Summary
Myofibers izolasyonu ve kültürü altın standarttır
Abstract
Erişkin kas rejenerasyon uydu hücreler denir ikamet kök hücreleri tarafından yapılır. Uydu hücreler bazal lamina ve her bir myofiber bir sarcolemma arasındaki konum ile tanımlanır. Onların davranışları Güncel bilgi yoğun tek myofiber izolasyon protokolü kullanımına dayanır. 1985 yılında, Bischoff myofiber ve kök hücreleri arasındaki fiziksel ilişki 1 korunduğu vitro sistemde oluşturmak amacı ile erişkin sıçanların Fleksör digitorum Brevis (FDB) gelen tek canlı lifleri ayırmak için bir protokol nitelendirdi. 1995 yılında Bischoff protokol şekilde myofibers tek başına aldı ve yerine yerçekimi sedimentasyon 2, 3 ile izole olma kollajenaz sindirim sonra ayrı ayrı ele alınmıştır Rosenblattmodified. Rosenblatt veya Bischoff protokolü yana farklı kasları, yaş veya koşulları 3-6 adapte edilmiştir. Tek myofiber izolasyon tekniği vazgeçilmez olduğunukendine has avantajları nedeniyle aracı. İlk olarak, tek bir myofiber protokol, uydu hücreler bazal laminanın altında muhafaza edilir. Böyle Floresans Aktif Hücre Ayırma gibi diğer tekniklerin kimyasal ve mekanik doku disosiyasyon 7 ihtiyaç olarak bu protokol benzersiz bir özelliktir. Myofiber kültür sisteminin in vivo çalışmalar için yerini alamaz rağmen kas kök hücrelerinin ilgili biyolojik özellikleri ele mükemmel bir platform sunuyor. Tek myofibers kaplama standart koşullar altında ya da yüzer koşullar altında kültüre edilebilir. Yüzer myofibers uydu hücreleri myofiber ortam dışında hemen hemen hiçbir etkisi tabi tutulur. Yüzey sertliği ve kaplama kasları 8, 9 yeniden uydu hücreler 'yeteneğini etkilediği gösterilmiştir yüzden bu faktörlerin her birinin kontrol edememek bağımsız veriyor niş-bağımlı ve bağımsız yanıtları arasındaki ayrım. Serum Farklı konsantrasyonlardaAyrıca sakinleştikten gelen aktivasyon geçiş üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Ilişkili uydu hücrelerin sükunet durumunu korumak için, lifler 1-3 düşük serum ortamda tutulmalıdır. Sakinleştikten devletin ilgili genler okuyan bu özellikle yararlıdır. Serum zengin bir ortam, uydu hücreler hızla etkinleştirmek, böylece 1-3 vivo rejeneratif süreç içinde taklit, göç ve farklılığı, çoğalırlar. Virüs teslimat gen ektopik ifade;; oligonükleotid temelli gen knock-down veya canlı görüntüleme sistemi, kimyasal inhibitör testi gibi testler çeşitli gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu video makale şu anda erişkin farelerde (6-8 haftalık) ve ekstansör digitorum longus (EDL) kas tek myofibers yalıtmak için laboratuarda kullanılan protokol açıklar.
Protocol
Tüm deneyler hayvan bakımı ve kullanımı için Ottawa düzenlemeler Üniversitesi'ne göre ele alınmıştır.
Protokol genel bir bakış için Tablo 1'e bakınız.
1. İzolasyon Başlamadan Önce
- Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
% 0.2 collagenase tip DMEM I (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı, 110 mg / ml sodyum piruvat, yüksek glikoz, L-glutamin). İki EDL kasları DMEM% 0.2 Collagenease 2 ml hazırlamak için. 0.22 um filtre içinden çözelti filtre. 37 prewarm izole edilmesinden önce 10 dk ° C su banyosu içinde. Seyreltilmemiş kollajenaz ilave alikotları daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C de donduruldu edilebilir.
Not: prosedürünün tüm boyunca sodyum piruvat ile DMEM kullanın. Elyaf sodyum pirüvat içermeyen ortamda hayatta yoktur.- Yıkama medya (tüm yıkar gerçekleştirmek için kullanın). % 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. 0 süzülürKullanımdan önce 22'lik um bir filtreden.
- Myofiber kültür ortamı. % 20 FCS,% 1 tavuk embriyo özü ve% 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. Kullanmadan önce filtre 0.22 mikron süzülür.
- Kaplamalı yemekleri Matrigel. Uzun süre için kültür elyaf için, kaplama substrat olarak Matrigel kullanmanızı öneririz. Matrigel kaplı yemekleri hazırlamak için, 4 ° C gecede Matrigel bir kısım Çözülme. Gün sonra, DMEM Matrigel 01:10 sulandırmak. Her zaman 4 ° C Matrigel tutun ve bu düzensiz kaplama sonuçlanan Matrigel çözüm içindeki mikroskobik kristalleri oluşturmak gibi ani sıcaklık değişikliklerinden kaçının. Yer bulaşık buz üzerine kaplanmıştır gerekir. Yüzey kaplamak için yeterli hacmi ile kaplayın yemekler. Bunun 1 dakika bekletin. Tamamen artık Matrigel çıkarın. Kullanımdan önce ya da gece boyunca en azından 3 saat için 37 ° C 'de bulaşık kuruması beklenir.
Not: 4 & de saklandığında seyreltilmiş Matrigel hacimde kaplama amacıyla birden çok kez tekrar kullanılabilirg; C. - Son olarak,% 70 etanol ile mikroskop istasyonu ve diseksiyon araçları temizlemek için emin olun.
- : İki EDL izolasyonların (bir fare) aşağıdaki gibi beş plastik petri (60 * 15mm) hazırlamak için
- Izolasyonu için dört yemekleri (kas disosiyasyon için 1, seri yıkama için 3). Tüm yemekler plastik takılarak gelen myofibers önlemek için at serumu (HS) ile kaplanmış olmalıdır. Ceket için, her yemeğin, girdap içine at serumu olarak pipetle 3 ml hatta kaplama sağlamak için, at serumu çıkarmak ve en az 30 dakika süreyle çanak kurumaya bırakın. Her çanak DMEM 4 ml ekleyin. Kullanımdan önce bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de bulaşık tutun.
Not: Steril devam edersem At serumu, birden çok kez yeniden kullanılabilir. Alternatif olarak, DMEM içinde% 10 HS içindeki bir çözeltisine kat bulaşık için kullanılabilir. Bütün protokol boyunca HS kaplı yemekleri kullanın ve yüzen koşullar olduğunda kültür myofibers.- Bir yemeğin izolasyon sonra kültür myofibers için kullanılır. Alternative çanak boyutları veya biçimleri alt-uygulamalara bağlı olarak myofibers nihai kültür için de kullanılabilir. Ancak, biz 60 * 15mm daha büyük çanak boyutları önermiyoruz. Hiper daralma meydana gelmeden önce Myofibers artık fazla 96 saat süreyle askıya saklanabilir. Uzun kültürü zamanlar için, biz Matrigel kaplı yemekleri veya plakaları kullanmanızı öneririz.
- Myofiber manipülasyon kas işleme ve bir küçük kalibreli pipet için büyük bir delik pipet: bir fiber izolasyon (2 EDL) için, iki steril Pasteur pipetler hazırlamak. İstenilen boy ve pipet kenarları düzeltmek için ısı cilası her cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın. Alev kullanılarak, dar çaplı bir pipet eğri ucu. Bu tek elyaf işleme yardımcı olacaktır. Sterilize etmek Alev. Kullanmadan önce HS ile kaplayın Her pipet.
2. Muscle Diseksiyon ve Sindirim
- Rosa26TdTomato (; Bu deneylerin amacı, 8 haftalık SV129, Pax7 CreER Cklr içinPax7Cre-TdTomato) ve Myf5-Cre; Rosa26YFP kullanılmıştır.
- % 70 etanol ile arka bacaklarda püskürtün. İşlem sırasında arka bacak daha iyi kavramak için bir destek kuruluna hayvan (yüz yukarı) Pin.
- Makas yardımı ile, bacak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş ve altta yatan kas maruz kalmaktadır. Cildin yanı sıra herhangi bir saç veya kürk (Şekil 1A) sökün.
- Ince bir makas ile, altta yatan kasları zarar vermeden ince fasya kesti. Görme EDL yerelleştirilmesine. EDS, sadece tibialis anterior (TA) kas altında arka bacak ön bölme bulunmaktadır.
- Iki forseps yardımıyla, distal tendon maruz.
- Keskin Cohann-Vannas yay makas ile distal tendon (TA ve EDL hem) kesin.
- Forseps yardımıyla kendi tendon TA ve EDL kasları hem tutun ve ince proksimal sonuna doğru kasları yukarı çekin. Bu noktada açıkça görmek mümkün olmalıdırsadece TA kas altında EDL kasının. Şimdi, zıt yönlerde (Şekil 1B) iki tendon çekerek TA kas EDS ayırır. Bu myofibers zarar verecektir Bu işlem gerçekleştirilirken EDL kas germe kaçının.
- EDS tendonu Açığa. Daha proksimal tendon görselleştirmek için bu ta kas kaldırmak için bu noktada yardımcı olabilir. Ayrıca diz çevresindeki bazı bağ dokusu (Şekil 1C) kesmek için yardımcı olabilir.
- Proksimal tendon kesin ve hafifçe EDL (Şekil 1D) çıkarın.
- Onun tendonlar aracılığıyla kas tutarak, önceden hazırlanmış kollajenaz çözüm 2 ml aktarın. Bir su banyosunda 37 ° C'de inkübe edin.
Not: başarılı bir şekilde elyaf izolasyon için, bu myofiber bütünlüğünün korunmasını sağlar, böylece tendondan tendona EDS izole etmek için önemlidir. 2,3-2,9 adımları diseksiyon mikroskop altında yapılabilir. Alternatif olarak, bir MAGN kullanımıcam ifying da kasların daha iyi bir görünüm için yardımcı olabilir. - İkinci EDL yalıtmak için 2,3-2,9 adımları tekrarlayın. Aynı tüp içinde ikinci EDS aktarın. Düzensiz sindirim önlemek için, ikinci EDL izolasyonu ilk sonra en fazla 5 dk tamamlanması gerekmektedir.
Not 1: İnkübasyon süresi kollajenaz aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Uzun veya kısa inkübasyon büyüklüğü, yaş ve / veya kas durum (ör. fibrotik kasları uzun sindirim süresi gerekir) bağlı olarak gerekli olabilir.
Not 2: kas sindirim süresi boyunca, sakinleştikten koşullarda ajitasyon uydu hücrelerin davranışını inceleyen uydu hücreleri 10 aktive olabilir varsa. - Sindirim süresi boyunca, düzenli olarak aşırı sindirim önlemek için kas kontrol edin. Kasları gevşetmek başlar ve myofibers görünür olduğunda sindirimi durdurur. Sindirim durdurmak için, dikkatli DMEM 4 ml (dissociati ile önceden ısıtılmış Petri kabı hem kas transferiyemeğin üzerine). Bu işlemi gerçekleştirmek için büyük Çapla pipet kullanın.
Not: hiper sözleşmeli myofibers üzerindeki izolasyonun bu kaçınılmaz sonuç olarak kas overdigestion kaçının.
3. Tek Myofiber Ayrışma ve Kültür
- Myofibers serbest bırakmak için, lifler doğal serbest bırakılması başlayana kadar sıcak ortamı ile kas temizlemek için büyük kalibreli cam pipet kullanın. Bu kaçınılmaz zararlı lifler neden olacağı kas çiğnemek etmeyin. Bu ve bir diseksiyon mikroskobu altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- İstediğiniz numaraya ulaşana kadar myofibers bırakmadan devam edin. Çanak fazla 10 dakika süreyle oda sıcaklığında gerekiyorsa, 37, 5 dakika (en az) inkübasyon ° C,% 5 CO2 orta yeniden denge sağlaması için izin verir.
Not: orta uzun bir süre fizyolojik altındaki sıcaklıklarda (37 ° C) ulaşırsa myofibers ölecek. - Küçük kalibreli pipet, transfe kullanmar yeni bir önceden ısıtılmış yemek (üç ardışık yıkama ilk) tek myofibers yaşıyor. Yerine tümünü bir seferde myofibers toplu aktarımı tek tek her myofiber taşıyınız. Gerekirse, 37 ° C'de inkübe, orta yeniden dengelenmesi için 10-15 dakika için% 5 CO2.
- 2 kez daha için adım 3.3 tekrarlayın veya tüm ölü myofibers ve enkaz kaldırılıncaya kadar. Biz uygun temiz-up için en az üç ardışık yıkama önerilir.
Not: Kısa ve hiper mikroskop ışık altında sözleşmeli olarak ölü myofibers görünecektir. - 37 tek myofibers inkübe ° C, daha önce kültür ortamı için geçiş için en az bir saat boyunca geçen yıkama bulaşık (sadece DMEM) içinde% 5 CO2. Bu myofibers serum yokluğunda in vitro koşullarında ayarlamak için olanak sağlar. Serum zengin orta lif daralma arttırmaktadır myofibers bu acil kültürü bulundu.
- Bir saat sonra, yeni bir önceden ısıtılmış çanak ya da uygun bir kültür biçimine myofibers aktarmakdownstream uygulamaya bağlı. Yüksek serum ortamında kültive lifler uydu hücre aktivasyonuna izin vermektir. Alternatif olarak, serum ya da tavuk embriyo özü farklı konsantrasyonları da kullanılabilir. Her gün orta değiştirin.
4. Mansap Uygulamaları
- Immün. Canlı myofibers izolasyon sırasında herhangi bir zaman noktasında sabit ve lekeli olabilir. Immunofluorescence kayan alt tabaka ve ikisi de ekli myofibers üzerinde gerçekleştirilebilir. Kayan myofibers boyama, başka bir çözüm myofibers aktarmak için küçük bir delik cam pipet kullanın. Alternatif olarak, tüm işlem boyunca aynı kuyuda myofibers tutmak ve bir cam pipet kullanarak çözümler eklemek / çıkarmak mümkündür. Bu yanı myofibers çıkarılması neden olacak gibi standart aspirasyon kaçının. Kısaca, tamamen kültür ortamı çıkarın; 5 dakika önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltme myofibers. Yaygın PBS birkaç kez yıkayın. InkübasyonPBS veya diğer standart soğutma çözümleri% 1 glisin te myofibers PFA plan boyama en aza indirmek için. Eğer gerekirse,% 0,1 Triton PBS içinde 5 dakika yıkama ve ardından 10 dakika boyunca PBS içerisinde X-100. Myofibers geçirgen 1 saat oda sıcaklığında ya da tercihan bir gece boyunca 4 ° C'de için blokaj çözeltisi içinde elyaflar (% 10 at serumu,% 0.1 Triton X-100,% 1 NaN) inkübe Alternatif çözümler engelleme ilgili antikor bağlı olarak kullanılabilir. 5 dakika boyunca PBS içinde bir kere yıkayın. 4 ° C'de 1 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca bloke etme çözeltisi ile seyreltilir uygun birincil antikor ile inkübe Bağlanmamış antikor kaldırmak için PBS içinde yıkama başına 5 dk lifler 3 kere yıkayın. Oda sıcaklığında 45 dakika, 1 saat için uygun ikincil antikor ile inkübe edin. PBS içinde yıkama başına 5 dk az 3 kere yıkayın. 1 mg / ml DAPI ile çekirdekler Counterstain. Yüzen elyaf boyama varsa, mikroskopi için uygun bir cam slayt her lif transfer. PBS veya orta herhangi bir aşırı çıkarın. Medi montaj Uygulaum ve sonra lamel ekleyin. Bir floresan mikroskop altında myofibers görselleştirmek için devam edin. EDL myofibers üzerine temsili immünofloresan için Şekil 4'e bakın. Güçlü bir fiksatif kullanan alternatif boyama prosedürleri Verma, M. et al. 11 ve Wosniak, AC ve ark. 12'de tarif edilmektedir.
- Oligonükleotid ya da plazmid geçici transfeksiyon. Canlı myofibers özgü gen / ilgi s plazmid ya da siRNA ile transfekte edilebilir. SiRNA kullanırken, çift transfeksiyon verimli gen demonte için tavsiye edilir. Bu izolasyon itibaren 8 saat sonra, ilk transfeksiyon icra öneriyoruz. Transfeksiyon sonra altı saat, taze ortam ile değiştirin. SiRNA transfeksiyon için, 50 nM bir nihai konsantrasyon kullanılarak başlangıç göstermektedir. Gen ekspresyonu knockdown RNA ekstraksiyon veya tercihen immün analiz edilebilir.
- Viral enfeksiyon. Canlı myofibers enfeksiyonu mümkün olmakla beraber hücre sıklığıölüm oligo transfeksiyon ve enfeksiyon verim ile daha yüksek kas koşullar ve yaşa bağlı olarak değişken olabilir. Örneğin, sağlam bir yetişkin kas myofibers ana enfeksiyon, 13, 14 karşı koruyucu bir bariyer sağlamak için gösterilmiştir bazal laminanın varlığı nedeniyle viral enfeksiyon için, özellikle duyarlı olmayan vardır. Onlar hareketsiz (non mitotik) hücreleri enfekte edebilir çünkü lentiviral vektörler retroviral vektörler tercih edilir. Viral enfeksiyon için bir Matrigel kaplı çanak veya plaka ve myofibers ilk 24 saat için ortam koşullarına uyum izin kültürün lifleri tavsiye edilir.
- Görüntüleme Canlı. Myofibers görüntülenmesi, özellikle zaman alıcı ve bir 37 ° C,% 5 CO2 bölme ile donatılmış bir mikroskop gerektirmektedir canlı. Tek bir uydu hücrelerin davranışını değerlendirirken zaman yararlıdır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışma, uydu hücre heterojenitesini keşif için etkili olmuştur ve onların Beha çalışmalifleri üzerine vior (15 ve 16).
Representative Results
Burada yetişkin farelerin EDL kasının gelen tek myofibers arasında izolasyonu nitelendirdi. Başarılı myofibers gibi kollajenaz aktivitesi veya kas koşulları ya da yaş gibi birçok faktöre bağlıdır verim. En önemlisi, tendon gelen EDL kasının uzun, sağlam myofibers tendon sonuçlarına kas izolasyonu. Şekil 1 izolasyon "tendon tendon" adım grafiksel bir adım gösterir. Kası tamamen sindirilir sonra, myofibers kas hafif basınç uygulayarak serbest bırakılır. Şekil 2A ilk yıkamadan sonra myofiber yalıtım deneyi temsilcisi resmini gösterir. Bu noktada kültür uzun ve parlayan tübüler yapılar olarak görünürler tek myofibers demetleri bir karışımı içeren, hiper sindirim sürecinden karanlık ve kısa ve enkaz vardır myofibers daralmıştır. En az üç ardışık yıkama sonunda, sadece tek bir canlı myofibers di kalmalıdırKültür ya da alt analiz için sh (Şekil 2B). Şekil 2C, bir hiper daralan lif (C ') ile karşılaştırıldığında uzun, canlı bir lif göstermektedir. Izolasyon zamanda, uydu hücreler myofiber yüzeyi (Şekil 3A) üzerinde çok küçük çıkıntılar olarak görünür. Serum zengin ortamda muhafaza ederseniz, uydu hücreleri aktive çoğalırlar, göç ve sonunda myotubes (B) kaynaşmasına. Kültüründe 15 gün sonra tüm myotubes erişkin kas yenilenme gelişim sırasında bazı noktada miyojenik belirleyici Myf5 ifade ettiğini hücreleri tarafından yapılır düşündüren Myf5 muhabiri YFP (C) ifade eder. Tüm uydu hücreler eşleştirilmiş kutusu transkripsiyon faktörü Pax7 17 ifade. Raportör fare hat Pax7Cre-TdTomato TdTomato floresan sinyali (Şekil 3B ve E) 'nın ekspresyonu yoluyla uydu hücreleri izlemek için kullanılabilir. Şekil 4, bir temsilci İmmünoblotçift Pax7 + / myod uydu hücre nofluorescence. Klasik çift Pax7 + / myod + uydu hücreleri ya aşağı myod düzenleyen ve Pax7 ifadesi 18 sürdürerek myod ifade veya sakinleştikten dönüş koruyarak aşağı Pax7 düzenleyerek farklılaşma programını tamamlamak proliferatif ilişkide kas ataları olarak kabul edilir
Şekil 1. Fare bacak EDL kas izolasyonu. 8 haftalık erişkin fareden bir. Bacak. Oklar distal (diz) tendon ve proksimal (ayak) tendon gösterir. B. Tibialis anterior (TA) kas ve ekstansör digitorum longus (EDL) kas. C Anatomik pozisyonu. Proksimal tendon aracılığıyla EDL tutarak, kas distal tendon maruz diz doğru çekilir. D. Distal tendonkesilmiş ve EDL serbest bırakılır.
Şekil 2. Tek bir myofiber izolasyon deney Örnek sonuçları. İlk yıkama adımında bir myofiber yalıtım deneyi bir. Aydınlık alan resim. Kırmızı ok canlı myofibers gösterir, beyaz ok hiper sözleşmeli myofibers gösterir ve sarı ok hücreleri myofiber veya ECM enkaz gösterir. B. DMEM ardışık yıkamadan sonra, sadece canlı myofibers kalır. C ve C '. Görüntü uzun bir dokunulmamış canlı myofiber (C) temsil etmektedir ve bir kısa hiper myofiber (C ') küçülmüştür. Bar 10 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır.
Figür e 3. Tek bir myofiber kültür deney Örnek sonuçları. Sağ izolasyon sonrasında ilişkili uydu hücre (ok) (Zaman 0). B ile tek bir canlı myofiber A. Aydınlık alan resim. Tek myofibers Matrigel üzerine kaplama ve 15 gün boyunca serum zengin ortamda kültüre edildi. Beyaz ok tek hücreleri (sarı ok) C ile karşılaştırıldığında farklılık myotubes gösterir. Bir Myf5Cre gelen Tek myofibers; RosaYFP fare B olarak ekildi. Ok Myf5 türetilmiş myotubes gösterir. D ve E. Pax7Cre gelen Tek myofibers; TdTomato hemen sonra izole ve düzeltildi. Oklar Pax7 pozitif sakin uydu hücre (E, kırmızı) gösterir. Çekirdekler DAPI (D) ile zıt edildi. Bar: 50 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır.
Şekil 4'e. Myofibers uydu hücrelerin immünofloresan boyama örneği. Tek myofibers izole ve değişken koşullarda 72 saat boyunca kültüre edildi. Myofibers üzerindeki Uydu hücreleri uydu hücre spesifik bir işaretleyici Pax7 (B, kırmızı) ve miyojenik düzenleyici faktör myod (C, yeşil) için boyandı. Çekirdekler DAPI (A) ile zıt edildi. Barlar: 50 mikron. Resimleri AxioCam İK ile donatılmış bir Zeiss Axio Gözlemci Z1 mikroskobu ile alınmıştır.
| Muscle Diseksiyon (5 dk her kas) |
|
| Muscle Sindirim (30-45 dk) |
|
| Fiber izolasyon |
|
| Fiber Kültür (Yukarı 3-4 hafta) |
|
Tablo 1. Myofiber izolasyon protokolü genel bakış. Myofiber izolasyon protokolü 4 ana adımdan oluşuyor. Her adım için, yaklaşık zamanı ve önemli kritik noktalar tartışıldı. Her adımı ayrıntılı bir tartışma için, Protokol metni için bkz.
Discussion
Bozulmamış kaslardan tek myofibers ve izolasyonu ve kültürü kas rejenerasyon işlemi incelemek için bir in vitro model mükemmel içerir. Bu sistemin benzersiz bir özelliği bazal lamina altında fizyolojik ortamda uydu hücrelerin korunmasıdır. En önemlisi, teknik sükunet ve aktif devletler hem de kas kök hücre davranışlarını araştırmak için kullanılabilir. Son 20 yılda, myofiber kültür sistemi içsel ve dışsal belirleyicileri bakımından, uydu hücre popülasyonu biyolojisi kavrayış sağladı. Kültür bireysel myofibers tarafından, myofiber, kas türü veya rejeneratif potansiyeli açısından uydu hücre heterojenitesini 15 ele alınmıştır. Uydu hücre göçü desen 16 kazanıyor bilgiler için izin tek kültürlü liflerin canlı görüntüleme kullanarak iyileştirme çalışmaları. Nicel veri toplama birMümkün LSO. Zaman alıcı olsa da, belirli olaylar (kök hücreler asimetrik bölünme, proliferasyon ve farklılaşma oranı, vb) dağılımı ve oluşumu hakkında önemli bilgiler sağlar. FACS ya da başka yollarla uydu hücre nüfusunun saf izole bir moleküler seviyede protein ya da gen ekspresyonu değişiklikleri tespit ederek daha iyi bir platform bulunmasına karşın birlikte daha önce tarif uygulamalarda, elyaflar tek bir protein ya da RNA ekstraksiyonu, aynı zamanda mümkün olmaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, başarılı elyaf izolasyon için en kritik adımı izolasyonu (2,5 2,9 protokol metninde adımlar) "tendon tendon" dir. Bu kas sindirim sonra, lifler çok az veya hiç hasar dolayısıyla aşağıdaki adımları kendi performansı artan EDL serbest olduğunu garanti eder.
Disclosures
Hiçbir rakip çıkarlar.
Acknowledgments
Biz eleştirel okuma ve yorumlar sağlamak için Sarah Dick teşekkür etmek istiyorum. MAR Moleküler Genetik Kanada Araştırma Başkanı tutan ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Uluslararası Araştırmacı olduğunu. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri, Müsküler Distrofi Derneği ve Kanada Araştırma Başkanı Programı MAR bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
| DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
| Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
| Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
| Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
| Equipment | |||
| Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
| Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
| 60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
| Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view | |
References
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).
- White, R. B., Biérinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development. BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).
- Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging. Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).
- Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments. J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).
- Boonen, K. J., Post, M. J. The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration. Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).
- Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
- Verma, M., Asukura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).
- Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers. J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).
- Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers. J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).
- Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors. Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).
- Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e, Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. 3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility. Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal. J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).
