Summary
अलगाव और myofibers का संस्कृति स्वर्ण मानक है
Protocol
सभी प्रयोगों जानवरों की देखभाल और हैंडलिंग के लिए ओटावा नियमों के विश्वविद्यालय के अनुसार संभाल रहे थे.
प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन के लिए 1 टेबल देखें.
1. अलगाव शुरू करने से पहले
- निम्नलिखित समाधान तैयार:
0.2% Collagenase प्रकार DMEM में मैं (है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, उच्च ग्लूकोज, 110 मिलीग्राम / एमएल सोडियम पाइरूवेट के साथ एल glutamine). दो EDL मांसपेशियों DMEM में 0.2% Collagenease के 2 मिलीलीटर तैयार करते हैं. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. अलगाव से पहले 10 मिनट, 37 पर prewarm ° सी एक पानी में स्नान. Undiluted कोलैजिनेज के अतिरिक्त aliquots -20 डिग्री सेल्सियस में बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है.
नोट: DMEM प्रक्रिया के सभी भर में सोडियम पाइरूवेट के साथ उपयोग करें. फाइबर सोडियम पाइरूवेट मुक्त माध्यम में जीवित नहीं है.- वॉशिंग मीडिया (सभी washes प्रदर्शन का उपयोग करें). 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ DMEM अनुपूरक. 0 के माध्यम से फ़िल्टरउपयोग करने से पहले .22 सुक्ष्ममापी फिल्टर.
- Myofiber संस्कृति मीडिया. अनुपूरक DMEM 20% FBS, 1% चिकन भ्रूण निकालने और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ. 0.22 का उपयोग करने से पहले फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से फिल्टर.
- लेपित व्यंजन Matrigel. समय की लंबी अवधि के लिए संस्कृति फाइबर, हम कोटिंग सब्सट्रेट के रूप Matrigel का उपयोग करने की सलाह देते हैं. Matrigel लेपित व्यंजन तैयार करने के लिए, 4 ° C विकेट पर Matrigel की एक अशेष भाजक पिघलना करने के लिए. दिन के बाद, DMEM में Matrigel 1:10 पतला. 4 में रखें Matrigel ° सभी समय पर सी और अचानक तापमान परिवर्तन से बचने के रूप में इस Matrigel असमान कोटिंग में उत्पन्न समाधान के भीतर सूक्ष्म क्रिस्टल पैदा करेगा. प्लेस व्यंजन बर्फ पर लेपित. सिर्फ सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ कोट व्यंजन हैं. चलो इसे 1 मिनट के लिए बैठते हैं. पूरी तरह से बचे हुए Matrigel हटा दें. 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सूखी कम से कम 3 घंटे के लिए उपयोग करने के लिए पूर्व या रातोंरात चलो.
नोट: की aliquots किया जा सकता है पतला Matrigel कोटिंग उद्देश्य के लिए कई बार फिर से इस्तेमाल किया अगर 4 और डे पर संग्रहीतजी, सी. - अंत में, 70% इथेनॉल के साथ माइक्रोस्कोप स्टेशन और विदारक उपकरण साफ कर लें.
- दो EDL isolations (एक माउस) के पांच के रूप में प्लास्टिक पेट्री डिश (60 * 15mm) तैयार:
- अलगाव के लिए चार व्यंजन (मांसपेशी हदबंदी के लिए एक, धारावाहिक washes के लिए 3). सभी व्यंजन घोड़े सीरम (एचएस) के साथ लेपित किया जाना चाहिए करने के लिए प्लास्टिक के लिए संलग्न से myofibers को रोकने. कोट, पिपेट प्रत्येक ज़ुल्फ़, पकवान में 3 घोड़े सीरम मिलीलीटर भी कोटिंग की अनुमति देने के लिए, घोड़े सीरम हटाने और पकवान कम से कम 30 मिनट के लिए दो सूखी. प्रत्येक पकवान DMEM के 4 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन से पहले एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखने के लिए इस्तेमाल.
नोट: हार्स सीरम कई बार किया जा सकता है फिर से इस्तेमाल किया, अगर बाँझ रखा. वैकल्पिक रूप से, DMEM में 10% एच एक समाधान कोट बर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पूरे प्रोटोकॉल भर में एच एस लेपित बर्तन का उपयोग करें और जब अस्थायी शर्तों पर संवर्धन myofibers.- एक पकवान अलगाव के बाद संस्कृति myofibers के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. Alternative डिश आकार या स्वरूप myofibers के बहाव के अनुप्रयोगों के आधार पर अंतिम संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हम पकवान * 60 15mm से बड़े आकार के सुझाव नहीं है. Myofibers नहीं रह से 96 घंटे के लिए निलंबन में रखा जा सकता है पहले हाइपर संकुचन होता है. अब संस्कृति समय के लिए, हम Matrigel लेपित व्यंजन या प्लेट का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
- मांसपेशियों और myofiber हेरफेर के लिए एक छोटे बोर विंदुक से निपटने के लिए एक बड़ी बोर विंदुक: एक फाइबर अलगाव (2 EDL) के लिए, दो बाँझ पाश्चर pipettes तैयार. एक हीरे की कलम का उपयोग करने के लिए इच्छित लंबाई और गर्मी विंदुक किनारों चिकनी पॉलिश प्रत्येक गिलास विंदुक कटौती. लौ का उपयोग करके वक्र छोटे बोर विंदुक टिप. यह एकल फाइबर से निपटने में मदद मिलेगी. बाँझ बनाना लौ. कोट एच एस के साथ प्रयोग करने से पहले प्रत्येक विंदुक.
2. स्नायु विच्छेदन और पाचन
- (Rosa26TdTomato, इन प्रयोगों के उद्देश्य के लिए, 8 सप्ताह पुरानी SV129, Pax7 CreER CklrPax7Cre - TdTomato) और Myf5-Cre Rosa26YFP इस्तेमाल किया गया.
- 70% इथेनॉल के साथ हिंद अंग स्प्रे. एक समर्थन बोर्ड जानवर (चेहरा) पिन हिंद अंग की प्रक्रिया के दौरान एक बेहतर समझ है.
- कैंची की मदद से, अंग की पूरी लंबाई के माध्यम से कटौती और अंतर्निहित मांसपेशियों बेनकाब. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किसी भी बाल या फर (चित्रा 1 ए) त्वचा निकालें.
- एक ठीक कैंची से काटना के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों को नुकसान पहुँचाए बिना पतली प्रावरणी के माध्यम से कटौती. नेत्रहीन edl के स्थानीय बनाना. Edl का Tibialis पूर्वकाल मांसपेशी (टीए) बस के नीचे पिछले अंग के पूर्वकाल डिब्बे में पाया जाता है.
- दो संदंश की मदद के साथ, डिस्टल tendons बेनकाब.
- तेज Cohann Vannas वसंत कैंची के साथ बाहर tendons (टीए और EDL दोनों) कट.
- साथ संदंश की मदद और उनके tendons द्वारा दोनों टीए EDL मांसपेशियों पकड़ और नाजुक मांसपेशियों समीपस्थ अंत की ओर खींच. इस बिंदु पर आप स्पष्ट रूप से देखने के लिए सक्षम होना चाहिएसिर्फ टीए मांसपेशी नीचे EDL मांसपेशियों. अब, टीए मांसपेशी से विपरीत दिशाओं (चित्रा 1 बी) में दो tendons खींच कर edl का अलग. जबकि इस आपरेशन प्रदर्शन के रूप में इस myofibers नुकसान होगा EDL मांसपेशी खींच से बचें.
- EDL कण्डरा बेनकाब. बेहतर समीपस्थ कण्डरा कल्पना यह इस बात पर टीए मांसपेशी को हटाने में मदद कर सकते हैं. यह भी बंद (चित्रा 1C) घुटने के आसपास कुछ संयोजी ऊतक में कटौती करने में मदद कर सकते हैं.
- समीपस्थ कण्डरा कट और धीरे EDL (चित्रा 1D) को हटाने.
- अपने tendons के माध्यम से पेशी धारण करके, यह पहले से तैयार कोलैजिनेज समाधान के 2 मिलीलीटर हस्तांतरण. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नोट: सफल फाइबर अलगाव के लिए, यह महत्वपूर्ण है कण्डरा से कण्डरा edl का इतना को अलग कि myofiber अखंडता को बनाए रखा है. 2.3-2.9 कदम एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, magn का उपयोगकांच ifying भी मदद मिल सकती है मांसपेशियों की एक अच्छा विचार है. - चरणों का २.३ 2.9 से 2 edl का अलग दोहराएँ. एक ही ट्यूब में 2 edl का स्थानांतरण. असमान पाचन से बचने के लिए, 2 edl के अलगाव के बाद पहली बार अधिक से अधिक 5 मिनट के पूरा किया जाना चाहिए.
नोट 1: ऊष्मायन समय कोलैजिनेज गतिविधि के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. लंबे समय तक या कम ऊष्मायन आकार, उम्र, और / या मांसपेशी हालत (fibrotic मांसपेशियों जैसे अब पाचन समय की जरूरत है) पर निर्भर करता है की आवश्यकता हो सकती है.
नोट 2: यदि निष्क्रियता की शर्तों के तहत उपग्रह कोशिकाओं के व्यवहार की जांच, मांसपेशी पाचन समय के दौरान आंदोलन उपग्रह कोशिकाओं 10 को सक्रिय कर सकते हैं. - पाचन समय के दौरान नियमित रूप से मांसपेशी की जांच करने के लिए अधिक पाचन से बचने. पाचन बंद करो जब मांसपेशियों को ढीला शुरू और myofibers दिखाई दे रहे हैं. पाचन बंद करो, ध्यान DMEM के 4 मिलीलीटर (dissociati साथ एक prewarmed पेट्री डिश दोनों मांसपेशियों हस्तांतरणपकवान पर). बड़े बोर आकार विंदुक का उपयोग करने के लिए यह कार्रवाई करने के लिए.
नोट: अति अनुबंधित myofibers के अलगाव में इस परिणाम के रूप में अनिवार्य रूप से मांसपेशी overdigestion से बचने.
3. एकल myofiber पृथक्करण और संस्कृति
- Myofibers जारी है, बड़े बोर कांच विंदुक का उपयोग करने के लिए गर्म माध्यम से मांसपेशियों फ्लश जब तक फाइबर स्वाभाविक रूप से जारी किया जा रहा है शुरू. महीन चुर्ण बनाना के रूप में यह अनिवार्य रूप से हानिकारक फाइबर में परिणाम होगा नहीं मांसपेशियों. यह और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित कदम प्रदर्शन.
- Myofibers को रिहा जारी रखें जब तक वांछित संख्या तक पहुँच जाता है. यदि पकवान कमरे के तापमान पर 10 मिनट से अधिक के लिए आवश्यक है एक 5 (न्यूनतम) 37 मिनट ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 मध्यम पुनः संतुलन में लाना अनुमति देते हैं.
नोट: अगर मध्यम एक विस्तारित समय के लिए शारीरिक नीचे तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) तक पहुँचता है myofibers मर जाएगा. - छोटे आकार का उपयोग करते हुए बोर विंदुक, transfer एक नया prewarmed पकवान (लगातार तीन washes के पहले) एकल myofibers रहते हैं. Myofibers के थोक सभी को एक बार में स्थानांतरित करने की बजाय प्रत्येक व्यक्तिगत myofiber संभाल. यदि आवश्यक हो, 37 पर सेते ° सी, 5% सीओ 2 10-15 मिनट के लिए मध्यम पुनः संतुलन में लाना.
- 2 बार के लिए 3.3 चरण दोहराएँ या जब तक सभी मृत myofibers और मलबे को हटा रहे हैं. हम उचित सफाई के लिए कम से कम तीन लगातार washes की सलाह देते हैं.
नोट: मृत myofibers के रूप में कम और हाइपर प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अनुबंध दिखाई देगा. - 37 में एकल myofibers सेते डिग्री सेल्सियस, पिछले धोने पकवान (DMEM केवल) में 5% संस्कृति के माध्यम में परिवर्तित करने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए सीओ 2. यह myofibers सीरम के अभाव में इन विट्रो परिस्थितियों में समायोजित करने के लिए अनुमति देता है. हम सीरम अमीर मध्यम फाइबर सिकुड़ते बढ़ जाती है में myofibers का है कि तत्काल संस्कृति पाया.
- एक घंटा के बाद, एक नया prewarmed पकवान या उपयुक्त संस्कृति प्रारूप को myofibers हस्तांतरणबहाव के आवेदन पर निर्भर करता है. संस्कृति उच्च सीरम मध्यम में फाइबर उपग्रह सेल सक्रियण की अनुमति देने के लिए. वैकल्पिक रूप से, सीरम या चिकन भ्रूण निकालने के विभिन्न सांद्रता भी इस्तेमाल किया जा सकता है. मध्यम हर दूसरे दिन बदलें.
4. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग
- Immunostaining. लाइव myofibers और तय किया जा सकता है दाग अलगाव के दौरान किसी भी समय बिंदु पर. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दोनों अस्थायी और सब्सट्रेट संलग्न myofibers पर प्रदर्शन किया जा सकता है. यदि अस्थायी myofibers धुंधला हो जाना, एक छोटे बोर कांच विंदुक का उपयोग करने के लिए एक समाधान से myofibers दूसरे को हस्तांतरण. वैकल्पिक रूप से, यह संभव है कि सभी प्रक्रिया के दौरान एक ही अच्छी तरह से में myofibers और रखने के जोड़ने / एक गिलास विंदुक का उपयोग समाधान निकालने. मानक आकांक्षा से बचने के रूप में इस myofibers के रूप में अच्छी तरह से हटाने में परिणाम देगा. संक्षेप में, पूरी तरह से संस्कृति के माध्यम हटाने के लिए, 5 मिनट के लिए prewarmed 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय myofibers. बड़े पैमाने पर पीबीएस में कई बार धो लो. IncubaPBS या अन्य मानक शमन समाधान में 1% ग्लाइसिन में ते myofibers पीएफए पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना कम करने के लिए. यदि आवश्यक हो, 0.1% ट्राइटन पीबीएस में 10 मिनट के लिए एक 5 मिनट पीबीएस में धोने के द्वारा पीछा X-100 के साथ myofibers permeabilize कमरे के तापमान पर 1 घंटा या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अधिमानतः के लिए अवरुद्ध समाधान में फाइबर (10% घोड़े सीरम, 0.1% ट्राइटन X-100, 1% NaN) सेते वैकल्पिक अवरुद्ध समाधान ब्याज की एंटीबॉडी के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. पीबीएस में एक बार 5 मिनट के लिए धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे या रात भर के लिए उचित प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते फाइबर पीबीएस में धोने के प्रति 5 मिनट से कम 3 बार धोने के लिए किसी भी अबाध एंटीबॉडी हटाने. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 मिनट से 45 घंटे के लिए सेते हैं. पीबीएस में धोने के प्रति 5 मिनट पर 3 बार धोएं. 1 मिलीग्राम / एमएल DAPI साथ नाभिक Counterstain. यदि अस्थायी फाइबर धुंधला, माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त एक गिलास स्लाइड पर प्रत्येक फाइबर हस्तांतरण. पीबीएस या मध्यम के किसी भी अधिक निकालें. दवा बढ़ते लागूउम और फिर जोड़ने के coverslip. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे myofibers कल्पना करने के लिए आगे बढ़ें. EDL myofibers पर प्रतिनिधि immunofluorescence के लिए चित्रा 4 देखें. वैकल्पिक धुंधला हो मजबूत fixatives प्रक्रियाओं का उपयोग वर्मा, एम. एट अल 11 और Wosniak, एसी एट अल. 12 में वर्णित हैं.
- Oligonucleotide या प्लाज्मिड क्षणिक अभिकर्मक. लाइव myofibers विशिष्ट जीन / एस के लिए ब्याज की प्लाज्मिड या siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. जब siRNA का प्रयोग हो रहा है, डबल अभिकर्मक कुशल जीन पछाड़ना के लिए सिफारिश की है. हम अलगाव से 8 घंटे के बाद 1 अभिकर्मक प्रदर्शन का सुझाव देते हैं. अभिकर्मक के बाद छह घंटा, ताजा माध्यम के साथ की जगह. SiRNA अभिकर्मक के लिए, हम 50 एनएम के अंतिम एकाग्रता का उपयोग करके शुरू की सलाह देते हैं. जीन अभिव्यक्ति पछाड़ना शाही सेना निष्कर्षण या अधिमानतः immunostaining द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
- वायरल संक्रमण. जीना myofibers के संक्रमण संभव है, हालांकि सेल की घटनाओंमौत oligo अभिकर्मक और संक्रमण की दक्षता के साथ की तुलना में अधिक है मांसपेशियों में शर्तों और उम्र पर निर्भर करता है चर हो सकता है. उदाहरण के लिए, अक्षुण्ण वयस्क मांसपेशियों myofibers विशेष रूप से कर रहे हैं गैर वायरल जो संक्रमण 13, 14 के मेजबान के खिलाफ एक सुरक्षात्मक बाधा प्रदान करते दिखाया गया बेसल लामिना की उपस्थिति के कारण संक्रमण के लिए उत्तरदायी है. Lentiviral वैक्टर रेट्रोवायरल वैक्टर से अधिक पसंद कर रहे हैं क्योंकि वे (गैर mitotic) मौन कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं. वायरल संक्रमण के लिए, यह एक Matrigel लेपित पकवान या थाली और myofibers पहले 24 घंटे के लिए मीडिया शर्तों के समायोजित पर संस्कृति तंतुओं को सलाह दी जाती है.
- इमेजिंग जीते. लाइव myofibers का इमेजिंग विशेष रूप से समय लगता है और एक एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 कक्ष के साथ सुसज्जित खुर्दबीन जरूरी है. यह उपयोगी है जब एकल उपग्रह कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन. इस तकनीक का उपयोग किया काम उपग्रह सेल विविधता खोज के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और उनके beha अध्ययनफाइबर पर vior (15 और 16).
Representative Results
यहाँ हम वयस्क चूहों के EDL पेशी से एकल myofibers के अलगाव का वर्णन किया. सफल myofibers कोलैजिनेज गतिविधि या मांसपेशियों की स्थिति या उम्र के रूप में कई कारकों पर निर्भर उपज. सबसे महत्वपूर्ण बात है, मांसपेशियों की कण्डरा से EDL पेशी से लंबे बरकरार myofibers में पट्टा परिणाम अलगाव चित्रा 1. कदम की चित्रमय अलगाव "पट्टा पट्टा" प्रतिनिधित्व द्वारा एक कदम से पता चलता है. एक बार मांसपेशी पूरी तरह से पच जाता है, myofibers पेशी के लिए कोमल दबाव आवेदन जारी कर रहे हैं चित्रा 2A पहली धोने के बाद एक myofiber अलगाव प्रयोग के एक प्रतिनिधि तस्वीर से पता चलता है. इस बिंदु पर एक myofibers जो लंबी और चमक ट्यूबलर संरचना के रूप में दिखाई देते हैं के बंडलों की संस्कृति का मिश्रण होता है, हाइपर myofibers जो अंधेरे और छोटी और पाचन प्रक्रिया से मलबे अनुबंध. कम से कम तीन लगातार washes के अंत तक, केवल एक लाइव myofibers di में रहना चाहिएसंस्कृति या बहाव के विश्लेषण के लिए श (चित्रा 2B). चित्रा 2C एक लंबे, जी फाइबर के रूप में एक अति अनुबंधित फाइबर (सी ') की तुलना से पता चलता है. अलगाव के समय उपग्रह कोशिकाओं myofiber सतह (चित्रा 3A) पर छोटे protuberances के रूप में दिखाई देते हैं. यदि सीरम अमीर मध्यम में बनाए रखा है, उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय करने, पैदा करना, विस्थापित और अंततः myotubes (बी) में फ्यूज. संस्कृति में 15 दिनों के बाद, सभी myotubes Myf5 रिपोर्टर (सी) YFP व्यक्त सुझाव है कि मांसपेशी पुनर्जनन में वयस्क कोशिकाओं के द्वारा किया जाता है कि उनके विकास के दौरान कुछ बिंदु पर myogenic निर्धारक कारक Myf5 व्यक्त की थी. सभी उपग्रह कोशिकाओं बनती बॉक्स प्रतिलेखन कारक 17 Pax7 व्यक्त करते हैं. संवाददाता माउस लाइन Pax7Cre TdTomato फ्लोरोसेंट संकेत TdTomato आंकड़े (3 डी और ई) की अभिव्यक्ति के माध्यम से उपग्रह कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चित्रा 4 से पता चलता है एक प्रतिनिधि immuडबल Pax7 + / Myod उपग्रह कोशिकाओं के nofluorescence. Classically डबल Pax7 + / Myod + उपग्रह कोशिकाओं proliferative प्रतिबद्ध मांसपेशी पूर्वज माना जाता है जो या तो नीचे Pax7 को विनियमित करने, जबकि नीचे Myod को विनियमित करने और बनाए रखने Pax7 अभिव्यक्ति 18 Myod अभिव्यक्ति या निष्क्रियता के लिए लौटने को बनाए रखने के द्वारा भेदभाव कार्यक्रम पूरा हो जाएगा
चित्रा 1. माउस hindlimb से EDL मांसपेशी अलगाव. एक 8 सप्ताह पुरानी वयस्क माउस के एक Hindlimb. तीर (घुटने) बाहर का पट्टा और समीपस्थ पट्टा (पैर) इंगित करता है बी. की शारीरिक स्थिति Tibialis पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी और extensor Digitorum (EDL) longus मांसपेशी सी.. समीपस्थ कण्डरा के माध्यम से edl का धारण करके, मांसपेशियों घुटने की ओर खींच लिया है को बाहर का पट्टा बेनकाब. बाहर का पट्टाकटौती और edl जारी की है.
चित्रा 2. एक एकल myofiber अलगाव प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम. पहले धो कदम पर एक myofiber अलगाव प्रयोग के उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीर. लाल तीर लाइव myofibers इंगित करता है, सफेद तीर अति अनुबंधित myofibers इंगित करता है और पीले तीर कोशिकाओं myofiber, या ईसीएम मलबे इंगित करता है बी. DMEM में लगातार washes के बाद ही रहते myofibers रहते हैं. सी और 'सी. छवि एक लंबे बरकरार रहते हैं myofiber (सी) का प्रतिनिधित्व करता है और एक छोटी अति myofiber (सी) के लिए अनुबंधित किया है. बार 10 सुक्ष्ममापी. तस्वीर एक Zeiss Axio ऑब्जर्वर Z1 AxioCam मानव संसाधन के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ ले जाया गया.
Figur 3 ए. एक एकल myofiber संस्कृति प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम. एक एकल, उसके अलगाव के बाद सही संबद्ध उपग्रह सेल (तीर) बी (0 समय). के साथ जीना myofiber के उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीर. एकल myofibers Matrigel पर चढ़ाया गया था और 15 दिनों के लिए सीरम अमीर मध्यम में सुसंस्कृत. व्हाइट तीर विभेदित myotubes के रूप में एकल (पीले तीर) कोशिकाओं सी की तुलना में इंगित करता है. एक Myf5Cre से एकल myofibers, RosaYFP माउस बी में सुसंस्कृत थे. एरो Myf5 व्युत्पन्न myotubes इंगित करता है डी और ई. Pax7Cre से एकल myofibers, TdTomato अलग किया गया और सही होने के बाद तय की. तीर Pax7 सकारात्मक मौन उपग्रह सेल (ई, लाल) से संकेत मिलता है. नाभिक DAPI (डी) के साथ counterstained थे. बार: 50 सुक्ष्ममापी. तस्वीर एक Zeiss Axio ऑब्जर्वर Z1 AxioCam मानव संसाधन के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ ले जाया गया.
चित्रा 4. Myofibers पर उपग्रह कोशिकाओं के immunofluorescence धुंधला हो का उदाहरण एकल myofibers. अलग किया गया और अस्थायी परिस्थितियों में 72 घंटे के लिए सभ्य. Myofibers पर सैटेलाइट कोशिकाओं उपग्रह सेल विशिष्ट मार्कर (बी, लाल) Pax7 और myogenic विनियामक कारक (सी, हरे) Myod के लिए दाग थे. नाभिक DAPI (A) के साथ counterstained थे. सलाखों: 50 सुक्ष्ममापी. तस्वीर एक Zeiss Axio ऑब्जर्वर Z1 AxioCam मानव संसाधन के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ ले जाया गया.
| मांसपेशी विच्छेदन (5 मिनट प्रत्येक मांसपेशी) |
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| मांसपेशी पाचन (30-45 मिनट) |
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| फाइबर अलगाव |
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| फाइबर संस्कृति (3-4 सप्ताह के लिए) |
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तालिका 1. Myofiber अलगाव प्रोटोकॉल का अवलोकन. Myofiber अलगाव प्रोटोकॉल 4 प्रमुख कदम के होते हैं. हर कदम के लिए अनुमानित समय और प्रमुख महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार विमर्श कर रहे हैं. हर कदम की विस्तृत चर्चा के लिए, प्रोटोकॉल पाठ देखें.
Discussion
अलगाव और बरकरार मांसपेशियों से एक myofibers के संस्कृति इन विट्रो मॉडल पेशी पुनर्जनन की प्रक्रिया का अध्ययन करने में एक उत्कृष्ट प्रदान करता है. इस प्रणाली की एक अनूठी विशेषता बेसल लामिना के नीचे उनकी शारीरिक वातावरण में उपग्रह कोशिकाओं के संरक्षण है. सबसे महत्वपूर्ण बात, तकनीक दोनों निष्क्रियता और सक्रिय राज्यों में मांसपेशी स्टेम सेल के व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिछले 20 वर्षों में, myofiber संस्कृति प्रणाली दोनों आंतरिक और बाह्य निर्धारकों के लिए सम्मान के साथ उपग्रह सेल आबादी के जीव विज्ञान में सार्थक अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है. संवर्धन व्यक्तिगत myofibers है myofiber, मांसपेशी प्रकार या पुनर्योजी संभावित संबंध के साथ उपग्रह सेल विजातिता 15 संबोधित किया गया है. विस्तृत एकल सुसंस्कृत उपग्रह सेल प्रवास 16 पैटर्न पर प्राप्त जानकारी के लिए अनुमति फाइबर का जीना इमेजिंग का उपयोग पढ़ाई. मात्रात्मक डेटा के अधिग्रहण के एकसंभव lso. हालांकि समय लेने वाली है, यह और विशिष्ट घटनाओं (स्टेम सेल असममित प्रभाग, प्रसार, और भेदभाव अनुपात, आदि) के वितरण घटना पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है. पहले से वर्णित अनुप्रयोगों के साथ मिलकर, प्रोटीन या एकल फाइबर से शाही सेना निष्कर्षण भी संभव है, हालांकि FACS या अन्य तरीकों से उपग्रह कोशिकाओं के शुद्ध आबादी के अलगाव एक आण्विक स्तर पर प्रोटीन या जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों की जांच के लिए एक बेहतर मंच प्रदान कर सकता है. हमारे अनुभव में, सफल फाइबर अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम अलगाव (प्रोटोकॉल पाठ में 2.5 से 2.9 कदम) "पट्टा करने के लिए पट्टा" है. यह कि मांसपेशियों के पाचन के बाद, फाइबर edl से कम या कोई नुकसान इस प्रकार निम्न चरणों में उनके प्रदर्शन को बढ़ाने के साथ जारी कर रहे हैं की गारंटी देता है.
Disclosures
कोई प्रतिस्पर्धा के हितों.
Acknowledgments
हम महत्वपूर्ण पढ़ने और टिप्पणियों को उपलब्ध कराने के लिए सारा डिक धन्यवाद देना चाहूंगा. Mar आण्विक आनुवंशिकी में कनाडा अनुसंधान चेयर रखती है और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के एक अंतरराष्ट्रीय रिसर्च स्कॉलर है. यह काम मार्च को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा, पेशी Dystrophy एसोसिएशन और कनाडा अनुसंधान चेयर कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
| DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
| Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
| Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
| Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
| Equipment | |||
| Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
| Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
| 60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
| Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view | |
References
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
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