哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

Summary

ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴う

Abstract

真核生物では、分泌され、膜タンパク質は小胞体（ER）の表面に局在しているエンコードのメッセンジャーRNA（mRNA）のほとんど。しかし、これらのmRNAの可視化が困難な場合があります。これは、mRNAの一部のみがER関連のときは特にそうであり、この細胞小器官への分布は非標的（ すなわち "自由"）転写産物は妨害されます。同時に、ERの整合性を保ちながら、ER関連mRNAを監視するために、我々は、細胞が選択的に細胞膜をpermeabilizesジギトニン抽出溶液に短い露光で処理させる方法を開発し、したがって細胞質内容が削除されました。このメソッドはin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inと結合されているとき、1は明らかに蛍光顕微鏡で、ERに結合したmRNAを可視化することができます。このプロトコルを使用してバルク·ポリ（A）転写産物または特定のmRNAのいずれかのためにER-関連度を評価することができるさらに定量化した。プロセスでは、1は、mRNA-ERの相互作用の性質を調べるために、このアッセイを使用することができます。

Introduction

真核生物では、コードするmRNAは、翻訳時の^3,4リボソームとtransloconsの間の直接的な相互作用を介して分泌され、膜タンパク質は、共同翻訳シグナル認識粒子^1,2によってERに標的とすることができるし、ERに保持することができる。しかし、mRNAはごく最近まで不明であったリボソームや翻訳のいずれかの独立した小胞体に標的にし、維持することができるかどうかを指定します。これまでの研究では、細胞分画技術を用いて、ERでの翻訳に依存しないmRNAの関連があるかどうかを対処しようとしました。過酷な化学的条件は潜在的に繊細なmRNAの小胞体関連が中断される可能性があり、ER由来の小胞から、リボソームの関連付けを解除する必要がありましたので、これらの研究では^、5月8日のための証拠を提供する、決定的なものではなかったと^9,10に対してリボソーム依存しないmRNAのERへのアンカリング。

これらの問題を回避するために、我々はprotoを開発しました小胞体に結合したmRNAを単離すると、画像にCOL。この手順では、同時に、ER形態とその関連分子のすべてを保持しながら、効果的に細胞（非小胞体に結合したmRNAを含む）のすべての細胞質のコンテンツを削除し、軽度抽出処理を伴う。このプロトコルを使用して私たちは、mRNAのサブセットを対象としており、その後、リボソームまたは翻訳を¹¹の独立して、ERに保持されていることを実証した。

Protocol

1。抽出のための材料の調製

1. 細胞の調製
   1. 実験する前に、少なくとも1日に酸処理されたカバースリップ上種子組織培養細胞。我々は、これらの2つの細胞株が分泌されたタンパク質の強固な生産を示す限り、COS-7またはU2OSを使用し、よく定義されたERを持っています。高い抽出効率を達成するために、細胞は実験の日にカバースリップ上で80％コンフルエントを超えてはならないことに注意してください。
   2. 特に外因性のmRNAが検討されている場合には、細胞は、標準的なトランスフェクションプロトコールを用いて目的の遺伝子を含むプラスミドで播種後1日目にトランスフェクトする。次に、細胞を抽出する前に少なくとも18時間のためのmRNAを発現するように許可されています。
2. 翻訳阻害剤で細胞を処理
   1. ERでのmRNAの関連のメンテナンスにそのままリボソームの効果をテストするために、細胞の関連を混乱させる翻訳阻害剤で治療することができますmRNAは¹¹とリボソームの。
   2. （4 -メチル-2,6 - dinitroanilino） - -などhomoharringtonin（HHT）、pactamycin、または2と翻訳開始の阻害剤、同時にに従事してリボソームを可能にしながら、N-メチルプロピオンアミド（MDMP）は、トランスクリプトとの関連付けから新しいリボソームを防ぐ^12月14日翻訳^を完了^します 。哺乳動物細胞における最もタンパク質の翻訳速度に関係なく、コドン使用頻度またはmRNAの長さ¹⁵の、1秒あたり5個のアミノ酸であるため、30分の治療は27,000ヌクレオチド（タンパク質をコードする限り、オープンリーディングフレームを持つメッセージのリボソームをオフにクリアする必要があります）9000アミノ酸である限り。
   3. そのような阻害剤は、ピューロマイシンとして新生鎖の早期の排出を促進し、こうしてポリソーム^12を破壊^する 。しかし完全にmRNAとピューロ処理リボソームの関連付けを破壊するために、EDTAなどのキレート剤はマグネシウムジギトニン抽出バッファ¹¹に追加する必要があります。
   <liは>この実験では、細胞を200μMのピューロマイシン、5μMのHHT、または抽出前に30分間コントロール培地で処理される。
3. ジギトニンのExtraction Bufferの調製。フリー（ すなわち細胞質、非ER関連）の転写産物の障害なく、ERに局在するmRNAを可視化するために、我々は選択的にジギトニン、3β-hydroxysterolsと優先的に相互作用するステロイド配糖体を持つ細胞を透過性。低濃度では、ジギトニンは選択'漏出^16'を引き起こし、細胞膜の部分をpermeabilizes。これとは対照的に、コレステロールの貧しい小胞体膜と核膜は^、16,17そのまま残されます。
   1. ジギトニン（シグマアルドリッチ）粉末を5％重量/体積の蒸留水に溶解し、この原液を、小さなボリュームに分注し、-20℃で保存されている我々の経験では、融解後の再凍結は、溶解ジギトニンの効率を低下させる。
   2. の原液10倍のCHOバッファー（1Xワーキング溶液濃度：115ミリメートルのKAc、25mMのHEPES緩衝液pH7.4、2.5mMのMgCl _2、2mMのEGTA、150 mMスクロース）はRNaseフリーの試薬 ​​を用いて調製し、-20℃で保存されている作業溶液（1倍CHOバッファ）RNaseフリー水で原液を希釈することにより調製される、4℃で保存することができます

2。ジギトニン抽出

1. 抽出溶液を準備する
   1. 平坦な表面を有する加熱ブロックは、予備加熱40℃ですと抽出中にこの温度で​​維持した。
   2. RNaseフリーである平らな作業面を形成するためには、加熱ブロックは、パラフィルムM（ビーミスCompany、Inc）を新鮮な部分でいくつかの水と重なって湿らせる。パラフィルムシートおよび加熱ブロックの間に気泡がRNaseフリーの手袋やキムワイプ（VWR）を用いて平滑化される。
   3. 1X CHOバッファを水浴中でインキュベートすることにより、37℃に加温する。
   4. 6ウェルプレートを洗浄するために使用されそして細胞を固定。 3ウェルの各行は、1つのカバースリップのために使用されます。行の最初の2ウェルに、温められたCHO緩衝液2 mlを加えています。最後のウェルに、固定液（PBS + 4％パラホルムアルデヒド（電子顕微鏡学））2mlを追加されます。細胞は、抽出のための準備が整うまで、このトレイは、37℃のインキュベータに格納することができます。
   5. ジギトニン抽出液を使用直前に暖かいCHOバッファーで0.025％の株式ジギトニン溶液を希釈することにより調製される。もう一度ピューロ処理した細胞では、抽出用緩衝液は、さらに効率的にリボソーム^11を破壊するために20mMのEDTAを含まなければならないことに注意してください。抽出溶液100μlの滴は抽出直前にパラフィルムで覆われた加熱ブロックに配置されます。
2. ジギトニン抽出と細胞固定
   1. 37℃インキュベーターからセルを削除します。
   2. 抽出プロセスの実行中に、カバースリップをjewlerの鉗子の助けを借りて操作されます。ととも​​に鉗子は、カバーグラスをピックアップし、増殖培地の洗浄するだけでなく含有する第二の最初とCHOバッファにそれを浸し。
   3. 迅速キムワイプでカバースリップの裏側オフ過剰バッファリングをオフにしみ、直ちに抽出溶液に、下向きにカバースリップ、セル側に配置します。
   4. 10秒後、ピンセットでカバーガラスを拾うとすぐに電池側はよく入った、4％パラホルムアルデヒド固定バッファに、上向きにし、それを転送します。
   5. 室温で少なくとも15分間固定でサンプルインキュベートしてみましょう。
3. 未抽出コントロール細胞の調製。細胞質内のmRNAの総量を決定するために、それが未抽出コントロールサンプルを準備することをお勧めします。
   1. カバースリップ上で培養した細胞はジギトニン抽出工程（2.2.3）がスキップされることを除いて、（セクション2.2を見てください）​​上記のように調製されています。
   2. 固定後、非抽出された細胞をPBS +0.1％Tritonで透過処理する必要がX-100で室温で15分間インキュベートした。

3。 FISH染色

1. 蛍光 in situハイブリダイゼーションのためのプローブを設計
   1. 利害のmRNAの一次配列は、RNAstructure 5.0 ¹⁸などのRNA二次構造予測ソフトウェアを使用して折り返されている。 mRNAの折り畳みが視覚的に主要な二次構造の自由である約50ヌクレオチドの領域を識別するために評価される。
   2. この領域の逆相補は、プローブの5 '末端（統合DNA Technologiesから購入）に取り付けられたAlexa546蛍光体で合成される。
   3. プローブは-20℃で保存することができ、100μMのストック濃度にRNaseフリー水で希釈して
2. FISHプローブによる染色
   1. ただしジギトニン抽出した細胞が0.1％2mlのトリトンX-100で希釈し、これらの固定サンプルを処理、さらに透過処理を必要としないことに注意してくださいPBSは、FISH染色の前に室温で15分間、バックグラウンド信号を低減するのに役立ちます。
   2. 次いで、スライドを任意の残留ホルムアルデヒドまたはTriton X-100を削除するには、PBSで2回洗浄する。
   3. 次に、細胞を1Xクエン酸ナトリウム緩衝液（150mM NaClおよび15mMクエン酸ナトリウム）で25％〜60％ホルムアミドで2回洗浄する。一般的には、長さが50から60ヌクレオチドである特定のFISHプローブ、60％ホルムアミドが使用されますが、オリゴ（dT）FISHプローブを用いた染色ポリ（A）mRNAについて、ホルムアミドのレベルは25％にまで低減されています。
   4. 染色槽を準備するには、150ミリメートルペトリ皿の底は水でおおわれているとパラフィルム片を水に浮かべています。水はこのようにパラフィルムが皿の底に付着することができ、皿を裏返すことによって除去される。気泡が手動でキムワイプで除去される。
   5. 各カバースリップが染色されるためには、額面上に関心のFISHプローブを含むハイブリダイゼーション溶液100μlドロップをピペット染色チャンバー内afilm。在庫FISHプローブはの作業濃度にハイブリダイゼーション緩衝液で25％〜60％ホルムアミド（1×SSCは、100 mg / mlの硫酸デキストラン、1 mg / mlの酵母tRNA、5mMのバナジルリボシド複雑な、25から60パーセントホルムアミド）で希釈し、 0.2μMで。ホルムアミドの量が使用されている特定のプローブに最適化されており（ステップ3.3.3を参照）SSCの洗浄緩衝液と同じ濃度で存在すべきであることに注意してください。
   6. カバースリップは、このような組織培養インキュベーターとして加湿チャンバーに37℃で染色室で魚の溶液上にセル側に前面を下にして置き、5から24時間インキュベートする。
3. 染色サンプルを洗浄し、取付
   1. RNaseフリーウォッシングエリアを準備するには、そのような実験台として、レベル、平らな面にパラフィルムのストリップを敷設。レベルの表面ぬれた、パラフィルムが平らであることを確認するには、上にパラフィルムを配置して、手動でキムワイプで任意の気泡を除去する。
   2. 染色室ですインキュベーターから取り出し、平らな平らな場所に置いた。カバーガラスは、その後、それぞれのカバースリップの端の近くに魚の洗浄緩衝液約500μlのピペッティングして浮いています。溶液は毛細管作用を介して、カバーガラスとの間にパラフィルムで、描画されます。
   3. 各カバースリップでは、洗浄緩衝液1ml（1×SCCの25から60パーセントのホルムアミドで、3.3.3のステップを参照してください）​​は、洗い場のパラフィルム（ステップ3.4.1を参照）にピペッティングしています。
   4. ピンセットを用いて、カバーガラスを染色室から除去され、それぞれを洗浄緩衝液滴の上に置かれており、室温で5分間インキュベートした。洗浄工程を3回繰り返す。
   5. スライドガラスを70％エタノールで洗浄し、キムワイプで乾燥させる。
   6. 各カバースリップについては、マウントソリューション（DAPI Fluoromount™をG、南部Biotech）の25μlをスライドに分注される。このソリューションは、4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）、汚れのDNAが含まれており、核の可視化を可能にすることに注意してください。
   7. USIngの鉗子とキムワイプ、カバースリップの背中を乾燥させ、余分な魚の洗浄緩衝液は、試料を乾燥させずにオフにブロットする。各カバースリップはその後マウンティング溶液の液滴の上に、下に向けてセル側に配置されている。
   8. マウントされたサンプルは、標識されており、4℃で保存することができます

4。イメージングと定量

1. イメージング
   1. 落射蛍光顕微鏡をFISH染色後の画像にセルを使用されています。トランスフェクトされた細胞は、適切なチャネルで明るい蛍光シグナルによってトランスフェクト細胞から分化することができます。理想的には、取得した各フィールドには、定量化のためのバックグラウンド蛍光を決定するために使用するトランスフェクトしていないセルが含まれています。
   2. 各フィールドの魚およびDAPIチャンネルの画像が得られる。また、細胞はタンパク質マーカーと共染色されている場合は、免疫蛍光チャンネルの画像も取得されています。ジギトニン抽出を使用することもできることに注意してください小胞体に結合したリボソームとタンパク質^11を可視化する。
   3. フィールド間の蛍光強度を比較することができるようにするには、各チャネルの露光時間は、実験の各セットに一定のままで残っているはずです。
   4. 再び別のカバースリップ上の細胞との間の蛍光強度を比較することができることを保証するために、魚の信号でepiluminescence強度や崩壊での日々の変化は、イメージング、単一一気にカバースリップのすべてをすることによって最小化されるべきである。
2. 定量。小胞体に局在するmRNAの量を定量化するために、我々は、 ニコンのNIS要素ソフトウェアを使用しています。しかし、このようなImageJのような他の画像解析ソフトを使用することができます。
   1. ニコンのNIS要素画像解析ツールを使用して、細胞周囲と核が興味（ROIの）の別々の領域として概説されています。
   2. 各ROI、蛍光強度（I _T総細胞強度のためと私は_Nのために核の強度）と領域_（Tと_N）を記録し、Excelスプレッドシートにエクスポートされます。
   3. 各画像は、バックグラウンド蛍光強度（I _B）は 、非トランスフェクトされた細胞の強度を記録することによって決定される。ポリ（A）mRNAレベルが分析されている場合は、セルの空き領域が選択されています。
   4. 合計ERの量（抽出した細胞）または細胞質（未抽出細胞）の蛍光は式で計算されます。
      _[A、T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. 核の染色強度も計算し、様々なトリートメントの間の内部コントロールとして使用することができます。核はジギトニン処理¹⁷またはリボソーム混乱¹¹には影響されませんので、核のmRNAの量は、これらの治療法のそれぞれの間に一定のままで残るべきです。核蛍光を計算するには、次の式が使用されます。
      _[A、N] [I _N - IB]
   6. ER-標的である細胞質mRNAの30から40％が未抽出細胞から細胞質の平均蛍光で割った30から40抽出した細胞の平均的なERの蛍光（4.2.4参照）を取ることによって計算することができます（再度4.2.4を参照） 。それが抽出され、未抽出細胞が調製染色し、並行して画像化されることが重要です。

Representative Results

ER関連であるmRNAの割合を決定するために、 胎盤アルカリホスファターゼ（ALPP）またはシトクロムP450-8B1（CYP8B1）が含まれていたプラスミドでトランスフェクトしたCOS-7細胞のいずれかジギトニンで抽出した後、固定、または直接修正されました（ 図1を参照して、比較する"Ctrlキーを抽出された"には"Ctrlキーを押しながら未抽出"）。非核保有蛍光が両方のサンプルで定量し、ER関連するmRNAの一部は（ 図2）を算出した。我々のデータは明らかにALPPとCYP8B1の両方に対して、細胞質mRNAの約60％がERに関連付けられていることを示しています。これらのmRNAの両方が、ER内腔で処理されたタンパク質をエンコードするので、我々の結果は、このようなmRNAは小胞体の表面に換算されているという考えと一致している。

リボソーム解離した後、これらの転写産物のER-関連を監視するには、トランスフェクトされたCOS-7細胞はtrあっ次に、抽出され固定されており、各mRNA（代表画像については、図3を参照して、ER-と核関連のmRNAの定量化のために、 図1を参照）に対する特異的FISHプローブを用いて染色し、30分間コントロールメディア、ピューロマイシンまたはHHTとeated。リボソームは、ピューロマイシンまたはHHT（ 図2-3）で分解された後にのみALPPはなく、CYP8B1 mRNAは、ERの上で維持されることに注意してください。重要なのは核のmRNAのレベルは、mRNA（ 図3）のいずれかのために色々処理されたサンプル間で変更されませんでした。この定数は核FISH信号はER分数の蛍光強度の変化は、mRNA発現またはFISH染色のばらつきの変化によるものではないことを示しています。

これらの結果から、我々はそのようなALPP転写産物として、ER標的mRNAは、、のサブセットが解体した後に、この細胞小器官リボソームの表面に維持されていると結論付けている。

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図1 ALPPはなく、CYP8B1 mRNAがリボソームと翻訳の独立して、ERに関連付けられたままになります。COS-7細胞をどちらALPP（上段）、またはCYP8B1（下の行）遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトするためのmRNAを発現させた18から24時間。次いで、細胞を、30分間、DMSOコントロール培地（ "Ctrlキー"）、ピューロマイシン（ "ピューロ"）またはHHTで処理した。細胞を、直接固定（ "未抽出"）または最初の固定次に抽出された。コントロールとHHT処理細胞をジギトニン単独で抽出しておりましたが、Puroの処理された細胞はジギトニンとEDTAを用いて抽出したことに注意してください。細胞は、特定のFISHプローブを用いてmRNAを染色し、画像化した。スケールバー=20μmである。

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図2。 ALPPとCYP8B1 mRNAのためのER-結社のレベルの定量化。トランスフェクトしたCOS-7細胞を直接的に細胞質内のmRNAの総レベルを決定するために固定します （ 図1を参照、セル"Ctrlを未抽出"）、または最初に抽出してから、修正されましたER関連するmRNA（ 図1を参照して、細胞が"Ctrlキーを抽出"）の量を決定する。実験ごとに30から40抽出した細胞の平均ER関連蛍光は、ERに結合したmRNAを（y軸 ）の画分を得、30〜40未抽出細胞の平均細胞蛍光で割った。各バーは平均値と3つの独立した実験の標準誤差を表す。

図3。 ER-ASSOの定量ALPPとリボソームの解離後のCYP8B1 mRNAのciation。トランスフェクトしたCOS-7細胞（ 図1、 "抽出"のセルを参照してください）特定のFISHプローブ、画像化を用いたmRNAのステンド、固定、抽出された、コントロール培地または様々な翻訳阻害剤で処理した。 ERおよび核内mRNAの蛍光強度を定量した。各バーは、3つの独立した実験の背景と対照処理細胞（y軸）のERでの蛍光に正規化された30以上のセルの平均積分強度から成るそれぞれの平均値と標準誤差を表す。リボソーム混乱がERから解離するCYP8B1 mRNAを引き起こしているが、核内mRNAのレベルは影響を受けなかったことに注意してください。

Discussion

様々な細胞内のサイトへのmRNAの局在化は、mRNA局在タンパク質と転写産物の相互作用を介して、細胞内のローカルな要件への彼らの最終目的地へのタンパク質が適切にソートするため、遺伝子発現の微調整のための重要な広範な現象である地域^19,20。

ここに記載のアッセイを用いて、我々は、分泌タンパク質をコードするmRNAがリボソームや翻訳の存在下または非存在下で、ERで維持できるかどうかの質問を再訪。実際、我々はこれらのmRNAのサブセットが、この活動^11を持っ^ていること^がわかった。たとえば、この抽出プロトコルを使用して、我々はALPPとCYP8B1 mRNAの両方が制御におけるERの表面処理されたCOS-7細胞（ 図1-2）に局在していることが判明しました。しかし、翻訳阻害ピューロまたはHHT、ALPPだけではなく、CYP8B1 mRNAで細胞を処理した後、機能的なリボソームと翻訳（ 図1、図3）の非存在下におけるERに関連付けられたままであった。加えて、我々は以前にALPP mRNAが pactamycin ¹¹で処理されたCOS-7細胞ではER関連ままであることがわかった。これらの様々な治療法は、関連リボソームのmRNAをクリアするために発散メカニズムを介して作用するので、ALPPのER-協会は、任意の特定の薬剤に対するいくつかの間接的な細胞応答の結果であることはあまりありません。これらの翻訳阻害剤が有効であることを確認するために、それは彼らが^、35 S-メチオニンを新たに合成されたタンパク質への取り込みを阻害するかどうかをテストするためにも役立ちます。例えば、私たちはMDMP処理（100μM、15分間）は、COS-7細胞内のすべてのタンパク質合成（XA崔とAFパラッツォ、未発表の観察）の40〜60％を阻害することができることを見出した。結果として、この薬は効率的にターゲティングおよびメンテナンスのための翻訳を必要とするmRNAの小胞体局在化を妨害することはありません（XAの崔とAFパラッツォ、未発表の観察）。

それは細胞質タンパク質をコードしているように、さらにそのmRNAの小胞体標的化された符号化信号配列又は膜貫通ドメインに依存していないことを確認するためには、外因性のトランスクリプトを変更することができます。実際、我々は以前に、シグナル配列及びコード領域を貫通両方を欠いALPP mRNAのバージョンがまだ¹¹のERに局在することが可能であることを実証した。

また、mRNAの核外輸送^21を分析するために使用する他のアッセイと組み合わせるとここに示す方法は、表面への核から別のもの（ 例えば 、ある区画からのmRNAの輸送の動態や要件を定義するために使用できることに注意する価値がありますER）。確かに、翻訳阻害剤で前処理したCOS-7細胞の核内にALPP遺伝子を含むプラスミドをマイクロインジェクションすることによって、我々は、以前にその新たに作られたALPPを実証mRNAは独立して翻訳やリボソーム協会¹¹のERをターゲットにしています。

我々は完全にこれらのmRNAを標的とERに固定されている方法を理解していないが、このオルガネラがmRNA受容体が含まれている可能性があります。確かに我々は最近、翻訳¹¹の独立して、ERで維持されるべきALPP mRNAの能力のために必要されているものとして、P180、大きなプラスに帯電した膜結合タンパク質を同定した。しかし、それは他のmRNA受容体がER ¹¹の表面上に存在しなければならない可能性があります。ここで概説技術の助けを借りて、我々は、哺乳類細胞におけるmRNA局在の調整を助ける分子メカニズムの多くを識別し、解剖したいと考えています。