Summary
כאן אנו מתארים assay צמיחה
Abstract
ס aureus הוא חיידק הפתוגני שדורש ברזל כדי למלא תפקידים מטבוליים חיוניים ובגורמים למחלות. המאגר העשיר ביותר של ברזל בתוך המארח האנושי הוא heme, שהוא cofactor של המוגלובין. לרכישת ברזל מהמוגלובין, ס סטפילוקוקוס מנצל מערכת מורכבת ידועה כגורם המשטח ברזל המוסדר (ISD) 1 המערכת. מרכיבי ההמוגלובין ISD המערכת הראשון לאגד המארח, ואז לחלץ ולייבא heme, ולבסוף לשחרר ברזל ממקור צמחי בציטופלסמה החיידקים 2,3. מסלול זה כבר נתח באמצעות מספר רב של מחקרים במבחנת 4-9. יתר על כן, תרומתה של מערכת ISD לזיהום הודגמה שוב ושוב במודלי עכבר 8,10-14. הקמת התרומה של מערכת ISD לרכישת ברזל המוגלובין-נגזר וצמיחה הוכיחה להיות יותר מאתגר. מבחני צמיחה באמצעות ההמוגלובין כמקור ברזל בלעדי מסובכים בy חוסר היציבות של המוגלובין הזמין מסחרי, מזהם ברזל חופשי במדיום הגידול, והרעילות הקשורה chelators ברזל. כאן אנו מציגים שיטה המתגברת על מגבלות אלה. המוגלובין באיכות הגבוהה מוכן מדם טרי ומאוחסן בחנקן נוזלי. המוגלובין מטוהר הוא בתוספת ברזל לימוצה בינוני מחקה את סביבת ברזל העניים נתקלה ידי פתוגנים בתוך מארח החוליות. על דרך רעבה ס סטפילוקוקוס של ברזל חופשי ולהשלים עם צורת מניפולציות מינימאליות של המוגלובין נזרז את הצמיחה באופן שתלוי לחלוטין ביכולת לקשור המוגלובין, לחלץ heme, יעבור heme דרך מעטפת תא החיידק ולבזות heme בציטופלסמה. assay זה יהיה שימושי לחוקרים המבקשים להבהיר את המנגנונים של רכישת הברזל hemoglobin-/heme-derived בס סטפילוקוקוס ואולי חיידקים פתוגנים אחר.
Protocol
1. טיהור של המוגלובין מדם טרי
- לרכוש דם אדם טרי בתוספת נוגדי קרישה. לשמור על דם על קרח או ב 4 ° C בכל הטיהור.
- צנטריפוגה דם במשך 20 דקות ב1500 x גרם. תאי הדם האדומים (RBCs) יהיו בתחתית של התחתית. בזהירות לשאוב supernatant והעדינות resuspend גלול ב 0.9% (w / v) פתרון NaCl קר כקרח. חזור צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים.
- Resuspend הגלולה בנפח 1 מתוך קרים כקרח 10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0). זה יניע תמוגה של RBCs עקב לחץ האוסמוטי. הוסף ל~ טולואן נפח סופי של 20%.
- לדגור על 4 מעלות צלזיוס בצלייה למשך לילה.
- צנטריפוגה lysate ב20000 XG לשעה 1. לאסוף את שבר hemolysate האמצע עוזב טולואן (צף על גבי) וגלולה ללא פגע. השתמש פיפטה-צוואר ארוך כדי לאסוף את שבר האמצע.
- עובר דרך מסנן מזרק 0.44 מיקרומטר. אם הפתרון מכיל חלקיקיםעניין ולא יכול להיות מועבר דרך המסנן, חזור על שלב 1.5.
- לטהר המוגלובין (HB) עם כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהי עמודה (HPLC) אניון חליפין (ריאן, 1000 8 מיקרומטר PL-סקסופון, 150 מ"מ × 4.6 מ"מ). השלב הנייד הוא 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) ושלב ב 'נייד הם 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl. 0% -100% שיפוע של B ממס נדרס 2 דקות בשיעור 2.0 מ"ל / דקת זרימה. Elution מנוטר על בסיס קליטה (λ: 410 ננומטר ו 280 ננומטר). לאסוף רק השבריר מתאפיין בצבע אדום בהיר ושיא ספיגה בולט (איור 1).
- דיאליזת elution נגד פוספט נאגר מלוח (PBS) למשך הלילה ולאחר מכן לכמה שעות שוב. לעקר על ידי עובר דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22.
- כדי למדוד את ריכוז המוגלובין, להכין פתרוני המוגלובין סטנדרטיים של ריכוזים ידועים בPBS. לקבוע את הריכוז של המוגלובין במדגם על ידי ערבוב את הפתרונים הסטנדרטיים (ראה טבלה עם ריאגנטיםed) או פתרון לדוגמא עם ריאגנט של 2x דרבקין (שהוכן מאבקה) ביחס 1:1. לדוגמה, לערבב פתרון Hb 100 μl עם מגיב 100 μl 2x של דרבקין בצלחות 96-כן. דגירה במשך 15 דקות וספיגה במידה 540 ננומטר. להתוות עקומת סטנדרט ולקבוע את ריכוז המוגלובין במדגם. חמש עד 15 תשואות מ"ג / מ"ל הן טיפוסיות.
- הפעל מיקרוגרם 15-20 המטוהרים המוגלובין על 15% SDS-PAGE בשני עותקים. כתם אחד מהג'לי; להעביר את החלבונים מג'ל אחר על גבי קרום ניטרוצלולוזה וimmunoblot למוגלובין (איור 2).
- להקפיא ולאחסן 1 aliquots מ"ל של המוגלובין בחנקן נוזלי.
2. הכנת הברזל פוגע תקשורת צמיחה
- הכן Roswell Park Memorial מכון (RPMI) מרק על ידי המסת אבקת RPMI במים, מוסיף סודה לשתייה כפי שהומלץ על ידי היצרן וחומצות cassamino% 1 (CA) (W / V). לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר והחנות refrigמקורר.
- הכן מתכת מדולדלת RPMI (NRPMI) על ידי הוספת 7% (w / v) Chelex 100 וערבוב במשך הלילה על צלחת ומערבבים. הסר Chelex 100 על ידי עובר דרך מסנן וחנות בקירור 0.2 מיקרומטר. תוספת תקשורת עם מתכות שאינן ברזל חיוניים: 25 מיקרומטר ZnCl 2, 25 מיקרומטר MnCl 2, 100 מ"מימ CaCl 2 ו1 המ"מ MgCl 2 הוכן מראש כפתרון x סטרילי 1000. השתמש בכלי פלסטיק חד פעמים לצעד זה כדי למנוע זיהום מאספקת ברזל מחדש שמישה.
3. צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות המוגלובין כמקור ברזל Sole
- הרצף ס סטפילוקוקוס לבידוד באגר סויה tryptic (TSA) ממניות קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות.
- Resuspend ethylenediamine-N, ניצבת בין bis (חומצה 2-hydroxyphenylacetic) (EDDHA) באתנול נטול מים עד 100 מ"מ. EDDHA אינו נכנס פתרון אבל מעוקרת על ידי אתנול.
- הוסף לEDDHA RPMI לריכוז סופי של 0.5 מ"מ. להתירEDDHA לפזר לפחות 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. עקב וריאציה תצווה לתצווה, ריכוז EDDHA סופי ייתכן שיהיה הצורך הוריד ל0.25 מ"מ כדי לאפשר התפתחות חיידקים.
- לחסן מושבות בודדות של ס סטפילוקוקוס לתוך 5 מ"ל של RPMI מכיל EDDHA ב15 צינורות חרוטי פקק מ"ל. לדגור על 37 ° C עם הרעד ב180 סיבובים לדקה (סל"ד) ל16-20 שעות.
- צנטריפוגה תרבויות הלילה עבור 5 דקות ב7500 XG וresuspend בגלולה המכילה NRPMI EDDHA 0.5 מ"מ. לנרמל OD 600 ל ~ 3.
- הכן NRPMI המכיל 2.5 מיקרוגרם למ"ל והמוגלובין EDDHA 0.1-1.0 מ"מ. בשל שונות בין הקבוצות, ריכוז EDDHA נדרש Chelate ברזל חופשי בNRPMI עשוי להשתנות.
- 10 μl תת השעיה של חיידקים מצעד 3.5 לתוך 1 מ"ל NRPMI + + EDDHA המוגלובין בצינור 15 מיליליטר פקק חרוטים.
- דגירת התרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם הרעד ב180 סל"ד או בתוף מתגלגל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לנו מטוהר ההמוגלובין אנושי מhemolysate עם HPLC (צעד הפרוטוקול 1.7). איור 1 הקלטות ספיגת eluate ב 280 ואורכי גל 410 ננומטר. חלק 5 נאסף ומקטעים אחרים שנזרקו. תשואות של 5-15 מיליגרם של המוגלובין למ"ל של eluate נרכשות בדרך כלל. המוגלובין מטוהר נותח על ידי SDS-PAGE במשוכפל וג'לים היה או מוכתם לחלבונים או העביר על ניטרוצלולוזה וimmunoblotted (צעד הפרוטוקול 1.10, איור 2).
הערכנו את היכולת של מטוהר ההמוגלובין אנושי כדי לתמוך בצמיחה של זן בר ס סטפילוקוקוס וס סטפילוקוקוס שחסר את מרכיב ISDB של מערכת ISD (Δ ISDB). ISDB הוא קולט המוגלובין שנדרש לרכישת ההמוגלובין המופק ברזל 12. סוג פרוע וΔ ISDB גודלו במדיום ברזל מדולדל השלים עם hemog האנושי lobin (NRPMI + + EDDHA המוגלובין) כמפורט בסעיף 3 לפרוטוקול. כאשר גדלו בNRPMI + + EDDHA המוגלובין, סוג פראי אך לא Δ ISDB הוא מסוגל להתרבות כפי שצוין על ידי גידול בצפיפות אופטית של התרבויות לאורך זמן (איור 3 א). בניגוד לכך, היכולת לנצל את תוספת ברזל חופשי (3 + FeCl) היא זהה בסוג פרוע וΔ ISDB (איור 3 ב '). אין לסוג פרוע ולא Δ ISDB להתרבות בהעדר מקור ברזל (איור 3 ב ').
יש לנו בהשוואה לצמיחה של ס aureus בNRPMI + EDDHA השלים עם המוגלובין המטוהר מהדם הטרי או המוגלובין lyophilized. איור 4 ממחיש כי בעוד המוגלובין המטוהר מדם דורש ISDB לצמיחה, המוגלובין lyophilized מאפשר ריבוי Δ ISDB.
s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
איור 1. קליטתם של שברי elution במהלך טיהור המוגלובין. קליטה ב410 ננומטר (ספציפי לחלבוני קושרי heme) ו 280 ננומטר (אופייני לכל החלבונים) הייתה פיקוח לאורך elution. מספר שברירם הכיל המוגלובין ונאסף.
איור 2. מטוהר ההמוגלובין אנושי עשרים מיקרוגרם של המוגלובין מטוהר הופרד באמצעות denaturing 15% SDS-PAGE. א ג'ל מוכתם לחלבונים עם ריאגנט הצבע assay החלבון Bio-Rad. קרום ניטרוצלולוזה ב immunoblotted למוגלובין. הרצועה התחתונה האינטנסיבית היא מונומר המוגלובין, בעוד הלהקות העליונות החלשות יותר הן הדימרים המוגלובין וtertramers, שלא קבל לחלוטין מפוגל.
/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
איור 3. שימוש במוגלובין האנושי כמקור ברזל של ס א סטפילוקוקוס צמיחה מהסוג פרא (wt) או קולט המוגלובין isogenic ISDB המוטציה (Δ ISDB) בNRPMI בתוספת הברזל chelator EDDHA וההמוגלובין אנושי היא סטטיסטי שונה, כפי שנקבע על ידי המבחן של סטודנט שני זנב t, p <0.05. צמיחה ב בNRPMI השלימה עם כלוריד 10 מיקרומטר ברזל (3 + FeCl) או EDDHA (-FeCl 3) אינו שונים בין wt וΔ ISDB. גרפים מתארים נתונים מניסוי נציג, שכלל שלוש ביולוגיים משכפל. ברי שגיאה מציינים סטיית התקן של קריאות צפיפות אופטיות בנקודתי זמן מצוין בין משכפל.
איור 4. צמיחה מהסוג פרא (wt) או מ 'קולט המוגלובין isogenicutant (Δ ISDB) בתקשורת והשלמה עם המוגלובין המטוהר מדם טרי או המוגלובין lyophilized. הגרף מתאר נתונים מניסוי נציג, שכלל שלוש ביולוגיים משכפל. ברי השגיאה מייצגים סטיית התקן של קריאות צפיפות אופטיות בנקודתי זמן מצוין בין משכפל. כוכביות מציינות ערכים שהם סטטיסטיים שונים, כפי שנקבעו על ידי המבחן של סטודנט שני זנב t, p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ברזל הוא חומר מזין חיוני הנדרש על ידי אורגניזמים מכל הממלכות של 15 חיים. בבעלי חוליות, ברזל מבודד את להימנע מרעילות הנגרמת על ידי רכיב זה. תפיסה זו גם מסתירה ברזל מפלישת חיידקים בתהליך המכונה חסינות תזונתית 16. בתגובה, פתוגנים התפתחו אסטרטגיות עוקפות חסינות תזונתית. מנגנון אחד כזה מסתמך על המוגלובין, שהוא המקור הנפוץ ביותר של ברזל בתוך פונדקאי 17. המוגלובין כלול בתוך תאי דם אדומים. ההמוגלובין משתחרר מתאי דם אדומים פגומים כפוף haptoglobin מארח, מה שמסמן הסרה מהירה של מתחמי haptoglobin-המוגלובין ידי מקרופאגים 18. על מנת לקבל גישה למוגלובין, ש ' סטפילוקוקוס מבטא hemolysins שlyse תאי דם אדום 19. הסרת המוגלובין Haptoglobin מושרה שקולה למחייבת זיקה גבוהה של המוגלובין על ידי קולטנים בתא השטח שהביעו
מחקרים רבים הראו את התרומה של מערכת ISD לזיהום 8,10-14. יתר על כן, מחקרים ביוכימיים הקצו את הפונקציות של הרכיבים הבודדים שלה ברכישת המוגלובין-נגזרת ברזל 4-9. כאן אנו מתארים assay המנטר את צמיחתו של ס ' סטפילוקוקוס עם המוגלובין כמקור היחיד של ברזל זמין. בהקשר זה, אנו צריכים להצביע על תנאים מסוימים שהם מרכזיים להצלחתו של הניסוי.
הסוג והאיכות של חומרים כימיים המשמשים במבחני צמיחה של רכישת ברזל המוגלובין-derived יכולים להשפיע באופן דרמטי התוצאות obtaiנד במבחנים אלה. בניגוד למוגלובין מתקבל מהדם, המוגלובין הטרי המאוחסן בצורת lyophilized מאפשרת התפתחות חיידקים בלתי תלויה במרכיבים של מערכת ISD (איור 4) 21. סביר להניח שסיבה לשינויים במבנה ההמוגלובין המושרים על ידי lyophylization. באופן ספציפי, המוגלובין lyophilized מכיל tetramers, הדימרים ומונומרים של המוגלובין, כמו גם ב22 heme הצורה החופשיות שלה. טיהור של המוגלובין מדם טרי ושימורו בחנקן נוזלי להבטיח את תקינותו של החלבון 22. מחקר מקיף על המוגלובין הקל את פיתוח הפרוטוקולים לטיהור של המוגלובין באיכות גבוהה מדם טרי או בצורת רקומביננטי, אשר ניתן להשתמש בבדיקה שלנו 23-25.
הבחירה של chelator הברזל עלולה להשפיע assay הצמיחה. לדוגמה, 2,2-dipyridyl, המשמש לעתים קרובות כchelator ברזל, הוא רעיללתאים חיידקיים 26. שתי השפעות אלה לעשות את זה קשה להבחין אם העיכוב של התפתחות חיידקים על ידי 2,2-dipyridyl נובע קלאציה ברזל או רעיל. בנוסף, 2,2-dipyridyl צפוי להיות קרום חדיר, ובכך חודר לתא החיידק וchelates הברזל 27 intracellularly. אנחנו גילינו שעל ידי עיכוב הגדילה EDDHA מתהפך על ידי תוספת של ברזל מקור, מה שהופך EDDHA chelator ברזל מתאים יותר למבחני התפתחות חיידקים. עם זאת, הריכוז של EDDHA שצריך להתווסף למדיום הגידול עשוי להשתנות. הסיבה לכך היא וריאציה של שניהם עצמת EDDHA ותוכן ברזל מדיום גידול מ תצוו יצוו. פעילות chelating הברזל יכולה להיות מנורמלת בין קבוצות של EDDHA ידי הסרת שאריות ברזל 28 כימיות. עם זאת, בשל שונות בין קבוצות של RPMI, מצא כי ריכוז EDDHA הסופי עדיין ייתכן שיצטרך להיות מותאם כדי לאפשר צמיחה בנוכחות מקור ברזל. מצאנו הבריכוז הגבוה ביותר של EDDHA שהוא מתירנית לגידול מהסוג פרוע ס aureus בנוכחות של המוגלובין הוא אופטימלי לניסוי זה.
שינויים יכולים להתבצע לפרוטוקול הנוכחי להידמות באופן הדוק יותר על ידי חיידקי הסביבה נתקלה במהלך זיהום. לדוגמה, בתוך הפונדקאי, heme המשתחרר מההמוגלובין קשור במהירות על ידי hemopexin. Hemopexin לא יכול לשמש כמקור ברזל של ס aureus, לכן בנוסף ימנע רכישת heme שוחררה מהמוגלובין במהלך דגירה עם ס סטפילוקוקוס 12.
אנו חשים כי assay זה יכול לשמש למחקרים לרכישת מתכת על ידי מגוון רחב של חיידקים פתוגנים. יתר על כן, שיטה זו עשויה לשמש למדידת רכישת ברזל ממקורות שאינם ההמוגלובין של ברזל שנמצאים בתוך הפונדקאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים בארה"ב שירות בריאות ציבור AI69233 וAI073843 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. EPS הוא עמית בורוז Wellcome בפתוגנזה של מחלות זיהומיות. קמ"ש מומן על ידי התאית ומולקולרית מיקרוביולוגיה הדרכת מענק תכנית 5 T32 A107611-10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC anion exchange column | Varian | PL1551-3802 | |
| Drabkin's reagent | Sigma | D5941-6VL | |
| Hemoglobin standard | Pointe Scientific | H7506-STD | |
| RPMI | HyClone | SH30011.02 | |
| Chelex 100 sodium form | Sigma | C7901 | |
| EDDHA | LGC Standards GmbH | ANC 001 | |
| Hemoglobin a antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc | SC-21005 | |
| Tryptic soy agar | BD | 236920 |
References
- Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
- Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
- Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
- Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
- Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
- Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
- Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
- Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
- Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
- Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
- Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
- Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
- Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Weinberg, E. D.
- Drabkin, D.
- Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
- Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
- Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
- Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
- Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
- Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
- Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
- Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
- Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
- Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
- Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
