Visualisering af endoplasmatiske reticulum lokaliserede mRNA'er i pattedyrceller

Summary

Her beskriver vi en metode til at synliggøre endoplasmatiske reticulum-associerede mRNA'er i mammale vævskulturceller. Denne teknik involverer selektiv permeabilisering af plasmamembranen med digitonin til fjernelse af cytoplasmatisk indhold efterfulgt af fluorescerende

Abstract

I eukaryoter. Fleste af messenger RNA'er (mRNA'er), der koder for secernerede og membran-proteiner er lokaliseret til overfladen af ​​det endoplasmatiske reticulum (ER) Dog kan visualiseringen af ​​disse mRNA'er være udfordrende. Dette er især tilfældet, når kun en brøkdel af mRNA'en er ER-associeret og deres fordeling til dette organel hindres af ikke-målet (dvs. "fri") transkripter. For at overvåge ER-associerede mRNA'er, har vi udviklet en fremgangsmåde, hvor celler behandles med en kort eksponering for en digitonin ekstraktionsmiddel, der selektivt permeabilizes plasmamembranen, og således fjerner de cytoplasmatiske indhold, at man samtidig opretholder integriteten af ​​ER . Når denne metode kombineres med fluorescerende in situ hybridisering (FISH), kan man tydeligt visualisere ER-bundne mRNA'er ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Brug af denne protokol graden af ​​ER-forening for enten bulk-poly (A) udskrifter eller specifikke mRNA'er kan vurderesog endog kvantificeres. Ved fremgangsmåden kan man anvende dette assay til at undersøge karakteren af ​​mRNA-ER-interaktioner.

Introduction

I eukaryoter secerneret mRNA kodende og membranproteiner kan målrettes til ER co-translationelt ved signalgenkendelse partikel ^1,2 og kan opretholdes på ER via direkte interaktioner mellem ribosomer og translocons under oversættelsen ^3,4. Men hvorvidt mRNA'er kan målrettes og vedligeholdes på skadestuen uafhængig af enten ribosomer eller oversættelser var uklar indtil for ganske nylig. Tidligere undersøgelser har forsøgt at løse, om der er translation-uafhængig mRNA samarbejde med ER via et trådløst fraktioneringsteknikker. Fordi barske kemiske betingelser skulle adskille ribosomer fra ER afledte vesikler, som vil kunne skabe potentielt følsomme mRNA-ER forening, disse undersøgelser var inkonklusive, der beviser for ^5-8 og imod ^9,10 ribosomal-uafhængig forankring af mRNA til ER .

At omgå disse problemer har vi udviklet en protocol at isolere og billedet ER-bundne mRNA'er. Denne procedure indebærer en mild ekstraktionsbehandling, der effektivt fjerner al den cytoplasmiske indhold af cellen (herunder ikke ER-bundne mRNA'er) samtidig bevare ER-morfologi og alle dertil hørende molekyler. Under anvendelse af denne protokol, har vi vist, at en delmængde af mRNA'er målrettes og derefter holdt på ER uafhængigt af ribosomer eller oversættelse ^11.

Protocol

1. Forberedelse af Materialer til Extraction

1. Fremstilling af celler
   1. Seed vævskulturceller på syrebehandlede dækglas i mindst en dag før forsøget. Vi bruger COS-7 eller U2OS, da disse to cellelinjer udviser robust produktion af udskilt protein og har et veldefineret ER. Bemærk, at for at opnå høj ekstraktionseffektivitet, må cellerne ikke overstige 80% konfluens på dækglasset på dagen for forsøget.
   2. Hvis en bestemt eksogent mRNA bliver undersøgt, bliver cellerne transficeret én dag efter podning med plasmider indeholdende genet af interesse ved anvendelse af standard transfektionsprotokoller. Cellerne får derefter lov til at udtrykke mRNA i mindst 18 timer før ekstraktion.
2. Behandling af cellerne med translationsinhibitorer
   1. For at teste virkningen af ​​intakte ribosomer om opretholdelse af mRNA'er tilknytning til ER kan celler behandlet med translationsinhibitorer, der forstyrrer foreningenaf ribosomer med mRNA ^11.
   2. Inhibitorer af translationsinitiering, såsom homoharringtonin (HHT), pactamycin, eller 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamid (MDMP), forhindrer nye ribosomer fra associere med transkriptet samtidig tillader engageret ribosomer til komplet oversættelse ^12-14. Eftersom translation pris på de fleste proteiner i pattedyrceller, er 5 aminosyrer i sekundet, uanset kodonanvendelse eller mRNA længde ^15, skal en behandling på 30 min klare ribosomer ud af meddelelser med åbne læserammer, så længe 27.000 nukleotider (som koder for proteiner så længe 9000 aminosyrer).
   3. Inhibitorer, såsom puromycin fremme tidlig udstødning af den vordende kæde, og dermed forstyrre polysomer ^12. Men til kuldkaster associeringen af puromycin-behandlede ribosomer med mRNA, skal magnesium chelatorer, såsom EDTA sættes til digitonin ekstraktionspuffer ^11.
   <li> I dette eksperiment blev celler behandlet med 200 uM puromycin, 5 uM HHT, eller kontrolmedium i 30 minutter før ekstraktion.
3. Fremstilling af Digitonin Extraction Buffer. At visualisere ER-lokaliserede mRNA'er uden hindring af frie (dvs. cytoplasmatiske, ikke-ER-associerede transkripter), vi selektivt permeabilisere cellen med digitonin, et steroid glycosid, som fortrinsvis interagerer med 3β-hydroxysterols. Ved lave koncentrationer, selektivt digitonin permeabilizes dele af plasmamembranen, hvilket bevirker 'utætheder' ^16. I modsætning hertil er ER-membranen og nuklear kuvert, der er fattige i kolesterol, venstre intakt ^16,17.
   1. Digitonin (Sigma Aldrich) Pulveret opløses i destilleret vand ved 5% vægt / volumen, og denne stamopløsning alikvoteret i små mængder og opbevaret i -20 ° C. Det er vores erfaring, falder flere fryse-tø cykler effektivitet opløst digitonin.
   2. En stamopløsning af10x CHO-puffer (1x arbejdsopløsning koncentration: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 _mM MgCl2, 2 mM EGTA og 150 mM saccharose) fremstilles med RNase-fri reagenser og opbevaret ved -20 ° C. En arbejdsopløsning (1x CHO-buffer) fremstilles ved at fortynde stamopløsningen med RNase-frit vand og kan opbevares ved 4 ° C.

2. Digitonin Extraction

1. Forberedelse ekstraktionsopløsningen
   1. En varmeblok med en flad overflade, er forvarmet til 40 ° C og holdt ved denne temperatur i løbet af ekstraktionen.
   2. At danne en flad arbejdsflade, der er RNase free, er varmeblokken fugtet med lidt vand og overlejret med et frisk stykke parafilm M (Bemis Company, Inc). Luftbobler mellem parafilm plader og varmeblokken glattes ud med RNase-fri handsker og Kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO-puffer opvarmes til 37 ° C ved inkubation i et vandbad.
   4. 6-brønds plader anvendes til at vaskeog fikseres cellerne. Hver række af tre brønde anvendes til det ene dækglas. Til de to første brønde i rækken, er 2 ml med varm CHO buffer tilsat. Til den sidste brønd, (PBS + 4% paraformaldehyd (elektronmikroskop Sciences)) 2 ml af fikseringen tilsættes. Denne bakke kan opbevares i 37 ° C inkubator indtil cellerne er klar til ekstraktion.
   5. Digitonin ekstraktion opløsning fremstilles ved at fortynde den bestand digitonin opløsningen til 0,025% med varm CHO buffer lige før anvendelse. Noter at for puromycin-behandlede celler, skal ekstraktionspuffer yderligere indeholde 20 mM EDTA til effektivt at afbryde ribosomer ^11. Dråber af 100 pi af ekstraktionsopløsningen er anbragt på parafilm-dækket varmeblok umiddelbart før ekstraktion.
2. Digitonin Udvinding og Cell Fixation
   1. Fjernelse af cellerne fra 37 ° C inkubator.
   2. Under ekstraktionsprocessen, er dækglas manipuleres ved hjælp af jewler s pincet. Medtangen løfte dækglasset og dyp det i den første og derefter den anden brønd indeholdende CHO-puffer for at vaske af vækstmediet.
   3. Hurtigt skamplet overskydende buffer fra bagsiden af ​​dækglasset med en Kimwipe og umiddelbart placere dækglasset, cell nedad, på ekstraktionsopløsning.
   4. Efter 10 sek, afhente dækglasset med pincet og straks overføre det, celle opad, til brønden indeholder 4% paraformaldehyd fastsættelse buffer.
   5. Lad prøven inkuberes i fiksativ i mindst 15 minutter ved stuetemperatur.
3. Fremstilling af Unextracted kontrolceller. For at bestemme den totale mængde af mRNA i cytoplasmaet er det en god ide at fremstille en unextracted kontrolprøve.
   1. Celler dyrkes på dækglas fremstilles som ovenfor (se afsnit 2,2), bortset fra, at digitonin ekstraktionstrinet (2.2.3) springes over.
   2. Efter fiksering, behøver de ikke-ekstraherede celler, der skal permeabiliseres i PBS + 0,1% TritonX-100 i 15 minutter ved stuetemperatur.

3. FISH farvning

1. Designe prober til fluorescens in situ hybridisering
   1. Den primære sekvens af mRNA'en af interesse er foldet ved hjælp af sekundær RNA-struktur forudsigelse software, såsom RNAstructure 5,0 ^18. MRNA folderne er vurderet visuelt at identificere en region på ca 50 nukleotider der er fri for væsentlige sekundære strukturer.
   2. Det reverse komplement af denne region syntetiseres med en Alexa546 fluorofor bundet til 5'-enden af ​​proben (købt hos Integrated DNA Technologies).
   3. Proben fortyndes med RNase-frit vand til en stamkoncentration på 100 uM, som kan opbevares ved -20 ° C.
2. Farvning med fisk sonder
   1. Bemærk, at selv om de digitonin-ekstraherede celler ikke kræver yderligere permeabilisering, behandling af disse faste prøver med 2 ml 0,1% Triton X-100 fortyndet iPBS i 15 minutter ved stuetemperatur før FISH farvning, bidrager til at reducere baggrundssignal.
   2. Objektglassene vaskes derefter to gange med PBS for at fjerne eventuelle paraformaldehyd eller Triton X-100.
   3. Cellerne vaskes derefter to gange med 25% til 60% formamid i 1X natriumcitratpuffer (150 mM NaCI og 15 mM natriumcitrat). Generelt til specifikke FISH-prober, som er 50 til 60 nukleotider i længde, er 60% formamid anvendes, men for poly (A) mRNA farvning med oligo (dT) FISH-proben, er niveauet af formamid reduceres til 25%.
   4. Til fremstilling af farvningen kammeret, bunden af ​​en 150 mm petriskål dækket af vand og et stykke parafilm er flød på vand. Vandet fjernes ved at dreje skålen over, hvilket således tillader parafilm at klæbe til bunden af ​​skålen. Luftbobler fjernes manuelt med Kimwipes.
   5. For hver dækglas der skal farves, pipetteres en 100 ul dråbe af hybridiseringsopløsning indeholdende FISH sonde af interesse på pariAFILM i farvningen kammeret. Bestanden FISH-proben fortyndes med 25% til 60% formamid i hybridiserings-puffer (1 x SSC, 100 mg / ml dextransulfat, 1 mg / ml gær-tRNA, 5 mM vanadyl-ribosid kompleks, 25-60% formamid) til en arbejdskoncentration på 0,2 uM. Bemærk, at mængden af ​​formamid bør optimeres for den særlige sonde, der anvendes og er til stede i samme koncentration som i SSC vaskepuffer (se trin 3.3.3).
   6. Dækglasset placeres cellesiden nedad på FISH opløsning i farvningen kammeret og inkuberet i 5-24 timer ved 37 ° C i et fugtigt kammer, såsom vævsdyrkningsinkubator.
3. Vask og montering af de farvede prøver
   1. Til fremstilling af en RNase fri vask område, fastsætte en strimmel parafilm på et niveau flad overflade, såsom en lab bænk. For at sikre at parafilm er flad, våd plan overflade, skal du placere parafilm på toppen og manuelt fjerne eventuelle luftbobler med Kimwipes.
   2. Farvningen kammeret erfjernet fra inkubatoren og anbragt på en flad vandret overflade. Dækglassene derefter flød ved pipettering cirka 500 pi FISH vaskebuffer nær kanten af ​​hvert dækglas. Løsningen vil blive trukket i-mellem dækglasset og parafilm via kapillarvirkning.
   3. For hvert dækglas, er 1 ml vaskebuffer (1 x SCC med 25-60% formamid, trin 3.3.3 se) pipetteret på vaskeområdet parafilm (se trin 3.4.1).
   4. Ved hjælp af en pincet, der dækglassene fjernet fra farvning kammeret og hver anbringes på dråben af ​​vaskepuffer og inkuberet ved stuetemperatur i 5 min. Vaskeprocessen gentages 3 gange.
   5. Objektglas vasket med 70% ethanol og tørret med Kimwipes.
   6. For hver dækglas, 25 pi monteringsløsning (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) pipetteret på diaset. Bemærk, at denne opløsning indeholder 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), der farver DNA og tillader visualisering af kerner.
   7. Using pincet og Kimwipes, er bagsiden af ​​dækglasset tørret og overskydende FISH vaskepuffer er blottet ud uden tørring af prøven. Hvert dækglas anbringes derefter celle nedad, på dråbe monteringsløsning.
   8. Monterede prøver er derefter mærket og kan opbevares ved 4 ° C.

4. Billedbehandling og Kvantificering

1. Imaging
   1. Et epifluorescensmikroskop anvendes til afbildning af celler efter FISH farvning. Den transficerede celle kan skelnes fra ikke-transficerede celler ved lyse fluorescenssignal i den rigtige kanal. Ideelt vil hver erhvervet felt også indeholde en ikke-transfekteret celle, der skal anvendes til bestemmelse af baggrundsfluorescens til kvantificering.
   2. For hvert felt billeder af FISH og DAPI kanal er anskaffet. Endvidere, hvis cellerne co-farvet med proteinmarkører er et billede af immunofluorescens kanal også erhverves. Bemærk, at digitonin ekstraktion også kan anvendesat visualisere ER-bundne ribosomer og proteiner ^11.
   3. For at sikre at fluorescensintensiteterne mellem felter kan sammenlignes, bør eksponeringstiden for hver kanal forblive konstant for hvert sæt forsøg.
   4. Igen for at sikre, at de fluorescerende intensiteter mellem celler på forskellige dækglas kan sammenlignes, bør dag til dag ændringer i epiluminescence intensitet eller henfald i FISH signal minimeres ved billeddannelse alle dækglassene i et enkelt møde.
2. Kvantificering. For at kvantificere mængden af mRNA, der er lokaliseret på ER, bruger vi Nikon NIS Element software. Men andre billedanalysesoftware såsom ImageJ kan anvendes.
   1. Brug af Nikon NIS ELEMENT billede analyseværktøj, der cellen periferien og kernen skitseret som separat Region Interesser (ROI'er).
   2. For hver ROI, fluorescensintensiteten (I _T for den samlede celle intensitet og jeg _N fornuklear intensitet) og området (A _T og A _N) registreres og eksporteres til et Excel-regneark.
   3. For hvert billede, er baggrunden fluorescensintensitet (I _B) bestemt ved registrering af intensiteten af en ikke-transfekteret celle. Hvis poly (A) mRNA-niveauer bliver analyseret, er en cellefri, der vælges.
   4. Den totale mængde af ER (i udtrukne celler) eller cytoplasmatisk (i unextracted celler) fluorescens beregnes efter formlen:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. Den nukleare farvningsintensitet kan også beregnes og anvendes som intern kontrol mellem forskellige behandlinger. Da kerner ikke påvirkes af digitonin behandling ¹⁷ eller ribosom afbrydelse ^11, bør mængden af nukleare mRNA forblive konstant mellem hver af disse behandlinger. Sådan beregnes nuklear fluorescens følgende formel anvendes:
      [A _N] [I _N - jegB]
   6. Procentdelen af ​​cytoplasmatisk mRNA, der er ER-målrettet kan beregnes ved at tage gennemsnittet ER fluorescens på 30-40 ekstraherede celler (se 4.2.4) divideret med den gennemsnitlige cytoplasmatiske fluorescens 30-40 unextracted celler (igen se 4.2.4) . Det er kritisk, at de ekstraherede og unextracted celler fremstilles, farves og afbildes parallelt.

Representative Results

At bestemme procentdelen af mRNA, der er ER-associeret, COS-7-celler, der var transficeret med plasmider, der indeholdt placental alkalisk phosphatase (ALPP) eller cytochrom P450-8B1 (CYP8B1) blev enten ekstraheret med digitonin og derefter fikseret, eller direkte fastgjort (se figur 1, sammenlign "Unextracted Ctrl" til "Ekstraheret Ctrl"). Den ikke-nuklear fluorescens blev kvantificeret i begge prøver, og fraktionen af ER-associerede mRNA blev beregnet (figur 2). Vore data viser tydeligt, at både ALPP og CYP8B1, er omkring 60% af den cytoplasmiske mRNA associeret med ER. Da begge disse mRNA'er koder for proteiner, der behandles i ER-lumen, vores resultater er konsistente med den ide, at sådanne mRNA'er omregnes på overfladen af ​​ER.

Til overvågning af ER-sammenslutning af disse transkripter efter ribosom-dissociation, transfekteret COS-7 celler blev trprettet med kontrolmedium, puromycin eller HHT i 30 minutter derefter ekstraheret, fikseret og farvet under anvendelse af specifikke FISH prober mod hvert mRNA (for repræsentative billeder se figur 1, til kvantificering af ER-og nuklear-associerede mRNA se figur 3). Bemærk, at kun ALPP, og ikke CYP8B1 mRNA, bevares på den ER efter ribosomer er adskilt med puromycin eller HHT (fig. 2-3). Vigtigt er det niveau af nuklear mRNA ændrede sig ikke mellem de forskelligt behandlede prøver for hver mRNA (figur 3). Denne konstante nukleare FISH signal indikerer, at de ændringer i fluorescensintensitet i ER fraktionen ikke skyldes ændringer i mRNA-ekspression eller variationer i FISH farvning.

Ud fra disse resultater konkluderer vi, at en delmængde af ER-målrettede mRNA'er, såsom ALPP transkriptet, fastholdes på overfladen af dette organel efter ribosom adskillelse.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "altid">
Fig. 1. ALPP, men ikke CYP8B1 mRNA forbliver forbundet med ER uafhængigt af ribosomer og oversættelse. COS-7 celler blev transficeret med plasmider indeholdende enten ALPP (øverste række) eller CYP8B1 (nederste række) gener og fik lov til at udtrykke mRNA for 18-24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med DMSO kontrolmedium ("Ctrl"), puromycin ("Puro") eller HHT i 30 minutter. Celler blev enten direkte fast ("unextracted") eller ekstraheres først derefter fikseret. Bemærk, at mens kontrol-og HHT-behandlede celler blev ekstraheret med digitonin alene, Puro-behandlede celler blev ekstraheret med digitonin og EDTA. Celler blev farvet for mRNA under anvendelse af specifikke FISH-prober, og afbildes. Scale bar = 20 | jm.

lways ">
Figur 2. Kvantificering af niveauet af ER-associering til ALPP og CYP8B1 mRNA. Transficerede COS-7-celler blev enten direkte fastgjort til bestemmelse af totalindholdet af mRNA i cytoplasmaet (se figur 1, "Unextracted Ctrl"-celler) eller ekstraheres først, og derefter fikseret at bestemme mængden af ER-associerede mRNA (se figur 1, "Ekstraheret Ctrl"-celler). For hvert forsøg den gennemsnitlige ER-associeret fluorescens på 30-40 ekstraherede celler blev divideret med den gennemsnitlige cytoplasmatiske fluorescens på 30-40 unextracted celler, til opnåelse af fraktionen af ER-bundne mRNA (y-akse). Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardfejlen af ​​tre uafhængige eksperimenter.

Figur 3. Kvantificering af ER-associeciation af ALPP og CYP8B1 mRNA efter ribosom dissociation. Transficerede COS-7 celler blev behandlet med kontrolmedium eller forskellige translationsinhibitorer, ekstraheret, fikseret, farvet for mRNA under anvendelse af specifikke FISH-sonder og afbildet (se figur 1, "udvundet" celler). Fluorescensintensiteterne af mRNA i ER og kernen blev kvantificeret. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet og standardafvigelse af tre uafhængige forsøg, der hver består af den gennemsnitlige integrerede intensitet af 30 celler over baggrund og normaliseret til fluorescensen i ER af kontrol-behandlede celler (y-akse). Bemærk, at selv om ribosom forstyrrelse CYP8B1 mRNA at dissociere fra ER, det nukleare mRNA var upåvirket.

Discussion

Lokaliseringen af ​​mRNA'er til forskellige subcellulære steder, gennem interaktion af udskrifter med mRNA lokalisering proteiner, er et udbredt fænomen vigtig for en korrekt sortering af proteiner til deres endelige bestemmelsessted, og for finjustering af genekspression til de lokale krav til et subcellulært region ^19,20.

Anvendelse af assayet beskrevet her, vi revisited hvorvidt mRNA'er, der koder sekretoriske proteiner kan opretholdes på ER i nærvær eller fravær af ribosomer eller translation. Faktisk fandt vi, at et undersæt af disse mRNA'er har denne aktivitet ^11. For eksempel, ved hjælp af denne ekstraktionsprotokol vi fastslået, at både ALPP og CYP8B1 mRNA'er er lokaliseret på overfladen af ER i kontrol behandlede COS-7-celler (figur 1-2). Efter behandling af cellerne med translation inhibitorer puromycin eller HHT, kun ALPP, men ikke CYP8B1 mRNA,forblev associeret med ER i fravær af funktionelle ribosomer og oversættelse (figur 1, 3). Derudover har vi tidligere vist sig, at ALPP mRNA forbliver ER-associeret i COS-7 celler blev behandlet med pactamycin ^11. Da disse forskellige behandlinger virker via forskellige mekanismer for at fjerne mRNA af associerede ribosomer, er det usandsynligt, at ER-associering ALPP er resultatet af nogle indirekte cellulært respons på et bestemt lægemiddel. At bekræfte, at disse translationsinhibitorer er effektive, er det også nyttigt at teste om de inhiberer inkorporeringen af ^{35S-methionin} i nysyntetiserede proteiner. For eksempel har vi fundet, MDMP-behandling (100 uM, 15 minutter) kun kan inhibere 40-60% af al proteinsyntese i COS-7 celler (XA Cui og AF Palazzo, upublicerede observationer). Som følge heraf har dette stof ikke effektivt afbryde ER-lokalisering af mRNA'er, der kræver translation af deres målretning og vedligeholdelse (XA Cui og AF Palazzo, upublicerede observationer).

For yderligere at sikre, at ER-målretning af mRNA'et ikke er afhængig af kodede signalsekvens eller transmembrane domæner, kan man ændre den exogene transkript, så den koder for et cytoplasmisk protein. Faktisk har vi tidligere vist, at en version af ALPP mRNA, som mangler både signalsekvens og transmembrane kodende regioner er stadig i stand til at lokalisere til ER ^11.

Det er også værd at bemærke, at fremgangsmåden præsenteres her i kombination med andre assays anvendes til at analysere mRNA nuklear eksport ^21, kan anvendes til at definere kinetikken og krav i mRNA transport fra et rum til et andet (fx fra kernen til overfladen af ER). Faktisk ved microinjecting plasmider, der indeholder ALPP gen i kernerne i COS-7-celle, der blev forbehandlet med translationsinhibitorer, vi tidligere vist, at nylavede ALPPmRNA'er er målrettet til skadestuen uafhængigt af oversættelse eller ribosom-forening ^11.

Selv om vi ikke helt forstår, hvordan disse mRNA'er er målrettet og forankret til skadestuen, er det sandsynligt, at dette organel indeholder mRNA receptorer. Faktisk har vi for nylig identificeret P180, et stort positivt ladet membranbundet protein, som er nødvendigt for evne ALPP mRNA der skal opretholdes på ER uafhængigt af translation ^11. Det er imidlertid sandsynligt, at andre mRNA-receptorer skal være til stede på overfladen af ER ^11. Med hjælp af den teknik skitseret her, håber vi at identificere og dissekere mange af de molekylære mekanismer, der hjælper med at regulere mRNA lokalisering i mammale celler.