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Immunology and Infection

Staphylococcus aureus एक आयरन स्रोत के रूप में मानव हीमोग्लोबिन का उपयोग ग्रोथ

Published: February 7, 2013 doi: 10.3791/50072
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

Summary

हम यहाँ के लिए एक विकास परख का वर्णन

Abstract

एस aureus एक रोगजनक जीवाणु है कि महत्वपूर्ण चयापचय कार्यों और कारण रोग के लिए बाहर ले जाने के लिए लोहे की आवश्यकता है. मानव मेजबान के अंदर लोहे का सबसे प्रचुर मात्रा में जलाशय heme, जो हीमोग्लोबिन की cofactor है. हीमोग्लोबिन से लोहे का अधिग्रहण, एस. aureus एक विस्तृत लोहा विनियमित सतह (आईएसडी) निर्धारक 1 प्रणाली के रूप में जाना जाता प्रणाली का उपयोग किया जाता है. आईएसडी प्रणाली 1 बाँध मेजबान हीमोग्लोबिन के घटक, तो निकालने और हीम आयात, और अंत में हीम से बैक्टीरियल cytoplasm 2,3 में लोहे को आजाद कराने. इस मार्ग में इन विट्रो 4-9 अध्ययन में कई के माध्यम से किया गया dissected है. इसके अलावा, आईएसडी प्रणाली के संक्रमण के लिए योगदान को बार - बार किया गया है 8,10-14 माउस मॉडल में प्रदर्शन किया. हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न अधिग्रहण लोहा आईएसडी प्रणाली के योगदान की स्थापना और विकास के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. विकास के लिए एक एकमात्र लोहे के स्रोत के रूप में हीमोग्लोबिन का उपयोग assays ख जटिल कर रहे हैंy व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीमोग्लोबिन की अस्थिरता, मध्यम विकास में नि: शुल्क लोहा contaminating और लोहे chelators के साथ जुड़े विषाक्तता. यहाँ हम एक तरीका है कि इन सीमाओं पर काबू उपस्थित थे. उच्च गुणवत्ता हीमोग्लोबिन ताजा रक्त से तैयार किया जाता है और तरल नाइट्रोजन में संग्रहित है. शुद्ध हीमोग्लोबिन में पूरक है मध्यम लोहे गरीब हड्डीवाला मेजबान के अंदर रोगजनकों द्वारा सामना वातावरण नकल उतार लौह खलाना. एस भूख से मुक्त लोहे की aureus और हीमोग्लोबिन की एक न्यूनतम चालाकी से फार्म के साथ हम एक तरह से है कि पूरी तरह से हीमोग्लोबिन बाँध, हीम निकालने के, बैक्टीरियल सेल लिफाफा के माध्यम से heme के पास और cytoplasm में हीम नीचा करने की क्षमता पर निर्भर है में वृद्धि प्रेरित सप्लीमेंट. इस परख शोधकर्ताओं एस में hemoglobin-/heme-derived लोहे के अधिग्रहण के तंत्र को स्पष्ट करने की मांग के लिए उपयोगी हो जाएगा aureus और संभवतः अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों.

Protocol

1. हीमोग्लोबिन की ताजा रक्त से शोधन

  1. ताजा मानव एक anticoagulant के साथ पूरक रक्त मोल. शुद्धि भर में बर्फ पर या 4 में रक्त डिग्री सेल्सियस रखें.
  2. 1500 x छ पर 20 मिनट के लिए रक्त अपकेंद्रित्र. लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) की ट्यूब के नीचे हो जाएगा. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और धीरे ठंडा 0.9% (w / v) NaCl समाधान में गोली resuspend. Centrifugation दोहराएँ और 3 बार धो लो.
  3. ठंडा 10 मिमी Tris एचसीएल (8.0 पीएच) के 1 मात्रा में गोली Resuspend. यह आसमाटिक दबाव के कारण लाल रक्त कोशिकाओं की lysis प्रेरित करेगा. ~ 20% अंतिम मात्रा टोल्यूनि जोड़ें.
  4. एक rotisserie पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
  5. 1 घंटा के लिए 20,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र. मध्य hemolysate (शीर्ष पर फ्लोटिंग) टोल्यूनि और गोली अछूता जा अंश ले लीजिए. बीच अंश एकत्र करने के लिए एक लंबी गर्दन विंदुक का प्रयोग.
  6. 0.44 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. यदि समाधान कण में हैमामला है और फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया नहीं कर सकते हैं, 1.5 चरण दोहराएँ.
  7. हीमोग्लोबिन (एचबी) शुद्ध के साथ एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) आयनों विनिमय स्तंभ (Varian, PL-SAX 1,000 एक 8 सुक्ष्ममापी, 150 मिमी × 4.6 मिमी). मोबाइल चरण एक है 10 Tris - एचसीएल मिमी (8.0 पीएच) और मोबाइल चरण बी 10 मिमी Tris एचसीएल (8.0 पीएच) + 0.5 एम NaCl है. विलायक बी के एक 0% -100% ढाल 2.0 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर पर 2 मिनट पर चलाया जाता है. क्षालन अवशोषण के आधार पर निगरानी रखी जाती है (λ: 410 एनएम और 280 एनएम). केवल एक चमकीले लाल रंग के और एक प्रमुख अवशोषण चोटी (1 चित्रा) द्वारा विशेषता अंश ले लीजिए.
  8. के खिलाफ क्षालन Dialyze फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) तो और रात में कुछ घंटों के लिए फिर से. एक 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा जीवाणुरहित.
  9. Hb एकाग्रता को मापने, पीबीएस में ज्ञात सांद्रता के मानक एचबी समाधान तैयार करते हैं. मानक समाधान मिश्रण द्वारा निर्धारित नमूने में एचबी की एकाग्रता (हमें अभिकर्मकों के साथ तालिका देखेंएड) या एक 1:1 अनुपात में 2x Drabkin अभिकर्मक (पाउडर से तैयार) के साथ नमूना समाधान. उदाहरण के लिए, 96 अच्छी तरह प्लेटें में 100 μl 2x Drabkin अभिकर्मक के साथ 100 μl एचबी समाधान मिश्रण. 15 मिनट के लिए और 540 एनएम पर माप absorbance सेते हैं. एक मानक वक्र प्लॉट और नमूने में एचबी एकाग्रता का निर्धारण. पांच से पन्द्रह मिलीग्राम / एमएल की पैदावार विशिष्ट हैं.
  10. 15-20 ग्राम एक 15% एसडीएस पृष्ठ पर दो प्रतियों में हीमोग्लोबिन शुद्ध चलाएँ. जैल के दाग, nitrocellulose झिल्ली और हीमोग्लोबिन के लिए immunoblot (2 चित्रा) पर एक और जेल से प्रोटीन हस्तांतरण.
  11. रुक और तरल नाइट्रोजन में हीमोग्लोबिन 1 मिलीलीटर aliquots की दुकान.

2. आयरन की तैयारी - खलाना विकास मीडिया

  1. पानी में RPMI पाउडर भंग Roswell पार्क मेमोरियल (RPMI) संस्थान शोरबा तैयार, सोडियम बिकारबोनिट जोड़ने के रूप में निर्माता और 1% cassamino एसिड (CA) (w / v) द्वारा सिफारिश. एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और दुकान refrig के माध्यम से गुजर द्वारा जीवाणुरहितerated.
  2. धातु समाप्त RPMI (NRPMI) 7 (w / v)% Chelex 100 जोड़ने और हलचल प्लेट पर रातोंरात मिश्रण तैयार करो. 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर और प्रशीतित की दुकान के माध्यम से गुजर द्वारा Chelex 100 निकालें. 25 सुक्ष्ममापी 2 ZnCl, 25 2 MnCl, 100 मिमी 2 CACL सुक्ष्ममापी और 1 मिमी 2 MgCl एक बाँझ 1000 x समाधान के रूप में अग्रिम में तैयार: आवश्यक गैर लौह धातुओं के साथ मीडिया अनुपूरक. इस कदम के लिए डिस्पोजेबल प्लास्टिक के कंटेनर का उपयोग करने के लिए फिर से प्रयोग करने योग्य आपूर्ति से लोहा संक्रमण से बचने के.

3. Staphylococcus aureus एक एकमात्र आयरन स्रोत के रूप में हीमोग्लोबिन का उपयोग कर विकास

  1. स्ट्रीक एस अलगाव के लिए एक जमे हुए स्टॉक से tryptic सोया अगर (TSA) पर aureus. 20-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. Resuspend ethylenediamine-N, (एसिड 2-hydroxyphenylacetic) निर्जल इथेनॉल में 100 मिमी के लिए (EDDHA) n '- बीआईएस. EDDHA समाधान में नहीं जाना है, लेकिन करता है इथेनॉल द्वारा निष्फल.
  3. RPMI EDDHA 0.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें. अनुमति देनाEDDHA कम से कम 30 मिनट के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले भंग करने के लिए. बैच को बैच की भिन्नता के कारण, अंतिम EDDHA एकाग्रता .25 मिमी के लिए उतारा जा बैक्टीरियल वृद्धि की अनुमति की आवश्यकता हो सकती है.
  4. एस के एकल कालोनियों को टीका लगाना RPMI 15 मिलीलीटर पेंच टोपी शंक्वाकार ट्यूब में EDDHA युक्त 5 मिलीलीटर में aureus. 16-20 घंटे के लिए प्रति मिनट (आरपीएम) 180 rotations में मिलाते के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. 7500 XG पर 5 मिनट के लिए रातोंरात संस्कृतियों अपकेंद्रित्र और गोली resuspend NRPMI 0.5 मिमी EDDHA युक्त. 3 ~ 600 आयुध डिपो सामान्यकरें.
  6. NRPMI मिलीलीटर एचबी प्रति 2.5 ग्राम और 0.1-1.0 मिमी EDDHA युक्त तैयार करो. बैचों के बीच भिन्नता के कारण, EDDHA NRPMI में मुफ्त लोहा कुली की आवश्यकता है एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं.
  7. Subculture मिलीलीटर 1 NRPMI + EDDHA + एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी शंक्वाकार ट्यूब में एचबी में 3.5 कदम से बैक्टीरिया निलंबन के 10 μl.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों 180 rpm पर या एक रोलिंग ड्रम पर झटकों के साथ 48 घंटा लिए सेते हैं.
    9. 600 रीडिंग ले.

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Representative Results

हम hemolysate से मानव हीमोग्लोबिन शुद्ध HPLC (प्रोटोकॉल 1.7 कदम) के साथ चित्रा 1 से पता चलता है कि 280 और 410 एनएम तरंगदैर्य पर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक की absorbance दर्ज. 5 अंश एकत्र किया गया था और अन्य fractions खारिज कर दिया गया. प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक की प्रति मिली लीटर हीमोग्लोबिन के पांच से पंद्रह मिलीग्राम की पैदावार आम तौर पर हासिल किया है. शुद्ध हीमोग्लोबिन एसडीएस पृष्ठ द्वारा दो प्रतियों में विश्लेषण किया गया था और जैल या प्रोटीन के लिए दाग थे या nitrocellulose पर स्थानांतरित और immunoblotted (प्रोटोकॉल 1.10 कदम, चित्रा 2).

हम मानव हीमोग्लोबिन शुद्ध जंगली प्रकार के विकास का समर्थन करने की क्षमता का आकलन किया है एस aureus और एस. aureus कि आईएसडी सिस्टम (Δ ISDB) ISDB घटक का अभाव है. ISDB एक हीमोग्लोबिन रिसेप्टर कि हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न लोहा 12 अधिग्रहण के लिए आवश्यक है. जंगली प्रकार और Δ ISDB लौह समाप्त मानव hemog साथ पूरक मध्यम में बड़े हो रहे थे lobin (NRPMI EDDHA एचबी +) के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 3 में वर्णित है. जब NRPMI + EDDHA + एचबी, जंगली प्रकार में वृद्धि हुई है, लेकिन समय (चित्रा 3 ए) पर संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व में वृद्धि के रूप में संकेत दिया पैदा करना करने में सक्षम नहीं है Δ ISDB. इसके विपरीत, पूरक मुक्त लोहा (+ 3 FeCl) का उपयोग करने की क्षमता जंगली प्रकार और Δ ISDB (3B चित्रा) में समान है. (3B चित्रा) एक लोहे के स्रोत के अभाव में न तो जंगली प्रकार और न ही Δ ISDB पैदा करना.

हम एस के विकास की तुलना में है NRPMI + EDDHA में aureus ताजा रक्त या lyophilized हीमोग्लोबिन से शुद्ध हीमोग्लोबिन के साथ पूरक चित्रा 4 दिखाता है कि जबकि खून से शुद्ध हीमोग्लोबिन विकास के लिए ISDB की आवश्यकता है, lyophilized हीमोग्लोबिन Δ ISDB के प्रसार के लिए सक्षम बनाता है.

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चित्रा 1. हीमोग्लोबिन शोधन के दौरान क्षालन fractions का अवशोषण 410 (heme बंधनकारी प्रोटीन विशिष्ट) एनएम और 280 एनएम (सभी प्रोटीनों के लिए विशेषता) में अवशोषण क्षालन भर नजर रखी थी. अंश पाँच संख्या हीमोग्लोबिन रखी जाती है और एकत्र किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. मानव हीमोग्लोबिन शुद्ध शुद्ध हीमोग्लोबिन के बीस micrograms के 15% एसडीएस पृष्ठ denaturing का उपयोग कर अलग हो गया था. ए जेल जैव रेड प्रोटीन परख डाई अभिकर्मक के साथ प्रोटीन के लिए दाग. बी Nitrocellulose झिल्ली हीमोग्लोबिन के लिए immunoblotted. तीव्र कम बैंड एक हीमोग्लोबिन monomer है, जबकि अधिक बेहोश ऊपरी बैंड हीमोग्लोबिन dimers और tertramers कर रहे हैं, जो पूरी तरह से विकृत नहीं मिला.

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चित्रा 3. एक लोहे के स्रोत के रूप में मानव हीमोग्लोबिन एस द्वारा उपयोग aureus ए जंगली प्रकार (wt) या isogenic में हीमोग्लोबिन NRPMI में रिसेप्टर ISDB उत्परिवर्ती (Δ ISDB) लोहा chelator EDDHA और मानव हीमोग्लोबिन के साथ पूरक की वृद्धि सांख्यिकीय अलग है के रूप में छात्र दो पूंछ टी परीक्षण, <0.05 पी द्वारा निर्धारित है. बी NRPMI में ग्रोथ 10 सुक्ष्ममापी लोहा (+ 3 FeCl) क्लोराइड या EDDHA साथ पूरक (FeCl 3) wt और Δ ISDB के बीच अलग नहीं है रेखांकन एक प्रतिनिधि प्रयोग है, जो तीन जैविक replicates शामिल से डेटा को दर्शाती है. त्रुटि सलाखों replicates के बीच संकेत समय बिंदुओं पर ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के मानक विचलन निरूपित.

चित्रा 4
चित्रा 4. जंगली प्रकार (wt) या isogenic हीमोग्लोबिन रिसेप्टर मीटर की वृद्धिताजा रक्त या lyophilized हीमोग्लोबिन से शुद्ध हीमोग्लोबिन के साथ पूरक मीडिया में (Δ ISDB). utant ग्राफ एक प्रतिनिधि प्रयोग, जो तीन replicates जैविक शामिल से डेटा को दर्शाया गया है. त्रुटि सलाखों replicates के बीच संकेत समय बिंदुओं पर ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. सितारे निरूपित करने के लिए मूल्यों है कि सांख्यिकीय अलग रूप में छात्र दो पूंछ टी परीक्षण, <0.05 पी द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.

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Discussion

लोहे की एक आवश्यक 15 जीवन के सभी राज्यों से जीवों के लिए आवश्यक पोषक तत्व है. रीढ़ में, लोहे के इस तत्व के कारण विषाक्तता से बचने के तनहा है. इस ज़ब्ती भी एक पोषण 16 उन्मुक्ति के रूप में जाना जाता है की प्रक्रिया में रोगाणुओं हमलावर से लोहा conceals. जवाब में, रोगज़नक़ों रणनीतियों कि पोषण उन्मुक्ति को दरकिनार करने के लिए विकसित किया है. ऐसा ही एक तंत्र हीमोग्लोबिन पर निर्भर करता है, जो 17 मेजबान के भीतर लोहे की सबसे प्रचुर स्रोत है. हीमोग्लोबिन लाल रक्त कोशिकाओं के भीतर निहित है. क्षतिग्रस्त लाल रक्त कोशिकाओं से जारी हीमोग्लोबिन मेजबान haptoglobin, जो 18 मैक्रोफेज द्वारा haptoglobin हीमोग्लोबिन परिसरों के तेजी से हटाने का संकेत से बाध्य है. आदेश में हीमोग्लोबिन को हासिल करने के लिए, एस. aureus hemolysins कि लाल रक्त कोशिकाओं 19 lyse व्यक्त करता है. Haptoglobin प्रेरित हीमोग्लोबिन हटाने हीमोग्लोबिन की उच्च आत्मीयता के बंधन से कोशिका की सतह द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स से मुकाबला 20 में बरकरार उपयोग किया.

कई अध्ययनों 8,10-14 संक्रमण आईएसडी प्रणाली के योगदान का प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, जैव रासायनिक अध्ययन हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न लोहा 4-9 अधिग्रहण में अपनी व्यक्तिगत घटकों का कार्य सौंपा है. यहाँ हम एक परख है कि एस के विकास पर नज़र रखता का वर्णन उपलब्ध लोहे का एकमात्र स्रोत के रूप में हीमोग्लोबिन के साथ aureus. इस संबंध में, हम बाहर कुछ स्थिति है कि प्रयोग की सफलता के लिए निर्णायक बिंदु की जरूरत है.

और हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न लोहा अधिग्रहण विकास assays में उपयोग अभिकर्मकों की गुणवत्ता के प्रकार में नाटकीय परिणाम obtai को प्रभावित कर सकते हैंइन assays में नेड. ताजा रक्त हीमोग्लोबिन, कि lyophilized बैक्टीरियल वृद्धि की अनुमति देता है आईएसडी प्रणाली (चित्रा 4) 21 के घटकों के स्वतंत्र में संग्रहीत है से प्राप्त हीमोग्लोबिन के विपरीत. यह संभावना है हीमोग्लोबिन की संरचना में परिवर्तन कि lyophylization द्वारा प्रेरित कर रहे हैं के कारण है. विशेष रूप से, lyophilized हीमोग्लोबिन tetramers, dimers, और हीमोग्लोबिन monomers के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने नि: शुल्क फार्म 22 में हीम शामिल हैं. ताजा और तरल नाइट्रोजन में इसके संरक्षण के खून से हीमोग्लोबिन के शुद्धीकरण 22 प्रोटीन की अखंडता को सुनिश्चित करने के. हीमोग्लोबिन पर व्यापक अनुसंधान ताजा रक्त या रीकॉम्बीनैंट रूप है, जो हमारे 23-25 ​​परख में इस्तेमाल किया जा सकता है में उच्च गुणवत्ता वाले हीमोग्लोबिन की शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल के विकास में मदद की है.

लोहा chelator का चुनाव विकास परख को प्रभावित कर सकता है. उदाहरण के लिए, 2,2 dipyridyl, विषैला होता है जो अक्सर एक लोहा chelator के रूप में प्रयोग किया जाता हैबैक्टीरियल कोशिकाओं 26. इन दो प्रभाव यह मुश्किल के लिए विचार अगर 2,2 dipyridyl द्वारा बैक्टीरियल वृद्धि के निषेध लोहा केलेशन या विषाक्तता के कारण है. इसके अतिरिक्त, 2,2 dipyridyl पारगम्य झिल्ली होने की संभावना है, और इस प्रकार सेल बैक्टीरियल प्रवेश और लोहा 27 intracellularly chelates. हमने पाया है कि EDDHA विकास निषेध एक लोहे के स्रोत की पूरकता से उलट है, बैक्टीरियल वृद्धि assays के लिए एक अधिक उपयुक्त लोहा chelator EDDHA बना रही है. हालांकि, EDDHA की एकाग्रता है कि विकास के माध्यम से जोड़ा जाना चाहिए भिन्न हो सकते हैं. यह दोनों EDDHA शक्ति और विकास मध्यम लोहे बैच के बैच के लिए सामग्री की भिन्नता की वजह से है. लोहा chelating गतिविधि रासायनिक अवशिष्ट लोहा 28 को हटाने के द्वारा EDDHA के बैचों के बीच सामान्यीकृत जा सकता है. हालांकि, RPMI के बैचों के बीच भिन्नता की वजह से है, हमने पाया है कि अंतिम EDDHA एकाग्रता अभी भी करने के लिए एक लोहे के स्रोत की उपस्थिति में वृद्धि की अनुमति देने के लिए समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है. हम वें पायाEDDHA के सर्वोच्च एकाग्रता है कि जंगली प्रकार के विकास के लिए अनुमोदक है पर एस हीमोग्लोबिन की उपस्थिति में aureus इस प्रयोग के लिए इष्टतम है.

संशोधन वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है और अधिक बारीकी से बैक्टीरिया से संक्रमण के दौरान सामना करना पड़ा पर्यावरण के समान. उदाहरण के लिए, मेजबान के भीतर, हीम कि हीमोग्लोबिन से जारी है जल्दी hemopexin द्वारा बाध्य है. Hemopexin एस द्वारा एक लोहे के स्रोत के रूप में नहीं किया जा सकता aureus, इसलिए इसके अलावा एस के साथ ऊष्मायन के दौरान हीमोग्लोबिन से जारी heme के अधिग्रहण को रोका जा सके 12 aureus.

हमें लगता है कि इस परख बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की एक किस्म द्वारा धातु अधिग्रहण में अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि के लिए लोहे की गैर हीमोग्लोबिन सूत्रों का कहना है कि मेजबान के भीतर मौजूद हैं से लोहा अधिग्रहण को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध अमेरिका के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा AI69233 और AI073843 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. ईपीएस के संक्रामक रोगों के रोगजनन में एक Burroughs Wellcome बंदे है. किमी सेलुलर और आण्विक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रशिक्षण अनुदान 5 कार्यक्रम T32 A107611-10 के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

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References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

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