadas sin la necesidad de la ingeniería de las células diana que a su vez permite el uso de células tumorales autólogas o apareadas / primaria como células diana. El confinamiento espacial permite la recuperación y posterior clonación de las células T funcionales al final del ensayo 9. Una limitación de este ensayo es la necesidad de microscopios especializados con etapas automatizadas y la óptica de conmutación rápida. Esto no es sin embargo una limitación seria dado que estas máquinas son ahora ampliamente disponible como parte de las instalaciones principales de investigación.
Hay una variedad de ensayos de citometría de flujo basados en que ofrecen un mayor rendimiento mientras preserving de una sola célula de resolución. Estos incluyen ensayos que se tiñen para el marcador sustituto de la degranulación (CD107a) o el contenido perforina en efectores y caspasa / granzimas actividad en las metas 13,14. Estos ensayos sin embargo no verdaderamente monitorizar efector-diana conjugación o la capacidad del efector para enganchar y matar múltiples objetivos. En comparación con el ensayo estándar de oro tal como un 4h ensayo de liberación de 51Cr, que funcionaba a E: T proporciones de 1:1, nuestra metodología típicamente informa el mismo número total de efectores citolíticos, mientras que todavía proporciona una sola célula de resolución. Aunque el protocolo descrito aquí sólo detalles sobre la citotoxicidad, tal como se describe previamente este ensayo se pueden combinar fácilmente con el ensayo microengraving para determinar las citocinas secretadas por las células efectoras individuales por ligación objetivo 9. Por tanto, es posible generar compuestos de perfiles funcionales de CAR + células T que combinan la citotoxicidad y la secreción de citoquinas a nivel de una sola célula.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número Award R01CA174385. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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